Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo
28 de setembro de 2018
Um protocolo para a elucidação da planta tilacoides proteína complexa organização e composição com poliacrilamida nativa azul gel eletroforese (BN-página) e 2D-SDS-PAGE é descrito. O protocolo é otimizado para a Arabidopsis thaliana, , mas pode ser usado para outras espécies de plantas com pequenas modificações.
Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a composição e organização dinâmica dos complexos proteicos fotossintéticos na membrana de tirokoóide vegetal. A principal vantagem dessa técnica é que permite a análise das interações funcionais entre complexos proteicos nativos e elucida a plasticidade da organização do complexo proteico em diferentes condições ambientais. Configure o rodízio de gel de oito centímetros por placas de 10 centímetros de acordo com as instruções do fabricante usando espaçadores de 0,75 milímetros.
Coloque uma batedeira de gradiente em uma placa de mexida e conecte-a com a bomba peristáltica por tubo. Coloque uma agulha de seringa na outra extremidade da tubulação e coloque a agulha entre o vidro e a placa de alumínio. Coloque um agitador magnético na câmara pesada.
Prepare soluções de centrífugo de 3,5% e 12,5% em tubos de centrífuga cônica de 15 mililitros, conforme detalhado no protocolo de texto a ser usado para o gradiente de gel de separação. Para evitar a polimerização prematura, mantenha os tubos de centrífugas no gelo enquanto prepara as soluções. Adicione 5%APS e TEMED logo antes de pippetar as soluções para o misturador de gradiente.
Pipetizar as soluções de 12,5% para a câmara pesada. Remova bolhas de ar do canal que conecta a câmara leve e pesada, abrindo a válvula que conecta as duas câmaras permitindo que a solução entre na câmara de luz. Feche a válvula e pipeta os traços da solução de volta para a câmara pesada.
Por fim, pipete a solução de 3,5% para a câmara de luz. Ligue o agitador magnético. Abra as válvulas e ligue a bomba peristáltica.
Permita que as soluções de gel fluam entre o vidro e a placa de alumínio a uma taxa de fluxo de aproximadamente 0,5 mililitros por minuto. A agulha deve estar acima do líquido o tempo todo. Quando as câmaras pesadas e leves esvaziarem-nas enchem-nas com água ultrapura.
E deixe a água sobrepor suavemente a superfície do gel. A polimerização do gel leva cerca de uma a duas horas em temperatura ambiente. Prepare a solução de acrilamida de 3% para o gel de empilhamento à temperatura ambiente.
Pipete o gel de empilhamento em cima do gel de separação polimerizada e coloque um pente de gel de amostra entre o vidro e a placa de alumínio evitando bolhas de ar. Depois de permitir que o gel polimerize por 30 a 60 minutos em temperatura ambiente, remova o pente suavemente sob água ultrauso. Neste ponto o gel pode ser armazenado a 4 graus Celsius positivos em condições úmidas por alguns dias.
Diluir timilóides isolados com tampão 25BTH20G frio para uma concentração final de clorofila de um miligrama por mililitro. Prepare dois tubos para cada amostra de tirokoide para realizar tanto beta-DM quanto solubilização de digitonina. Agora adicione um volume igual de tampão de detergente.
Misture o detergente e a tirola imola com uma pipeta e evite fazer bolhas de ar. Solubilize as tireilakoidas por dois minutos no gelo para a solubilização beta-DM. Ou 10 minutos em temperatura ambiente com mistura suave contínua em um roqueiro ou agitador para a solubilização digitonin.
Após a incubação, remova o material insolubilizado por centrifugação a 18.000 g durante 20 minutos a 4 graus positivos Celsius. Transfira o supernante para um novo tubo de 1,5 mililitro e adicione 1/10 de tampão azul brilhante Coomassie à amostra. Coloque o gel em um sistema de eletroforese vertical.
Encha a câmara tampão superior com tampão de cátodo azul e despeje o tampão de ânodo na câmara tampão inferior. Coloque as amostras de tirocoide nos poços. Inicie a eletroforese e aumente gradualmente a tensão conforme listado no protocolo de texto.
Execute o gel a 4 graus Celsius positivos usando uma sala fria ou ajustando a temperatura do gel com um sistema de resfriamento. Altere o tampão do cátodo azul para um tampão de cátodo claro quando a frente da amostra migrar cerca de 1/3 do gel. Após a execução eletroforética, escaneie o gel com um scanner fotográfico para arquivamento de imagens.
Para executar 2-SDS PAGE monte o sistema de eletroforese vertical usando espaçadores de um milímetro. Prepare um gel SDS padrão com um pente 2D descrito no protocolo de texto. Corte a pista do gel BN e coloque-a em um tubo de cinco mililitros.
Em seguida, adicione dois mililitros de tampão laemmli e incubar a tira por 45 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Coloque a pista com a ajuda de um espaçador em cima do gel evitando bolhas de ar. Pipeta cinco microliters de marcador de peso molecular em um pedaço estreito de papel filtro e colocar o papel no poço padrão.
Para selar a tira de gel BN e o papel marcador despeje uma 0,5% de agarose na execução do buffer em cima da tira de gel e permita que ela se solidifique. Realize eletroforese de acordo com os protocolos padrão. Após a corrida eletroforética visualize as proteínas com mancha de RUBI SUPRO ou coloração de prata.
Resultados representativos de padrões complexos de proteínas de tiroilakoide de beta-DM e amostras de digitonina-solubilizada são mostrados aqui. Os pequenos complexos migram mais rápido durante a corrida eletroforética e, portanto, estão na parte inferior do gel. Enquanto os grandes complexos estão na parte superior do gel.
A digitonina geralmente preserva complexos proteicos em conjuntos maiores, enquanto o DM beta interfere com interações proteína-proteína labile entre os complexos. A composição subunidade de complexos proteicos de beta-DM e thylakoids digitalonin-solubilizadas são apresentadas aqui. As subunidades de cada complexo são encontradas a partir da linha vertical abaixo do complexo alinhado.
Em princípio, cada ponto no gel 2D representa uma proteína individual. Mas, na prática, várias proteínas da mesma massa molecular podem estar presentes em um único ponto. A identificação das manchas baseia-se na análise de espectrometria de massa.
Após a aplicação deste procedimento pode-se continuar com outros métodos como microscopia eletrônica e análise de partículas únicas dos complexos proteicos eludidos do gel nativo azul, a fim de obter insights estruturais sobre os complexos proteicos. Para identificar subunidades proteicas desconhecidas, os pontos proteicos individuais do SDS PAGE bidimensional podem ser analisados com especificação de massa. Não se esqueça que trabalhar com acrilamida e digitonina pode ser extremamente prejudicial e precauções como o uso de luvas de proteção devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo para analisar a organização e a composição de complexos proteicos de tilacoides de plantas utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) e 2D-SDS-PAGE. Embora otimizado para Arabidopsis thaliana, o método pode ser adaptado para outras espécies de plantas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia vegetal
- Fotossíntese
- Análise de complexos proteicos
Antecedentes
- Compreender a composição dos complexos proteicos fotossintéticos é fundamental para a biologia vegetal.
- As membranas tilacoides desempenham um papel fundamental na fotossíntese.
- A organização dos complexos proteicos pode variar sob diferentes condições ambientais.
- A BN-PAGE permite a análise de complexos proteicos nativos.
Objetivo do Estudo
- Elucidar a organização e composição dos complexos proteicos tilacoidais.
- Investigar as interações funcionais entre complexos proteicos.
- Avaliar a plasticidade da organização dos complexos proteicos.
Métodos Utilizados
- Eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE)
- Eletroforese SDS-PAGE bidimensional (2D-SDS-PAGE)
- Configuração do misturador de gradientes para preparação de gel
- Uso de bomba peristáltica e agitador magnético para moldagem de gel
Resultados Principais
- O protocolo revela com sucesso a composição dos complexos proteicos de tilacoides.
- As interações funcionais entre complexos proteicos nativos podem ser analisadas.
- A organização dinâmica dos complexos proteicos pode ser avaliada sob diferentes condições.
- A adaptabilidade do método para diferentes espécies de plantas é confirmada.
Conclusões
- Este método fornece informações sobre a organização de complexos proteicos fotossintéticos.
- Ele aprimora a compreensão da adaptabilidade das proteínas vegetais às mudanças ambientais.
- O protocolo pode ser uma ferramenta valiosa para pesquisadores que estudam biologia vegetal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Compreender a composição e a organização dinâmica dos complexos proteicos fotossintéticos fornece subsídios mecanicistas sobre as vias de conversão de energia relevantes para o desenvolvimento de produtos baseados em biotecnologia. A eletroforese em gel nativo azul permite a análise de interações funcionais de montagens nativas de múltiplas proteínas, auxiliando na validação de alvos em sistemas fotossintéticos. Este método contribui para reduzir os riscos de hipóteses em estágios iniciais, esclarecendo a estabilidade dos complexos e suas interações sob diferentes condições ambientais.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao determinar a composição de complexos proteicos nativos e a organização de subunidades em membranas tilacoides.
- Valor Operacional: Permite a desconsideração de riscos biológicos mediante a visualização direta da plasticidade e estabilidade dos complexos sob condições controladas de solubilização.
- Valor Preditivo: Apoia a triagem de portfólios ao distinguir interações proteína-proteína estáveis de instáveis, utilizando detergentes digitonina e beta-DM.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão para ensaio: Prepara complexos de tilacoides solubilizados para análises downstream mediante separação padronizada por BN-PAGE com padrões de migração reprodutíveis.
- Saída quantitativa: Gera perfis de complexos resolúveis, permitindo a comparação de estados de montagem entre diferentes condições experimentais.
- Reutilização da plataforma: Facilita a realização de 2D-SDS-PAGE para identificação de subunidades, ampliando a utilidade além do perfil inicial de complexos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Conecta a organização complexa em estágio de descoberta à produção fotossintética funcional sob diferentes estressores ambientais.
- Redução de Riscos Mecanística: Esclarece como perturbações ambientais afetam a montagem de supercomplexos, informando modelos preditivos da robustez da via.
- Alinhamento de Biomarcadores: Permite o monitoramento da dissociação ou remontagem de complexos como indicadores potenciais da eficiência fotossintética.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta inicial, nos quais é exigida a integridade nativa do complexo antes da análise reducionista, permitindo o avanço do isolamento de organelas até a investigação funcional e o acompanhamento estrutural.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a integridade da cadeia de transporte de elétrons fotossintética ao resolver os complexos PSII, PSI, Cyt b6f e ATPase em sua forma nativa.
- Triagem: Fornece perfis de complexos prontos para ensaio com resolução quantitativa de bandas para análise comparativa dos efeitos da solubilização por detergentes.
- Análises: Gera leituras baseadas na migração que permitem às equipes comparar a estabilidade e abundância dos complexos em diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Relaciona a organização dos complexos com a função fotossintética, criando uma ligação com os resultados fenotípicos sob condições de estresse.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para o perfilhamento de complexos de proteínas de membrana em sistemas vegetais, adaptável a outras espécies mediante ajustes no protocolo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Oferece confiança preditiva na validação de alvos ao preservar interações nativas e elucidar dinâmicas complexas.
- Valor Operacional: Garante padronização por meio da moldagem de géis em gradiente e separação eletroforética reprodutível sob temperatura controlada.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não ao reduzir a ambiguidade mecanicista na engenharia de vias fotossintéticas.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base em perfis complexos de estabilidade e interação.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em solubilização de proteínas de membrana e técnicas eletroforéticas nativas.
- Depende de misturador de gradientes, bomba peristáltica e sistemas verticais de eletroforese com controle de temperatura.
- Necessita padronização de protocolos de solubilização com detergentes (beta-DM versus digitonina) para garantir preservação reprodutível dos complexos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes espécies vegetais devido a variações na composição da membrana tilacoide.
- Inclui limitações práticas, como a instabilidade dos complexos provocada pelo beta-DM e a necessidade de compatibilidade com câmara fria ou sistema de refrigeração durante a eletroforese.
