Name: Limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na Vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda a sintetizar nanopartículas de óxido de cério para eliminação catalítica de espécies reativas de oxigênio in vivo em plantas. Este método utiliza Arabidopsis thaliana e microscopia confocal para estudar sinalização vegetal.

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Este trabalho foi apoiado pela Universidade da Califórnia, Riverside e USDA National Institute of Food e agricultura, projeto Hatch 1009710 para J.P.G. Este material é baseado em trabalho, apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob Grant no. 1817363 de J.P.G.

1. cultivo de plantas da . thaliana
<ol><li>A. thaliana semear em potes descartáveis 5 cm x 5 cm, preenchidos com mistura de solo padrão. Colocar 32 destes vasos em uma bandeja de plástico cheia de água (~ 0,5 cm de profundidade) e transferir a bandeja plástica com as plantas em uma câmara de crescimento de planta.<ol>
<li>Definir o crescimento câmara configurações como segue: 200 µmol/ms fotossinteticamente ativa radiação (PAR), 24 ± 1 ° C de dia e 21 ± 1 ° C à noite, 60% de umidade e regime de luz de dia/noite h 14/10, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diluir cada pote para deixar apenas uma planta individual após uma semana de germinação. Tome nota para manter as mudas com tamanho similar em cada vaso.</li>
	<li>Água os potes deitando água de torneira diretamente na bandeja de plástico uma vez a cada dois dias. Crescem as plantas durante quatro semanas. A. thaliana plantas estão prontas para utilização posterior.</li>
</ol>2. síntese e caracterização de PNC
<ol><li>Pesar de 1,08 g de nitrato de cério (III) e dissolvê-lo em 2,5 mL de água de grau biologia molecular em um tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Pesa 4,5 g de ácido poli (acrílico) e dissolvê-lo em 5 mL de água de grau biologia molecular em um tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Misture estas duas soluções completamente a 2.000 rpm durante 15 minutos usando um mixer digital de vórtice.</li>
	<li>Transferi 15 mL de solução de hidróxido de amônio (7,2 M) para um copo de vidro de 50 mL.</li>
	<li>Ao agitar a 500 rpm, adicionar a mistura de passo 2.3 gota a gota para a solução de hidróxido de amônio e agitar a 500 rpm, à temperatura ambiente durante 24 horas em uma coifa.</li>
	<li>Cubra o copo com um pedaço de papel para evitar a perda substancial de solução durante a reação durante a noite.</li>
	<li>Após 24 h, transferir a solução resultante para um tubo cónico de 50 mL e centrifuga-lo a 3.900 x g, durante 1 h remover quaisquer detritos possíveis e grandes aglomerados.</li>
	<li>Transferir este 22,5 mL da solução sobrenadante em três filtros de 15 mL 10 kDa e preencher o restante do filtro com água molecular da classe tornar-se uma diluição total de 45 mL.</li>
	<li>Purificar a solução sobrenadante de polímeros grátis e outros reagentes com uma centrífuga de bancada, adicionando o sobrenadante para um filtro de 15 mL 10 kDa e centrifugar 3.900 x g por 15 min. Repita este passo pelo menos seis vezes.</li>
	<li>Medir a absorvância de eluente em cada ciclo com um espectrofotômetro UV-VIS de 220-700 nm para não garantir nenhuma enciclopédia polímeros e outros reagentes estão presentes na solução final PNC.</li>
	<li>Pegue a solução PNC coletada para a seringa de 5 mL e filtrá-la contra um filtro de seringa de tamanho de poro de 20 nm. Recolha a solução PNC filtrada em um tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Pegue uma solução diluída de PNC final em uma cubeta plástica e medir a absorvância com o espectrofotômetro UV-VIS de 220-700 nm. Pico de absorbância PNC é a 271 nm.</li>
	<li>Calcule a sua concentração, usando a lei de Beer-Lambert: A = εCL. A é a absorvância do valor de pico para uma determinada amostra, ɛ é o coeficiente de absorção molar do PNC (cm-1 M-1), L é o comprimento do percurso óptico (largura da cubeta, neste método de 1 cm) e C é a concentração molar de nanopartículas medidas.</li>
	<li>Medir o diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta do PNC sintetizado usando uma partícula tamanho e zeta potencial analisador (Figura 1).</li>
	<li>Armazene a solução final do PNC no frigorífico (4 ° C) até utilização posterior. Nota: Por favor, consulte Wu et al. 8 para mais detalhes do protocolo sobre caracterização de PNC.</li>
</ol>3. rotulagem PNC com corante fluorescente DiI
<ol><li>Misture a 0,4 mL de 5mm (58 mg/L) PNC com 3,6 mL de biologia molecular da classe água em um frasco de vidro de 20 mL e agitar a 500 rpm.</li>
	<li>Adicionar 24 µ l 1 1'-dioctadecyl-3,3, 3', 3'-tetramethylindocarbocyanine solução de tintura de perclorato (DiI, 2,5 mg/mL; diluído em DMSO) em µ l 176 de DMSO (Dimetilsulfóxido) para fazer a solução de tintura de DiI.</li>
	<li>Adicione o corante DiI gota a gota à solução de PNC, agitando a 1.000 rpm por 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Transfira esta mistura resultante em um filtro de kDa 15 mL 10 e encher o tubo até o topo com água de grau biologia molecular para fazer a diluição total 15 mL.</li>
	<li>Purifica o DiI rotulado solução PNC (DiI-PNC) de DMSO e qualquer tintura de DiI livre possível por uma centrifugação de bancada com o filtro de kDa 15 mL 10 a 3.900 x g por 5 min.<ol>
<li>Repita a etapa 3.5 pelo menos cinco vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Filtre as soluções DiI-PNC finais através de um filtro de seringa de tamanho de poro de 20 nm.</li>
	<li>Medir a absorvância da final DiI-PNC por espectrofotometria UV-VIS e calcular sua concentração de acordo com a lei de Beer-Lambert (Figura 2). Consulte Passo 2.13 para mais detalhes.</li>
	<li>Armazená-lo em um refrigerador a 4 ° C para utilização posterior.</li>
</ol>4. infiltração da planta deixa com PNC
<ol><li>Adicionar 0,1 mL de infiltração buffê (100mm TES, 100 mM MgCl2, pH 7,5, ajustado pelo HCl) em 0,9 mL de solução PNC ou DiI-PNC de 0,5 mM e vórtice-lo. Use uma solução de 10 mM de tampão de infiltração TES como controlo negativo.</li>
	<li>Transferência de 0,2 mL da solução de infiltração de PNC ou DiI-PNC a uma seringa de agulhas esterilizadas 1ml. Torneira para remover quaisquer bolhas de ar possível.</li>
	<li>Recupere a planta da câmara de crescimento antes de infiltração com nanopartículas para evitar o fechamento de estômatos possível sob condições de luz do quarto.</li>
	<li>Antes da infiltração, medir o teor de clorofila das folhas da . thaliana com tamanho similar usando um medidor de clorofila. Medir cada folha com três repetições (cada replicação consistindo de pelo menos três medições)14. Escolha que a a. thaliana deixa com conteúdo de clorofila semelhante para o experimento de infiltração.</li>
	<li>Infiltrar as folhas lentamente com a solução recentemente preparada de PNC ou DiI-PNC pressionando suavemente a ponta da seringa auto-injeções contra a parte inferior da lâmina da folha (abaxial lado) e pressione o êmbolo(Figura 3).</li>
	<li>Gentilmente Limpe a excesso solução que permanece na superfície da lâmina de folha (Figura 3B) usando um limpador de delicada tarefa (Figura 3C) e rotular a planta. Utilize toalhetes de delicada tarefa nova para cada grupo de folhas.</li>
	<li>Mantenha os infiltrados a. thaliana plantas no banco para adaptação de folha e incubação com PNC ou DiI-PNC para 3h. Nota: Plantas infiltradas a. thaliana então estão prontas para utilização posterior (Figura 3-D).</li>
</ol>5. preparação de amostras de folha para a microscopia Confocal
<ol><li>Rolo uma quantidade do tamanho de ervilha de observação do gel para um raio de 1 cm(Figura 4)e então espalhe até 1 mm fina sobre uma lâmina de vidro (Figura 4B).</li>
	<li>Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,3 cm) para cortar uma secção circular no centro do gel observação sobre a lâmina de vidro (Figura 4C).</li>
	<li>Enchem o corte bem inteiramente perfluorodecalin (PFD) para resolução de imagem mais profunda e melhor confocal nos tecidos da folha.</li>
	<li>Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,2 cm) coletar os discos de folha do DiI-PNC adaptado se infiltrou a. thaliana plantas (Figura 4-D).</li>
	<li>Montar o disco de folha no PFD preenchido Encare o lado infiltrado (abaxial) da folha.</li>
	<li>Colocar uma lamela quadrada em cima do disco de folha e pressione suavemente sobre a lamela de slide uniformemente para selá-lo com o poço do gel de observação e garantir que não há bolhas de ar permanecem presos (Figura 4E).</li>
</ol>6. imaging DiI-PNC em tecidos de folha por microscopia Confocal
<ol><li>Use uma lente de objetiva 40 X em um laser invertido microscópio confocal de varredura.</li>
	<li>Deixe duas a três gotas de DDQ2O na parte superior a 40 X da lente objetiva.</li>
	<li>Coloque o slide de amostra de folha DiI-PNC infiltrou-se preparado em cima o invertido 40 X lente objetiva.<ol>
<li>Certifique-se de lado a lamela, mas não o vidro deslizar contato diretamente com o ddH2O na lente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encontre uma região de interesse na amostra ao microscópio com luz laser ou campo brilhante.</li>
	<li>Inicie o software do microscópio e ligue o laser de argônio (fixado em 20%).</li>
	<li>Defina o pinhole para coletar uma fatia óptica inferior a 2 µm e uma média de linha de 4.</li>
	<li>Imagem da amostra com as configurações do microscópio confocal: excitação de laser 514 nm (30%); Espessura de corte de Z-pilha: 2 µm; PMT1: 550-615 nm (para a imagem latente de DiI-PNC); PMT2: 700-800 nm (para a imagem latente do cloroplasto).</li>
	<li>Leve imagens confocal representante de amostras de folhas de indivíduos diferentes, um mínimo de três repetições biológicas.</li>
</ol>7. imaging PNC na vivo ROS eliminação por microscopia Confocal
<ol><li>Preparar 25 µM 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetato (H2DCFDA, um corante para indicar uma ROS geral) e dihydroethidium de 10 µM (DHE, um corante para indicando o anião superóxido) corantes em buffer de infiltração de TES (pH 7,5) em tubos de microcentrifuga de 1,5 mL, separadamente.</li>
	<li>Use uma broca de cortiça (diâmetro 0,2 cm) para coletar a folha discos do PNC adaptado se infiltrou a. thaliana plantas.<ol>
<li>Use a ponta afiada da pinça para fazer três ou quatro furos nos discos folha para acelerar o processo de carregamento de tinta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferência da folha discos para tubos microcentrifuga com H2DCFDA e DHE separadamente e incube por 30 minutos sob a escuridão.</li>
	<li>Após a incubação, enxágue a folha discos com DDQ2O três vezes e montar ele no vidro deslizar com observação gel (ver protocolo seção 5).</li>
	<li>Colocar o slide no microscópio confocal e manualmente o foco para uma região de células do mesofilo de folha. Consulte o protocolo seção 6 para obter detalhes.</li>
	<li>Expor os discos de folha para o UV-A (405 nm) laser para 3 min gerar ROS e registrar a mudança de intensidade do sinal ROS em séries temporais ("xyt") por disco de folha.</li>
	<li>Imagem do disco de folha com as configurações do microscópio confocal: 40 X água objetivo; excitação de laser 496 nm; PMT1: 500-600 nm (DHE DCFDA corante detecção e); PMT2: 700-800 nm (para a deteção de cloroplastos). Use uma planta infiltrada com solução de tampão só da infiltração como controlo negativo.</li>
</ol>8. PNC eliminação de H2O2em vitro
<ol><li>Realizar a atividade mimética CAT (catalase) do sintetizado PNC em vitro , seguindo os métodos em publicações anteriores3,8,15
</li>
	<li>Adicionar 45,4 µ l de 1 x TES de infiltração de buffer (10mm TES, 10 mM MgCl2, pH 7,5, ajustado pelo HCl), PNC (60 nM, 3 µ l) e H2O2 (2 µM, 1 µ l) em um poço (prato bem fundo redondo branco 96) e misture suavemente pipetando.</li>
	<li>Adicionar 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine (trabalho concentração 100 µM, 0,5 µ l) e a peroxidase de rábano (HRP; concentração de trabalho 0,2 U/mL, 0,1 µ l) dentro do poço, delicadamente misturar pipetando e incube-lo por 30 min. 10-acetil-3,7-dihydroxyphenoxazine reage com o H2O2 e é convertido em resorufin na presença de HRP.<ol>
<li>Embrulhe o prato com papel de alumínio para evitar a luz durante a incubação.</li>
		<li>Prepare um controlo negativo usando amortecedor da reação ou água para substituir o H2O2.</li>
		<li>Exceto para a solução-mãe, prepare todas as outras soluções à temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a incubação, com um leitor de placas, monitorar a absorvância a 560 nm usar resorufin para indicar o nível de H2O2. Regime de tempo definido em 0, 2, 5, 10, 20 e 30 min.</li>
</ol>

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<li>Chaves, M. M., Flexas, J., Pinheiro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthesis+under+drought+and+salt+stress%3A+regulation+mechanisms+from+whole+plant+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Photosynthesis under drought and salt stress: regulation mechanisms from whole plant to cell.</a> Annals of Botany. 103 (4), 551-560 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste protocolo, descrevemos PNC síntese, caracterização, tintura fluorescente rotulagem e imagem latente confocal das nanopartículas dentro de células do mesofilo de vegetais para expor seu na vivo ROS eliminação atividade. PNC são sintetizados a partir de uma mistura de PAA solução de hidróxido de amónio e nitrato de cério. PNC caracterizam-se por spectrophotomery de absorção e a concentração de determinada usando a lei da cerveja-Lambert. Medições de potencial zeta confirmaram a superfície carregada negativam...

Nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) são amplamente utilizadas em organismos vivos, de pesquisa básica de bioengenharia, devido a suas espécies distintas catalítico reativas de oxigênio (ROS) eliminação de capacidade1,2,3. Nanoceria ter ROS eliminação habilidades devido a um grande número de vagas de superfície oxigênio que alternam entre dois oxidação Estados (Ce3 + e4 +Ce) 4,5,6. Os Ce3 + oscilação títulos efetivamente eliminar ROS enquanto as cepas de treliça em nanoescala promovem a regeneração destes sites de defeito através de redox reações7de ciclismo. Nanoceria também têm sido usados recentemente para estudar e engenharia planta função8,9. Plantas sob estresse abiótico experimentam acúmulo de ROS, causando danos oxidativos de lipídios, proteínas e DNA10. Em plantas da . thaliana , nanoceria catalítico eliminação de ROS na vivo leva a fotossíntese da planta melhorada sob alta luz, calor e refrigeração salienta8. Aplicação nanoceria para o solo também aumentos atirar rendimento da biomassa e o grão de trigo (Triticum aestivum)11; as plantas de canola (Brassica napus) tratadas com nanoceria têm maior biomassa de plantas sob estresse sal12.
Nanoceria oferecer bioengineers e biólogos da planta uma ferramenta baseada em nanotecnologia para compreender as respostas de estresse abiótico e aumentar a tolerância de estresse abiótico de planta. Na vivo ROS eliminação capacidades do Nanoceria são independentes das espécies de plantas, e a entrega fácil nos tecidos vegetais tem o potencial para permitir ampla aplicação fora de organismos modelo. Ao contrário de outros métodos baseados em geneticamente, nanoceria não exigem gerando linhas de planta com a superexpressão de enzimas antioxidantes para ROS maior eliminação de capacidade13. Infiltração de lâmina de folha de nanoceria de plantas é uma abordagem prática para a pesquisa em laboratório.
O objetivo geral do presente protocolo é para descrever 1) a síntese e caracterização de poli carregados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC), 2) a entrega e rastreamento de PNC em toda as células da folha e 3) a vigilância de eliminação ROS PNC-habilitado em vivo. Neste protocolo, poli carregados negativamente (acrílico) ácido nanoceria (PNC) são sintetizados e caracterizada pelo seu espectro de absorção, diâmetro hidrodinâmico e potencial zeta. Nós descrevemos um método de infiltração de lâmina de folha simples para lançar PNC para fábrica de tecidos da folha. Para imagens em vivo de nanopartículas distribuição dentro das células do mesofilo, uma tintura fluorescente (DiI) foi usada para rotular PNC (DiI-PNC) e observar as nanopartículas através de microscopia de fluorescência confocal. Finalmente, vamos explicar como monitorar na vivo PNC ROS eliminação através de microscopia confocal.

<table><tbody><tr><td>Nitrato de cério (III) hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238538-100G</td><td></td></tr><tr><td>Grau de Biologia Molecular Água, Corning</td><td>VWR</td><td>45001-044&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga Cônicos Falcon 50 mL</td><td>VWR</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>Poli (ácido acrílico) 1.800 Mw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>323667-100G</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de Vórtice Digital Fisherbrand Fisher</td><td>Scientific</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Acessório de Misturador de Vórtice Digital Fisherbrand, Retentor de Inserção</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-391</td><td></td></tr><tr><td>Acessórios para Misturador Digital Vortex da Fisherbrand: Conjunto de Inserção de Espuma</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-395</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05002-1L</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Griffin Beakers, Graduado, Corning</td><td>VWR</td><td>13912-149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RCT basic</td><td>IKA</td><td>3810001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrífuga 5424</td><td>VWR</td><td>80094-126</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Unidades de Filtro Centrífugo</td><td>Millipore-Sigma</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-30 Series Centrífuga</td><td>de Bancada Beckman Coulter</td><td>B06314</td><td></td></tr><tr><td>UV-2600 Sptecrophotometer</td><td>Shimadzu</td><td>UV-2600 120V</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa Whatman Anotop 10</td> Seringas descartáveis <td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA68091102</td><td></td></tr><tr><td>BD com pontas Luer-Lok</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano S</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Zen 1600</td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-Dioctadecil-3,3,3&prime;,3&prime;-tetrametilindocarbocianina perclorato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42364-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido, ACS</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Sunshine Mix #1 LC1</td><td>Green Island Distributors, Inc</td><td>5212601.CFL080P</td><td></td></tr><tr><td>Adaptis 1000</td><td>Conviron</td><td>A1000</td><td></td></tr><tr><td>TES, >99% (titulação</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1375-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Seringa Air-Tite All-Plastic Norm-Ject</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Limpeza de Tarefas Delicadas</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>Carolina Observation Gel</td><td>Carolina</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>Corning lâminas de microscópio, fosco de um lado, uma extremidade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Broca de Cortiça Conjuntos com Alças</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50166A</td><td></td></tr><tr><td>Perfluorodecalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9900-25G</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glasses, Quadrado, Nº 1</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio Confocal de Varredura a Laser Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>2&prime;,7&prime;-Diacetato de diclorofluorescina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6883-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7008-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Uvette cuvettes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z605050-80EA</td><td></td></tr><tr><td>Medidor de clorofila&nbsp;</td><td>Konica Minolta</td><td>SPAD-502</td><td></td></tr></tbody></table>

limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos

Catalytic Scavenging of Plant Reactive Oxygen Species In Vivo by Anionic Cerium Oxide Nanoparticles

Acumulação de (ROS) de espécies reactivas de oxigénio é uma marca registrada da resposta ao estresse abiótico planta. ROS desempenham um papel duplo em plantas actuando como sinalização moléculas em níveis baixos e danificando moléculas em níveis elevados. Acumulação de ROS em plantas estressadas pode danificar metabolitos, enzimas, lipídeos e DNA, causando uma redução do crescimento das plantas e o rendimento. A capacidade de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) para eliminar cataliticamente ROS na vivo fornece uma única ferramenta para compreender e tolerância de estresse abiótico bioengineer planta. Aqui, apresentamos um protocolo para sintetizar e caracterizar nanoceria revestido poli (acrílico), ácido (PNC), interface as nanopartículas com plantas através de infiltração de lâmina de folha e monitorar sua distribuição e eliminação na vivo usando confocal de ROS microscopia. Atuais ferramentas moleculares para manipular a acumulação de ROS em plantas são limitadas a espécie de modelo e exigem métodos de transformação laborioso. Este protocolo para na vivo ROS eliminação tem potencial para ser aplicado ao tipo selvagem plantas com folhas largas e estrutura da folha como Arabidopsis thaliana.

Caracterização e síntese PNC . PNC foram sintetizados, purificada e caracterizada a seguir o método descrito na seção de protocolo 2. Figura 1 A mostra a coloração das soluções de nitrato de cério, PAA, a mistura de nitrato de cério e PAA e PNC. Uma mudança de cor do branco para amarelo claro é vista depois de PNC é sintetizado. Após a purificação com um filtro de 10 kDa, PNC foram caracterizados ...

Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese e caracterização de nanopartículas de óxido de cério (nanoceria) de ROS (espécies reativas de oxigênio) eliminação na vivo, nanoceria de imagens em tecidos vegetais por microscopia confocal e na vivo monitoramento de nanoceria ROS eliminação pela microscopia confocal.

Limpeza catalítica de planta reativas de oxigênio espécies na Vivo por nanopartículas de óxido de cério aniônicos

Reactive oxygen species (ROS) accumulation is a hallmark of plant abiotic stress response. ROS play&#160;a dual role in plants by acting as signaling ...

A capacidade das nanopartículas de óxido de cério de eliminar cataliticamente espécies reativas de oxigênio in vivo fornece uma ferramenta única para entender e projetar mecanismos de sinalização e tolerância ao estresse das plantas. As espécies reativas de oxigênio desempenham um papel fundamental nas plantas, agindo como moléculas de sinalização em níveis baixos e danificando moléculas em níveis elevados. A principal vantagem desta técnica é o potencial de ser aplicada a diversas espécies de plantas silvestres com folhas largas e estrutura foliar, como Arabidopsis thaliana.Depois de cultivar as plantas Arabidopsis thaliana, pesar 1,08 gramas de nitrato de cério e dissolva-o em 2,5 mililitros de água biológica em um tubo cônico de 50 mililitros. Pese 4,5 gramas de poliácido e dissolva-o em cinco mililitros de água biológica em um tubo cônico diferente de 50 mililitros. Combine essas duas soluções e, em seguida, use um misturador de vórtice digital para misturá-las bem a 2.000 rpm por 15 minutos.Em uma capela, transfira 15 mililitros de uma solução de hidróxido de amônio de 7,2 molares para um copo de vidro de 50 mililitros. Comece a mexer a 500 rpm e à temperatura ambiente. Adicione a mistura de nitrato de cério e poliácido gota a gota.Cobrir o copo com um pedaço de papel para evitar perdas substanciais da solução e deixar mexer durante 24 horas. Depois disso, transfira a solução resultante para um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugue a 3.900 vezes g por uma hora para remover quaisquer detritos ou aglomerados grandes.Em seguida, transfira o sobrenadante para três filtros de 50 mililitros e 10 quilodaltons. Encha o restante de cada filtro com água de grau molecular, resultando em uma diluição total de 45 mililitros. Centrifugar a 3.900 vezes g durante 15 minutos.Repita esse processo pelo menos seis vezes. Usando um espectrofotômetro UV-vis, meça a absorbância de cada eluente de 220 nanômetros a 700 nanômetros para garantir que nenhum polímero livre ou outros reagentes estejam presentes na solução final de PNC. Use uma seringa de cinco mililitros para pegar a solução de PNC coletada.Em seguida, filtre a solução contra um filtro de seringa do tamanho de um poro de 20 nanômetros e colete a solução filtrada em um tubo cônico de 50 mililitros. Transferir uma solução final diluída de PNC para uma cubeta de plástico e medir a sua absorvância de 220 nanómetros a 700 nanómetros. Usando um medidor de partículas, meça o diâmetro hidrodinâmico do PNC sintetizado e, em seguida, armazene a solução final de PNC em uma geladeira a quatro graus Celsius até que esteja pronta para uso.Depois de rotular o PNC com corante fluorescente DiI, transfira 0,9 mililitros de uma solução contendo 0,5 milimolar da solução PNC ou da solução DiI-PNC para um tubo. Adicione 0,1 mililitro de tampão de infiltração e misture por vórtice. Preparar um tampão de infiltração TES de 10 milimolares como controlo negativo.Em seguida, transfira 0,2 mililitros da amostra e da mistura tampão para uma seringa estéril sem agulha de um mililitro. Toque para remover possíveis bolhas de ar. Pouco antes da infiltração, recupere a planta da câmara de crescimento.Usando um medidor de clorofila, meça o teor de clorofila nas folhas de A.thaliana. Meça cada folha com três réplicas, conforme descrito no protocolo de texto. Escolha folhas com teor de clorofila semelhante.Pressione suavemente a ponta da seringa sem agulha contra a parte inferior da lâmina da folha e pressione o êmbolo para se infiltrar nas folhas. Usando um limpador de tarefas delicadas, limpe suavemente qualquer excesso de solução que permaneça na superfície da lâmina da folha e, em seguida, rotule a planta. Mantenha as plantas infiltradas na bancada para incubar por três horas.Primeiro, coloque uma quantidade do tamanho de uma ervilha de gel de observação em uma lâmina de vidro, enrole o gel e espalhe-o até que tenha aproximadamente dois centímetros de diâmetro e um milímetro de espessura. Usando uma broca de cortiça com um diâmetro de 0,3 centímetros, corte uma seção circular no centro do gel para criar um poço. Encha o poço completamente com PFD, o que proporcionará uma resolução de imagem confocal mais profunda e melhor.Em seguida, use uma broca de cortiça com um diâmetro de 0,2 centímetros para coletar discos de folhas das plantas A.thaliana previamente infiltradas. Monte cada disco de folha em um poço cheio de PFD com o lado infiltrado voltado para cima. Depois disso, coloque uma lamínula quadrada em cima do disco da folha.Pressione suave e uniformemente a lamínula para selar com o poço de gel de observação e certifique-se de que nenhuma bolha de ar fique presa. Para começar, prepare 25 micromolares de corante H2DCFDA e 10 micromolares de corante DHE em tampão de infiltração TES em tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitro. Usando uma broca de cortiça com um diâmetro de 0,2 centímetros, colete discos de folhas das plantas A.thaliana infiltradas em PNC adaptadas.Use a ponta afiada da pinça para fazer três a quatro furos em cada disco de folha para acelerar o processo de carregamento de corante. Em seguida, carregue uma quantidade igual de discos de folhas em cada tubo de corante. Incube na escuridão por 30 minutos.Depois disso, enxágue os discos das folhas com água bidestilada três vezes. Use gel de observação para montar cada folha em uma lâmina de vidro, conforme descrito anteriormente. Carregue a lâmina em um microscópio confocal e foque manualmente em uma região das células do mesófilo da folha, conforme descrito no protocolo de texto, em seguida, exponha os discos das folhas a um laser UVA a 405 nanômetros por três minutos para gerar ROS.Registre a mudança de intensidade do sinal ROS em séries temporais por disco leaf. Visualize o disco de folhas usando uma objetiva de água 40X e as configurações do microscópio confocal mostradas aqui. Use uma planta infiltrada apenas com solução tampão de infiltração como controle negativo.Após a purificação, o PNC sintetizado é caracterizado usando um espectrofotômetro UV-vis e tem um pico de absorbância de 271 nanômetros. O processo de purificação é confirmado pela medição do eluente final. As amostras PNC são então marcadas com um corante DiI fluorescente para determinar a distribuição das nanopartículas in vivo.Três picos são observados para o PNC marcado com DiI, enquanto uma medição do eluente final confirma que os produtos químicos não reagidos são lavados durante a purificação. A distribuição de DiI-PNC nas células do mesófilo foliar é determinada por meio de imagens confocais. Embora nenhum sinal de corante DiI seja detectado nas amostras de controle, o DiI-PNC é observado co-localizado com cloroplastos nas folhas infiltradas.A eliminação de ROS in vivo habilitada pelo PNC é monitorada no disco foliar medindo as mudanças de intensidade de fluorescência nos corantes DHE e DCF. Após três minutos de estresse UV, as folhas infiltradas por PNC mostram significativamente menos intensidade para ambos os tipos de corante quando comparadas ao controle tampão sem nanopartículas. Um ensaio de atividade mimética CAT revela uma diminuição no nível de resorufina na mistura contendo PNC.Este nível é indicativo do nível de peróxido de hidrogênio, que, portanto, também está diminuindo, e confirma a atividade mimética CAT do PNC sintetizado. Este protocolo para sintetizar nanocéria é um procedimento simples e gradual que gera nanopartículas de óxido de cério com tamanho, carga e capacidade de eliminação de ROS controlados. Os métodos de modificação genética de plantas para manipulação de ROS in vivo estão atualmente limitados a espécies modelo de plantas.Em contraste, a eliminação de ROS de nanocéria tem o potencial de ser aplicada a diversas espécies de plantas selvagens, tanto em laboratório quanto em campo.

catalytic-scavenging-plant-reactive-oxygen-species-vivo-anionic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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