Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nos campos da toxicologia de insetos e fisiologia de insetos medindo a eletrogênese do sistema nervoso central Drosophila melanogaster. Isso permite testar uma ampla gama de hipóteses científicas e ajudar na descoberta de novos modos de ação de inseticidas. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um sistema simples, reprodutível e relativamente de alta produtividade com mínimo de contribuição financeira para estudar o sistema nervoso de Drosophila.

Para começar, abra o software de aquisição/análise. Clique em Configurar na barra de ferramentas principal e selecione Configurações do canal, que abrirá uma caixa de diálogo. Reduza o número de canais totais para três.

O canal um gravará o sinal bruto do amplificador com um alcance de 100 milvolts. O canal dois será usado para contar o número de eventos do canal um que estão acima de um determinado limite. Para isso, clique na guia Cálculo para abrir um menu suspenso para o canal dois.

Selecione Medidas Cíclicas, que abrirá uma segunda caixa de diálogo. Selecione o canal um como fonte. Em seguida, na medição do menu suspenso, selecione "Clique de unidade em eventos".

Finalmente, na área de configurações de detecção, a partir do menu suspenso, selecione Limite Simples. O nível de limiar é a entrada na janela de ajuste de detecção a ser definida acima do ruído de fundo. Para converter a atividade elétrica em uma parcela de taxa expressa em hertz, selecione Aritmética no terceiro canal.

Na nova janela, entrada 1000 vezes sem problemas, parênteses canal dois círio dois. Em seguida, selecione no menu suspenso das unidades a unidade de frequência hertz. Feche as caixas de diálogo para retornar à tela principal.

O eixo y do canal três deve ser expresso em hertz e no eixo x no tempo. Disseca a larval Drosophila CNS identificando e extraindo pela primeira vez um melanmorte Drosophila de terceira instar da cultura e colocando-a em 200 microlitradores de soro fisiológico. Em seguida, segure os ganchos da boca com um par de fórceps finos, e pegue o abdômen da larva com um segundo par de fórceps, com pressão leve, para evitar rasgar a fina camada cuticular.

Puxe suavemente os ganchos da boca e o abdômen em direções diferentes para separar a extremidade caudal da larva da região da cabeça e expor as vísceras da larva. O CNS será entrelaçado com a traqueia e o trato digestivo. Provoque o CNS para fora do trato digestivo e traqueia com fórceps.

A dissecação do sistema nervoso central Drosophila a partir da larva é um passo crítico para o sucesso. A gânglio dissecada deve estar intacta, sem danos significativos aos nervos motores descendentes. Um número maior de nervos motores ligados ao gânglio aumentará as frequências de disparo da linha de base.

Se necessário, interrompa a barreira hemencefálica transectando manualmente o CNS posterior para os lobos cerebrais com a tesoura de mola Vannas. A transeção deve ser feita com base nas propriedades fisioquímicas do produto químico utilizado. A linha vermelha é o ponto de transecção sugerido e o CNS transectado com troncos nervosos periféricos descendentes intactos mostrados aqui.

Para começar, primeiro puxe o eletrodo de pipeta de vidro de capilares de vidro borossilicato para uma resistência de cinco a 15 megaohms. Insira o CNS transectado em uma câmara de cera contendo 200 microlitres de soro fisiológico. Fixar um pino de inseto não revestido com um clipe de jacaré soldado no fio moído, e inserir o pino no soro fisiológico para completar o circuito.

Usando os micromanípulos, oriente o eletrodo até a extremidade caudal do CNS transectado. Elimine o ruído de fundo ajustando o nível de limiar no software de aquisição/análise antes de conectar os troncos nervosos periféricos. Aplique uma leve pressão negativa na seringa para atrair nervos periféricos para o eletrodo de sucção.

Inicie a gravação no software de aquisição de dados e a taxa de disparo da linha de base se equilibre por cinco minutos antes de coletar dados da taxa de disparo da linha de base. Após cinco minutos, adicione 200 microliters de soro fisiológico e veículo para levar o volume total da câmara a 400 microliters para começar a registrar taxas de disparo de controle. Descarte a preparação e gravação se o padrão de disparo do tratamento de controle não for semelhante ao exemplo mostrado aqui.

Quando a linha de base for estabelecida após três a cinco minutos de gravação, retire 200 microliters de soro fisiológico e adicione 200 microliters do agente experimental solubilizado em soro fisiológico. Rotule este ponto de tempo de aplicação de medicamentos no software de aquisição/análise, incluindo um comentário que inclui a droga e a concentração final. Mostrado aqui é um traço representativo de descarga nervosa antes e depois da exposição ao DMSO.

A seta indica a hora da aplicação. Uma resposta limitada ao DMSO é vista. Doses crescentes de propoxur amplificaram a frequência de descarga de pico da Drosophila CNS transectada de forma dependente da concentração, enquanto o neurodepressor GABA reduziu a frequência de descarga de pico de forma dependente da concentração.

Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que é um experimento ex vivo, e, portanto, as condições do soro fisiológico, como pH e temperatura, são críticas para a atividade prolongada da preparação do sistema nervoso central. Da mesma forma, a falta de atividade elétrica ím loca, uma gaiola faraday eficaz e uma redução do ruído de 60 hertz são fundamentais para o sucesso deste ensaio. Os dados coletados através deste ensaio podem ajudar a identificar o modo específico de ação dos inseticidas.

A validação subsequente desses dados através de outros métodos como eletrofisiologia de repressão de tensão, análises bioquímicas e ensaios farmacológicos adicionais podem ser realizados.