Cultivo individual de copépodes Tigriopus e análise quantitativa de seu comportamento companheiro-guarda

A principal vantagem desta técnica de cultivo é que você pode obter copépodes virgens enquanto controla sua experiência de pareamento e acompanha seu desenvolvimento. O seguinte método de análise de comportamento pode ajudar experimentos controlados e reprodutíveis sobre o comportamento de guarda de mate dos copépodes Tigriopus que são zooplâncton comuns em piscinas de marés rochosas. Embora esses métodos possam fornecer uma visão do comportamento reprodutivo do Tigriopus, eles também podem ser usados para analisar como fatores genéticos e ambientais afetam a fisiologia e o comportamento desses copépodes.

Para começar, use uma pipeta Pasteur para coletar fêmeas gravid que carregam ovos de laranja claros da cultura do estoque. Enxágüe as fêmeas com meio de cultura limpa através de pipetação suave. Em seguida, coloque cada fêmea em um poço individual de uma placa de cultura de seis poços com meio de cultura limpa.

Em seguida, coloque o prato em uma incubadora para cultivar as fêmeas até que elas liberem sacos de ovos. Depois que os sacos de ovos forem liberados, use uma pipeta Pasteur para remover as fêmeas dos poços da placa. Assim que os animais na primeira fase do copepodide ou CI começarem a emergir, use uma micropipette P-10 para recolhê-los.

A cada dois ou três dias, monitore os poços para exuviae derretido. Depois disso, sexo os animais examinando sua morfologia antena. Para identificar corretamente as fêmeas adultas, certifique-se de que elas já tenham se desformado com cinco exuviae em poços de cultura porque as diferenças de forma de antenas entre fêmeas adultas e juvenis não são visivelmente significativas em algumas populações.

Após a seleção dos animais da fase e sexo adequados, alimente os indivíduos selecionados com alimentos de peixe finamente moídos. Enquanto os animais comem, prepare duas placas de cultura de células inferiores planas de 48 poços como câmaras de teste. Depois de 30 minutos, enxágue cada animal, canalizar-o em uma sucessão de quatro poços de uma placa de 24 poços cheia de água limpa e artificial do mar.

Em seguida, coloque os indivíduos enxaguados nos poços das placas A e B na almofada de luz LED. Permita que os animais se aclimatem por 30 minutos e use uma pipeta Pasteur para transferir os alvos da placa B para a placa A.Permita que um macho e um alvo interajam em cada poço para o tempo de observação designado antes de parar a gravação de vídeo. Primeiro, examine o vídeo para o tempo quando cada alvo foi transferido para um poço na placa A.Em seguida, defina o início de uma tentativa de guarda por um macho como um contato da antena do macho com qualquer parte do corpo do alvo.

Defina o término da tentativa de guarda por um macho como o ponto em que ambas as antenas do macho se desprendem do corpo do alvo. Em seguida, defina o início da copulação por uma curva dorsal do corpo de um macho, seguida por uma prensa repetitiva do urosome contra a da fêmea. Primeiro, gere um videoclipe com o episódio de interesse, aparando o filme com software de edição de filmes.

Em seguida, abra ImageJ e importe o clipe de vídeo. Selecione a opção de escala de cinza de 8 bits encoberta para reduzir a memória necessária para o processamento de imagens. Em seguida, selecione a ferramenta de seleção em linha reta para calibração espacial e desenhe uma linha de seleção ao longo do diâmetro do poço.

Abra o menu de escala definida e digite o comprimento conhecido na caixa de distância conhecida e na unidade na unidade da caixa de comprimento. Depois disso, abra o menu de propriedades e digite o intervalo do quadro na caixa de intervalo do quadro. Abra o plugin MTrackJ selecionando plugins e MtrackJ.

Em seguida, clique no botão de rastreamento na janela de diálogo para abrir o menu de configuração de rastreamento. Verifique aplicar o cursor local durante a faixa e selecione centroid escuro como um recurso de snap. Em seguida, clique no botão adicionar na janela de diálogo MTrackJ para iniciar o rastreamento.

Posicione um cursor para cobrir os indivíduos no clipe de vídeo a ser rastreado. Em seguida, clique para detectar o centroide escuro do objeto dentro da praça. Para gerar tabela de dados, clique na tabela de medida na janela de diálogo MTrackJ e clique no botão de filme para gerar um filme com a trajetória rastreada desenhada como uma linha colorida.

Finalmente, clique no botão salvar na janela de diálogo MTrackJ para salvar os resultados, incluindo os dados na trajetória bidimensional rastreada. Neste experimento, foi registrado e observado o comportamento de guarda-mate dos copépodes Tigriopus. A análise mostra uma diferença na duração média das tentativas de guarda entre pares masculino-feminino e pares masculino-masculino de Tigriopus californicus, onde os machos nos pares masculino-masculino apresentaram duração relativamente menor de tentativas do que aqueles em pares masculino-feminino.

Dois rastreamentos espaciais de dimensões de pares de guarda recém-formados de Tigriopus californicus revelaram que os pares masculino-masculino tendiam a mostrar maior velocidade do que os pares masculino-feminino nos primeiros três segundos de tentativas de guarda. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores das áreas de etologia, bioquímica e genética evolutiva explorarem o sistema único de acasalamento desse tipo de copépodes.