Name: Um modelo de Mouse hiperandrogénicas para estudar a síndrome do ovário policístico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprenda a criar um modelo murino hiperandrogênico usando pellets de dihidrotestosterona para estudar a síndrome do ovário policístico. Este método permite investigar os efeitos da hiperandrogenia materna na saúde reprodutiva da prole.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R00-HD068130 subsídios para S.W.) e o centro de pesquisas de Diabetes de Baltimore: pilotos e viabilidade Grant (S.W.).

Aqui, apresentamos protocolos detalhados para inserção e preparação de sedimento DHT e para testes metabólicos e reprodutivos. Os ratos utilizados neste estudo foram um fundo misto (C57/B6, CD1, 129Sv) e foram mantidos com comida e água ad libitum em um ciclo de luz/escuridão h 14/10 a 24 ° C na instalação de animal Broadway edifício de investigação para o Johns Hopkins University School of Medicina. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal do Johns Hopkins University.
1. criar o modelo de SOP, como Mouse
<ol><li>
Preparação de pelota DHT
	<ol>
<li>Tubulação de silastic autoclave para esterilizar. Corta tubos de silastic para um comprimento de 15 mm com uma lâmina de barbear;</li>
		<li>Sele um lado injetando silicone adesivo médico dentro do tubo com uma agulha cega de 20g, ligada a uma seringa de 3 mL. Êmbolo deve ser retirado a seringa e, em seguida, adesivo inserida no reservatório. O êmbolo é reinserido e adesivo empurrado para baixo, até que começa a emergir da agulha. A agulha cega é feita por um corte do lado da ponta afiada da agulha 20g com qualquer tesoura forte. O comprimento de silício no tubo deve ser superior a 2 mm para permitir a filtragem de pós-produção;</li>
		<li>Secar durante a noite; Verifique se há bolhas de ar no lado selado. Aqueles com nenhuma bolha de ar são utilizados para pelotas DHT. Outras podem ser usadas para pelotas de controle não-DHT.</li>
		<li>Use luvas, máscara, óculos e jaleco antes de fazer a DHT-sedimento em uma capa para evitar a exposição DHT para a pele.</li>
		<li>Pó DHT despeje em um plástico peso barco e pressione o lado aberto do adesivo tampado tubos (produzidos na 1.1) em pó a DHT.</li>
		<li>Pó DHT pode ser tamped para baixo com um clipe de papel grande que é alisado.  Continue até DHT atinge uma altura de 4 mm (ou comprimento desejado). Verificar o comprimento do DHT com uma régua e selar o lado aberto com silício, seco durante a noite.</li>
		<li>Corte cada lado selado para fazer o comprimento de silicone de 2 mm de comprimento. O comprimento total do pellet será de 8 mm.</li>
		<li>Selo de ambos os lados do tubo silastic vazio como pelota de controle (não-DHT).</li>
		<li>Manter pelotas em um tubo cônico de 50 mL, embrulhado com papel alumínio (para evitar a exposição à luz) em temperatura ambiente até o uso. As pelotas DHT mantenham plena eficácia pelo menos 3 meses de armazenagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Substituição e inserção de DHT
	<ol>
<li>Até 20 DHT pelotas ou pelotas de controle estão submergidas separadamente em um tubo cónico de 50 mL com 30 mL 0,9% soro fisiológico estéril por 24 h a 37 °C para equilibrio apenas antes da inserção.</li>
		<li>Antes da cirurgia, as superfícies e luvas são desinfetadas com clidox e as superfícies de trabalho são cobertas com papel absorvente apoiado plástico limpo (bloco cirúrgico).  Todos os instrumentos que entram em contacto com animais são descontaminados antes de entrar a facilidade animal em autoclave.  Instrumentos poderão seco e fresco antes da utilização.</li>
		<li>ratos fêmeas de 2 meses de idade são utilizados (4 – 5 ratos/gaiola). Os ratos são injectados intraperitonealmente com xilazina (3,5 mg/kg bw) e cetamina (78,8 mg/kg bw) utilizando uma seringa de insulina. Cálculos para mistura e dosagem de anestesia está na tabela 1.</li>
		<li>Após anestesia adequada é alcançada, como medido pela perda do reflexo de dedo do pé e retardou a respiração, o mouse vai ser preparado para a cirurgia.</li>
		<li>Desinfectar a pele da área com betadine usando gaze esterilizada e limpar com álcool 70%.  A área será pintada novamente com betadine.</li>
		<li>Corte um buraco de cerca de 5 mm comprimento com tesoura debaixo da pele perto do pescoço. Usando um bisturi 10 G, faça um pequeno túnel (15 mm) na direção rostral. A pelota é inserida dorsalmente com o bisturi.</li>
		<li>A abertura é então selada com adesivo cirúrgico. Manualmente aproximada a ferida bordas com fórceps e traços de escovagem suaves para aplicar uma fina camada de adesivo líquido para as bordas da ferida aproximadas. Camadas finas de acúmulo 3 de adesivo para garantir que o adesivo é uniformemente distribuído sobre a ferida. O adesivo deve estender a 1 cm de cada lado das bordas da ferida aposto. Suturas ou grampos cirúrgicos também podem ser usados para fechar o buraco. Colocar ratos de volta na gaiola, alojada individualmente, com uma almofada de calor para a recuperação. Substitua a pelota em 4 semanas para manter um nível constante de exposição de andrógeno. A pelota original será removida e sedimento novo será inserido conforme descrito em A1.15 na posição semelhante.</li>
		<li>Testar o simbolo estral após 3 dias de inserção de DHT. Fase do ciclo estral é avaliada pela citologia vaginal.  Células vaginais são coletadas por 16 dias consecutivos usando uma pipeta p10 esguinchar solução salina estéril (cerca de 10 µ l) na cavidade vaginal e depois retirar o soro fisiológico com a ponta da pipeta estéril mesmo.  Células vaginais sobram da parede vaginal misturam com soro fisiológico e são coletadas.</li>
		<li>Espalhe a solução salina com células numa lâmina rotulada. Cada slide pode conter seis amostras. Slides são etiquetados para indicar qual amostra é colocada em cada um dos seis locais.</li>
		<li>Após o soro fisiológico completamente secou no slide, colocar slides em um recipiente com 100% de etanol para consertar as células. Slides devem ser fixados para pelo menos 5 min, mas podem permanecer no fixador indefinidamente até utilização posterior.</li>
		<li>Coloque slides em soluções de coloração para 1 min para tampão B e slides C. Wash com água da torneira e seco à temperatura ambiente.</li>
		<li>Examine a morfologia celular sob um microscópio de luz objetiva de 10 X.  Morfologia da célula para distinguir (P) de proestro, estro (E), metestrus (M) e diestro (D) é descrita em referências de28,de27,29.</li>
		<li>Contagem dos dias em cada fase e dividido pelo número total de dias para calcular o tempo por cento em cada estágio.</li>
		<li>Teste tolerância à glicose em 21 dias após a inserção de DHT pelo jejum os ratos durante a noite (16 h) e injeção de 2 g/kg de peso corporal de 20% dextrose intraperitonealmente. Por exemplo, se um peso de corpo do rato é 25g, este rato será injetado com 250 µ l de dextrose 20% com uma seringa de insulina 50 cc (0,5 mL). Níveis de glicose são avaliados pelas tiras de glicosímetro e teste por amostragem de sangue da veia da cauda em 0, 15, 30, 60, 90, 120 min. Isto é descrito em detalhe em outro lugar30.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coleta de sangue
	<ol>
<li>Colher o sangue em vários dias após a inserção de DHT (limitar volume de coleção para 100 µ l de esteroide e 30ul para ensaio de LH/FSH) entre 9 e 10:00 por submandibular veia sangrando com lanceta. Isto é descrito em11.</li>
		<li>Centrifugar o sangue a 6.000 x g a 4 ˚C por 10 min e recolher a camada de soro em outro tubo de 1,5 mL que pode ser armazenado a-80 °C até ensaio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. avaliar reprodutiva perfis da prole feminina de DHT cronicamente inserido barragens
<ol><li>
Acasalamento
	<ol>
<li>O rato fêmea a ser testado é movido para a gaiola com um macho fértil comprovada (que anteriormente teve filhotes com um rato fêmea) 15 dias após a inserção da pelota.</li>
		<li>Documente o peso do corpo da barragem toda semana para determinar se o mouse está grávido. Barragem de aumentos de peso de mais de 3 g em uma semana indica gravidez.</li>
		<li>Colete sangue de barragens na segunda semana depois observamos aumento de peso de barragens superior a 3 g na semana anterior.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Puberdade, avaliada pela abertura vaginal e do primeiro estro
	<ol>
<li>Verificar a abertura vaginal por inspeção visual todos os dias depois que filhotes são desmamados em 21 dias pós-parto (PND), medir a distância anogenital e gravar a idade da abertura vaginal.</li>
		<li>Uma vez que a vagina se abre, colete células vaginais diariamente, conforme descrito em 1.2.8–1.2.11 para verificar o simbolo estral.</li>
		<li>Observar a morfologia celular como 1.2.12 descrito, e o primeiro estro é definido como a data que todas as células são células epiteliais cornificadas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Corpo peso e orelha punch
	<ol>
<li>Mergulhe a ponta da lanceta na pasta de tatuagem e marcar cada filhote com tatuagem no dedo, conforme descrito na referência12 no PND 7 e pesar ratos a cada 7 dias até 70 dias de idade.</li>
		<li>Ratos de soco de orelha para numerá-los usando o sistema na Figura 1 entre 12 a 16 PND. Para distinguir o sexo, examine o lado ventral do corpo, as fêmeas terá mamilos visíveis.</li>
		<li>Coletar o sangue no 21, 26, 70 PND após o nascimento, conforme descrito acima no 1.3.1</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ensaio hormonal
	<ol>
<li>Os níveis DHT no soro sanguíneo são medidos por ambos os ensaio imunoenzimático (ELISA) e pelo conjunto de cromatografia líquida de massa espectrometria (LC-MS)23,24,31,32. T é medido por LC-MS, ou um rato/mouse ELISA validado pelo Universidade de Virgínia ligante ensaio núcleo no centro de pesquisa em reprodução23,24.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>McNamara, K. M., Harwood, D. T., Simanainen, U., Walters, K. A., Jimenez, M., Handelsman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+sex+steroids+in+murine+blood+and+reproductive+tissues+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Steroid+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of sex steroids in murine blood and reproductive tissues by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 121 (3-5), 611-618 (2010).</li>
<li>Klein, S. L., Bird, B. H., Glass, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+Seoul+virus+infection+are+not+related+to+adult+sex+steroid+concentrations+in+Norway+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Sex differences in Seoul virus infection are not related to adult sex steroid concentrations in Norway rats.</a> J. Virol. 74 (17), 8213-8217 (2000).</li>
<li>Siracusa, M. C., Overstreet, M. G., Housseau, F., Scott, A. L., Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((17beta-estradiol+alters+the+activity+of+conventional+and+IFN-producing+killer+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">17beta-estradiol alters the activity of conventional and IFN-producing killer dendritic cells.</a> J. Immunol. 180 (3), 1423-1431 (2008).</li>
</ol>

Nada de divulgar.

Hiperandrogenismo é uma característica fundamental da síndrome do ovário Policístico. A DHT sérica (duas vezes mais alto nos ratos DHT do que nos ratos não-DHT) usada neste protocolo é inferiores aos relatados por outros pesquisadores em estudos anteriores e é calibradas para imitar proporcionalmente as mulheres com SOP5,19, 20,21. Ao contrário de outros modelos, este modelo DHT 2 vezes não al...

Hiperandrogenismo é a marca da síndrome do ovário policístico (SOP) de acordo com os critérios do NIH e do excesso de andrógenos e síndrome do ovário Policístico (SOP-AE) da sociedade. Mulheres com SOP têm dificuldade em engravidar e tem aumentado o risco de complicações de gravidez1. Mesmo se elas engravidam, sua prole feminina tem um resultados de saúde adversos2,3. Modelos animais foram desenvolvidos utilizando várias estratégias4,5,6,7,8,9,10,11 , 12 e exibindo muitas características da síndrome do ovário Policístico (anovulação, e ou tolerância deficiente de glicose e insulina) com aumento de peso e obesidade associada com hiperplasia dos adipócitos de tamanho e peso do aumento dos adipócitos. Existem duas estratégias principais para produzir modelos animais que são usados para estudar a síndrome do ovário Policístico. Um é o tratamento com níveis elevados de andrógenos diretamente (injeção/inserção de andrógenos exógenos) ou indiretamente (por exemplo, bloqueando a conversão de andrógeno em estrógeno com inibidor de aromatase) após nascimento13. Outra é por hyperexposure fetal de andrógenos durante gestação14,15 estudar a prole. Por exemplo, a prole fêmea de macaco rhesus16,17, ovelha18e roedores expostos a níveis masculinos de andrógeno durante o período intra-uterino desenvolve traços de SOP, como mais tarde na vida. Estes modelos aprimorado significativamente nossa compreensão de efeitos de andrógeno elevado, programação fetal e uterinos efeitos ambientais. No entanto, estes modelos têm suas próprias limitações: 1) animais desenvolvem obesidade e, por conseguinte, é difícil separar os efeitos da hyperandrogenemia de obesidade induzida reprodutivos e disfunções metabólicas; 2) antes da gravidez, as mulheres com SOP já apresentam níveis elevados de andrógenos, assim oócitos foram expostos a andrógeno em excesso antes de fertilização; 3) as doses farmacológicas de testosterona (T) ou dihidrotestosterona (DHT) usado após o nascimento ou durante a gestação podem não refletir o ambiente de andrógeno de SOP. Foram medidos os níveis de testosterona e DHT no fluido folicular ovariano e/ou soro, e a testosterona e os níveis DHT são 1.5 para 3,9 vezes maior em mulheres com SOP5,19,20,21 ,22,23 , quando comparadas com mulheres não afetadas. Criamos um rato adulto modelo23,24,25 que desenvolve disfunção metabólica e reprodutiva dentro de duas semanas a contar do início da exposição crônica de DHT de inserção de um pellet com 4 mm de comprimento de pó de cristal DHT (comprimento total da pelota é 8mm). Este modelo produz níveis séricos DHT que são cerca de 2 dobras superior (designado 2xDHT) do que o de ratos controle sem tratamento de DHT. Os ratos 2xDHT não apresentam alterações de estradiol basal soro, testosterona, LH e não desenvolver obesidade e mostrar o peso ovariano semelhante, os níveis séricos de colesterol, ácidos graxos livres, leptina, TNFa e IL-623,24, 25 , relativo a controla mesmo até 3,5 meses após a inserção de DHT23,24,25. Além disso, pelo acasalamento de fêmeas que já desenvolveram características da síndrome do ovário Policístico, podemos estudar o impacto de um ambiente de hiperandrogénicas materna sobre a saúde reprodutiva e metabólico da prole15.
Neste novo paradigma (relevante para os critérios NIH e sociedade AE-SOP) modela a doença através da produção relativamente semelhantes níveis de andrógenos para aqueles das mulheres com SOP 2 - a 3 vezes mais testosterona ou níveis DHT, quando comparados com mulheres não afetadas. No entanto, este modelo é mantido por DHT exógena contínua e não de hiperandrogenismo endógeno programado uma vez DHT é retirado. O objetivo geral deste artigo é se concentrar em 1) como fazer a pelota DHT; 2) como gerar um SOP-incline-se como um modelo do rato; 3) estratégias para avaliar a prole fêmea dessas barragens. Outras medições e avaliação dos fenótipos não são abordados neste manuscrito, mas podem ser encontradas em5,15,23,24,25,26.

<table><tbody><tr><td>Pó cristalino 5&alpha;-DHT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8380-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dow Corning Tubulação Silastic</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-15D</td><td>0,04 pol / 1 mm de diâmetro interno x0,085 pol / 2,15 mm de diâmetro externo</td></tr><tr>Fator de<td>silicone adesivo médico</td><td>II, InC.</td><td>A-100</td><td></td></tr><tr><td>Óculos, jalecos, luvas e máscaras.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L pontas de pipeta sem filtro</td><td>USA Scientific</td><td>11113700</td><td></td></tr><tr><td>lâmina de microscópio para esfregaço</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-003</td><td></td></tr><tr><td>Diff Quik para coloração de células</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9979740</td><td></td></tr><tr><td>Lancet</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9416572</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de 3 mL</td><td>Becton, Dickinson and Company (BD),</td><td>30985</td><td></td></tr><tr><td>agulha anexada: 20 G</td><td>BD</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>Régua: qualquer comprimento que 10 cm com escala milimétrica.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Vet one AnnSeA LA, MWI, Boise</td><td>NDC13985-704-10</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Cloridrato de Cetamina</td><td>Hospira, Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Grampo cirúrgico</td><td>AutoClip&reg; Sistema, Fine Science Tool</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td>1/2 CC, seringa de insulina U-100 de baixa dose</td></tr><tr><td>Trocarte</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Carl Zeiss Primo Star</td><td>415500-0010-001</td><td>Alemanha</td></tr><tr><td>Perfurador de orelha</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-201</td><td></td></tr><tr><td>Testosterona rato/camundongo ELISA kit</td><td>IBL</td><td>B79174</td><td></td></tr><tr><td>DHT ELISA kit</td><td>Alpha Diagnostic International</td><td>1940</td><td></td></tr><tr><td>One touch ultra glicosímetro</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Listras de teste ultra de um toque</td><td>Life Scan, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo Eppendorf</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-18</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de barbear</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Clidox</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0089321</td><td></td></tr><tr><td>resguardo cirúrgico</td><td>Fisher Scientific</td><td>50587953</td><td>Fabricante: Andwin Scientific 56616018</td></tr><tr><td>Solução Antisséptica Betadine</td><td>Walgreens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3M Vetbond (n-butilcianoacrilato)</td><td>Ciência 3M. Aplicado à Vida</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de mouse hiperandrogénicas para estudar a síndrome do ovário policístico

A Hyperandrogenic Mouse Model to Study Polycystic Ovary Syndrome

Hyperandrogenemia desempenha um papel crítico na função reprodutiva e metabólica em mulheres e é a marca da síndrome do ovário policístico. Desenvolvimento de um modelo de rato de SOP, como magro que imita as mulheres com SOP é clinicamente significativa. Neste protocolo, descrevemos um modelo deste tipo. Inserindo um comprimento de 4 mm de pelota de pó de cristal DHT (dihidrotestosterona) (comprimento total da pelota é 8 mm), e substituí-lo mensalmente, somos capazes de produzir um modelo do rato de SOP, como com dobra de soro níveis 2 DHT mais elevado do que os ratos não implantados com DHT (n-DHT). Observamos uma disfunção metabólica e reprodutiva sem alterar o peso corporal e composição corporal. Enquanto exibindo um elevado grau de infertilidade, um pequeno subconjunto destes ratos fêmeas de SOP, como posso engravidar e sua prole puberdade atrasada e testosterona aumentada de adultos. Este modelo de rato magra como SOP é uma ferramenta útil para estudar a fisiopatologia da síndrome do ovário Policístico e a prole dessas barragens, como síndrome do ovário Policístico.

Os níveis DHT de soro e teste de tolerância à glicose
Os níveis DHT foram medidos de soro coletado por ambos ELISA e por LC-MS de acordo com o protocolo 1.24 – 1,25 e 2.9, 3.0. Os valores absolutos DHT são diferentes entre a espectrometria de massa e ELISA, no entanto, a dobra relativa (cerca 2 vezes) de DHT vs inserção n-DHT é semelhante de ambos os ensaios e através dos experimentos de15,<sup cl...

Descrevemos o desenvolvimento de um modelo de mouse SOP, como magro com diidrotestosterona pelota para estudar a fisiopatologia da síndrome do ovário Policístico e a prole dessas barragens, como síndrome do ovário Policístico.

Um modelo de Mouse hiperandrogénicas para estudar a síndrome do ovário policístico

Hyperandrogenemia plays a critical role in reproductive and metabolic function in females and is the hallmark of polycystic ovary syndrome. Developing a ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da reprodução. E a endocrinologia. E são aplicáveis ao estudo da Síndrome do Ovário Policístico ou PCOS e hiperandrogenismo.A vantagem deste técnico é que ele facilita uma liberação consistente, uniforme e de longo prazo de hormônios de uma maneira econômica e cara. JHUs tratando o procedimento será Ping Xue, um técnico do meu laboratório. Para a preparação da dihidrotestosterona ou dht, use uma lâmina de barbear para cortar um pedaço de tubo de silicone de 15 milímetros.E use uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 20 para injetar silicone adesivo médico de dois a cinco milímetros em uma extremidade do tubo. Deixe a tubulação secar durante a noite. E verifique se há bolhas de ar na extremidade selada.O uso dos equipamentos de proteção individual apropriados despeje pó DHT em um barco de plástico na vazão. Impressione a extremidade aberta do tubo de tampa adesiva no pó. Usando um grande clipe de papel endireitado, tampe o pó para baixo na tubulação, até que o DHT atinja a profundidade experimental apropriada.Em seguida, sele o lado aberto do tubo com silicone durante a noite. Na manhã seguinte, corte cada lado selado para obter um comprimento de dois milímetros de silicone em ambos os lados do DHT e sem pelotas de controle DHT. Em seguida, armazene as pelotas no tubo cônico de 50 mililitros embrulhado com papel alumínio à temperatura ambiente por até três meses.Para a geração de modelos de mouse PCOS equilibre até 20 DHT ou controle pelotas em tubos cônicos separados de 50 mililitros contendo 30 mililitros de 0,9% de soro fisiológico por 24 horas a 37 graus Celsius. No dia seguinte, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé em um camundongo fêmea anestésimo de dois meses de idade e use gaze estéril para administrar povidone-iodo sequencial e 70% de ethynol esfrega na área cirúrgica. Em seguida, faça uma incisão de cinco milímetros através da pele perto do pescoço.E use um trocarte de 10 metros para fazer um túnel de 15 milímetros na direção rostral. Use o trocarte para inserir uma pelota dorsalmente no túnel e selar a incisão com o adesivo cirúrgico. Aproxime manualmente as bordas da ferida com fórceps e use pinceladas suaves para aplicar três finas camadas de filme de adesivo líquido a um centímetro de cada lado das bordas opostas da ferida.Em seguida, coloque o mouse sozinho em uma gaiola em uma almofada de calor com monitoramento até a recumbência total. Substituindo a pelota a cada quatro semanas para manter um nível constante de exposição andrógena. Três dias após a inserção da pelota, use uma pipeta p10 para esguichar dez microlitadores de soro fisiológico estéril na cavidade vaginal e usar a ponta da pipeta para recuperar imediatamente o soro fisiológico.Espalhe a amostra de soro fisiológico da célula vaginal em um slide rotulado. E deixe o soro fisiológico secar à temperatura ambiente. Fixar os slides secos em um recipiente de 100% de ethynol por pelo menos cinco minutos.Em seguida, colori as lâminas por um minuto cada em buffer B e tampão C de um kit de coloração dif-rápido. No final da incubação do buffer C lave os slides com água da torneira por três segundos e seque-os à temperatura ambiente. Para determinar a cíclica estrous, veja os slides sob o objetivo de dez vezes de um microscópio leve.Conte os dias em cada etapa e divida pelo número total de dias para calcular o tempo percentual em cada etapa. Para testar a tolerância à glicose, 20 dias de inserção de DHT, jejue os ratos durante a noite. Pesar os camundongos na manhã seguinte, e usar um glucometer e tiras de teste para medir o nível de glicose de manjericão do sangue da veia da cauda.Injete os camundongos com dois gramas por quilograma de peso corporal de 20% de dextrose. Em seguida, meça o nível de glicose das amostras de sangue da veia da cauda em 15, 30, 60, 90, 120 minutos após a administração de dextrose. Para adquirir descendentes fêmeas de damas inseridas dht, mova o camundongo fêmea para testado na gaiola com um macho fértil comprovado no dia 15, após a inserção de pelotas.Documente o peso corporal das mulheres toda semana para determinar se o rato está grávida. No sétimo dia pós-natal, mergulhe uma ponta de lanceta na pasta de tatuagem e marque cada filhote com uma tatuagem no dedo do pé. Pese os ratos marcados a cada sete dias até os 70 dias de idade.Entre a data pós-natal de 12 a 16 anos, a orelha soca os ratos para numerar de acordo com o sistema como ilustrado na figura. Para distinguir o sexo, examine o lado ventral de cada rato marcado. As fêmeas terão mamilos visíveis.Para coletar amostras de sangue para várias análises a jusante, use uma lanceta para coletar o volume experimental aproximado de sangue entre nove e dez da manhã por sangramento da veia submandibular. E centrifugar as amostras para permitir a coleta de soro. Em seguida, armazene as amostras de soros em tubos microcentrífugas de 1,5 mililitro a menos 80 graus Celsius até sua análise.Para avaliar a puberdade na prole feminina dht, todos os dias após o desmamar no pós-natal dia 21, verifique a abertura vaginal por inspeção visual. E usar calibres para medir a distância ano-genital. Embora os valores absolutos do soro DHT sejam diferentes entre espectrometria de massa e análise de Elisa, a mudança folclórica relativa da inserção DHT versus não-DHT é semelhante tanto quanto entre os ensaios e entre os experimentos.Os níveis de DHT são significativamente aumentados da pré-concepção através da gravidez tanto em DHT quanto em nenhum camundongo DHT. No entanto, os níveis de DHT são duas vezes maiores em camundongos DHT em comparação com nenhum camundongo DHT em pontos de tempo pré-concepcionais e gestacionais. Filhas adultas do DHT apresentam diferenças na função reprodutiva.Por exemplo, a ciclicidade eestrosa interrompida em comparação com as filhas adultas sem DHT experimentando tempos significativamente mais longos em metestrus diestrus e menos tempo em pro-esterosos e esterosos. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de incubar as pelotas por 24 horas antes de serem usadas para a liberação uniforme do hormônio. Após este procedimento, as consequências reprodutivas e metabólicas da exposição ao DHT também podem ser examinadas.Após seu desenvolvimento, este técnico abriu caminho para pesquisadores do campo da endroocronologia e interações fetais maternas estudarem PCOS e o impacto do hiperandrogenismo de baixo nível em camundongos femininos. Não se esqueça que trabalhar com DHT pode ser extremamente perigoso e as precauções como usar luvas e máscara e óculos, e trabalhar em um capuz de biosegurança, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este artigo descreve uma maneira de preparar e inserir pastilhas de diidrotestosterona (DHT) para modelar a Síndrome dos Ovários Policísticos (SOP) em camundongos. O protocolo de exemplo demonstra o procedimento em camundongos usado para estudos reprodutivos e metabólicos.

Tratamento subcutâneo de diidrotestosterona (DHT): modelo de camundongo da síndrome dos ovários policísticos (SOP)

Muitos modelos de roedores de endometriose são limitados pela complexidade técnica, reprodutibilidade e/ou necessidade de animais imunocomprometidos ou ratos repórteres especiais. Apresentamos um sistema simplificado de indução de lesão utilizando qualquer camundongo experimental com um sistema de pontuação objetiva e independentemente verificável e sem necessidade de cirurgia de ovariectomia ou sobrevivência.

Um modelo de murina síndico de endometriose usando ratos naturalmente ciclistas

Este estudo descreve a medição direta da produção de glicose hepática em um modelo de rato com síndrome do ovário policístico usando um rastreador de glicose isotópico estável via veia da cauda em estados ricos em jejum e glicose em conjunto.

Avaliação da Produção de Glicose Hepática em um Modelo de Rato da Síndrome do Ovário Policístico

O hormônio folículo-estimulante (FSH) em vários tecidos e órgãos extragonadais está associado à patogênese de múltiplas doenças. O modelo de camundongos ovariectomizados e tratados com FSH (OVF) pode ser usado para explorar as ações extragonadais do FSH.

Explorando os efeitos independentes do hormônio folículo-estimulante in vivo em um modelo de camundongo

Este estudo apresenta um novo modelo de camundongo projetado especificamente para simular o endometrioma, um subtipo clinicamente significativo de endometriose. Ao utilizar camundongos C57BL / 6J, o modelo visa elucidar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à infertilidade relacionada ao endometrioma, oferecendo uma ferramenta refinada para preencher a lacuna de conhecimento atual em medicina reprodutiva.

Estabelecimento de um modelo experimental de endometrioma em camundongos para estudar sua infertilidade relacionada

Este protocolo introduz uma técnica para induzir modelos de síndrome dos ovários policísticos (SOP) em camundongos por meio da liberação controlada de letrozol usando mini-bombas. Sob anestesia adequada, a minibomba foi implantada por via subcutânea e a SOP foi induzida com sucesso nos camundongos após um certo período de liberação da minibomba.

Uma técnica modificada para induzir a síndrome dos ovários policísticos em camundongos

A validação experimental da atividade do intensificador é melhor abordada pela análise de perda de função. Apresentado aqui é um protocolo eficiente que usa deleção mediada por CRISPR / Cas9 para estudar a regulação específica do alelo da transcrição gênica em células F1 ES que contêm um genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Este protocolo apresenta um método para realizar, de uma única célula quantitativa análise in situ da expressão de proteínas para o estudo especificação das linhagens em embriões de rato pré-implantação. Os procedimentos necessários para a coleta de blastocistos, toda montagem de detecção de imunofluorescência de proteínas, a imagem latente de amostras em um microscópio confocal, e segmentação nuclear e análise de imagem são descritos.

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

Este protocolo descreve o isolamento, cultura e calcificação de células intersticiais do rato-derivado da válvula, um modelo altamente fisiológica em vitro da doença valvar aórtica calcífica (CAVD). Exploração deste modelo de rato facilita a pesquisa CAVD em explorar a célula e os mecanismos moleculares que estão subjacentes a este complexo processo patológico.

Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Aqui, descrevemos um método de imagem de toda a montagem de alta resolução da pele de orelha inteira rato adulto, que nos permite visualizar ramificação morfogênese e padronização de nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes.

Toda a montagem em microscopia Confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese Neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes

Aprenda a criar um modelo murino hiperandrogênico usando pellets de dihidrotestosterona para estudar a síndrome do ovário policístico. Este método permite investigar os efeitos da hiperandrogenia materna na saúde reprodutiva da prole.

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