Name: Incorporação de genética de biossintetizados L-dihidroxifenilalanina (DOPA) e sua aplicação à conjugação de proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprenda a incorporação genética de L-DOPA biossintetizada para conjugação de proteínas usando células E. coli. Este método oferece alta especificidade e eficiência na modificação proteica para aplicações em biologia química.

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Esta pesquisa foi apoiada pelo programa Global de pesquisa de fronteira (NRF-2015M3A6A8065833), e a ciência pesquisa programa básico (2018R1A6A1A03024940) através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo governo da Coreia.

1. plasmídeo construção
<ol><li>Construir um plasmídeo de expressão (pBAD-duplo TPL-GFP-WT) que expressa o gene da TPL de Citrobacter freundii sob o controle de um promotor constitutivo e o gene da proteína verde fluorescente (GFP) com seus6-etiqueta sob o controle da promotor de araBAD. Para pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG, substitua o códon para o site (E90) da DOPA com um códon âmbar (TAG), usando um protocolo de mutagenesis local-dirigido. Os detalhes para a construção deste plasmídeo foi descrito em nosso anterior relatório18.</li>
	<li>Construa um tRNA/aaRS-expressando plasmídeo (pEVOL-DHPRS2)18,19 para a constituição genética de DOPA. pEVOL é um vetor de especial do plasmídeo expressando duas cópias dos genes aaRS com promotores independentes, e as informações detalhadas do plasmídeo são descritas em um anterior relatório19.</li>
	<li>Use kits de preparação de plasmídeo comercialmente disponível para obter alta pureza DNAs plasmideo. Verificar a pureza dos DNAs preparados usando electroforese do gel do agarose, se necessário.</li>
</ol>2. cultura preparação
<ol><li>
Electroporation
	<ol>
<li>Uso o electro-competente Escherichia coli DH10β tensão para esta experiência. Adicione 1 µ l de cada plasmídeo (pEVOL-DHPRS2 e pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG) a 20 µ l de células competentes. Misture-os delicadamente para fazer uma mistura homogênea, com uma pipeta.</li>
		<li>Transfira a mistura para as cubetas de eletroporação. Coloca a cubeta na câmara de eletroporação. Empurrar a cubeta para a câmara para fazer firme cubeta-câmara entre em contato.</li>
		<li>Choque da cubeta, usando 25 µF e 2,5 kV para cubetas de 0,1 cm.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de caldo super ideal escaldado (SOC), contendo 2% (p/v) triptona, 0,5% (p/v) de levedura extrato, NaCl de 10 mM, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2e glicose de 20 mM, para a cubeta e transfira as células para um tubo de cultura. Resgate as células incubando-os durante 1 h a 37 ° C, com agitação.</li>
		<li>Espalhe 10-100 µ l de células de resgatados em uma placa de ágar de caldo (LB) lisogenia contendo 35 cloranfenicol µ g/mL e 100 µ g/mL ampicilina. Incube as células a 37 ° C durante 16 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de cultura starter
	<ol>
<li>Inocule uma única colônia transformada em 5 mL de meio LB contendo antibióticos. Incube a colônia por 12 h a 37 ° C, com agitação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. expressão e purificação de GFP-E90DOPA por um sistema biossintético
<ol><li>
Expressão de GFP-E90DOPA por um sistema biossintético
	<ol>
<li>Transferir a cultura starter (2 mL) para 100 mL de PA-5052 médio20 (50mm Na2HPO4, 50mm KH2PO4, 25mm [NH4]2para4, 2mm MgSO4, 0,1% [w/v] traçar metais, glicerol 0,5% [w/v], 0,05% [w/v] de glicose e aminoácidos 5% [w/v] [pH 7,25]) contendo 35 cloranfenicol µ g/mL, 100 ampicilina µ g/mL, piruvato de 100mm, catecol 10mm, 25mm da amônia e 300 µM ditiotreitol (DTT) seguido por uma incubação a 30 ° C, com agitação.</li>
		<li>Adicionar 2 mL de 0,2% (p/v), L-arabinose quando a densidade óptica (OD) em 550 nm atinge 0,8. Incube a amostra para 12 horas a 30 ° C, com agitação.</li>
		<li>Gire para baixo as células a 11.000 x g por 5 min, desprezar o sobrenadante e congelar o centrifugado a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lise celular
	<ol>
<li>Descongelar o centrifugado no gelo e ressuspender as células em 10 mL de tampão de Lise contendo 50 milímetros NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol 10 mM e 300 mM de NaCl.</li>
		<li>Proceda à sonicação as ressuspensa células no gelo durante 10 min. amplitude de sonication de 80% de utilização com um pulso de 25 s no e 35 s fora.</li>
		<li>Spin para baixo a célula lisada a 18.000 x g a 4 ° C, durante 15 min. transferir o sobrenadante para um tubo fresco para a purificação e descartar a pelota.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cromatografia de afinidade NI-NTA
	<ol>
<li>Adicionar resina de Ni-NTA (ácido nitrilotriacético) (300 µ l de suspensão de resina para uma cultura de 100 mL) de líquido sobrenadante e vincular as proteínas à resina Ni-NTA a 4 ° C, agitando suavemente a suspensão por 1h.</li>
		<li>A suspensão de transferência para uma coluna de polipropileno e lave a resina 3 x com 5 mL de tampão de lavagem, contendo 50 milímetros NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol 20 mM e 300 mM de NaCl.</li>
		<li>Eluir as proteínas 3 x com 300 µ l de tampão de eluição contendo 50 milímetros NaH2PO4 (pH 8.0), imidazol 250 mM e 300 mM de NaCl.</li>
		<li>Determinar a concentração de proteína medindo a absorbância em 280 nm. O coeficiente de extinção (24.630 M-1cm-1) para E90DOPA-GFP em 280 nm foi calculado por uma calculadora de coeficiente de extinção de proteína (por exemplo, https://web.expasy.org/protparam/) e a extinção de forma independente medida coefficiennt (2630 M-1cm-1) para DOPA. Como um método alternativo, use o Bradford proteína ensaio21 para a determinação da concentração de proteína.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. oligomerização de GFP purificado-E90DOPA
<ol><li>Adicionar 1 µ l de sódio periodato de H2O (6mm) (1.0 equiv a GFP-E90DOPA) para uma solução de 20 µ l de GFP-E90DOPA (300 µM) em um tampão fosfato contendo 50 milímetros Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM de NaCl.</li>
	<li>Permitir que a reação de oligomerização proceder a 25 ° C, durante 48 h.</li>
	<li>Analise a mistura de reação por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio) (SDS-PAGE), conforme descrito na etapa 6.</li>
</ol>5. conjugação de GFP-E90DOPA com uma sonda Alkyne por SPOCQ
<ol><li>Adicionar 1 µ l do azadibenzocyclooctyne Cy5.5-lig (Cy5.5-Andrade)22 em H2O (4,0 mM) (10 equiv a GFP-E90DOPA) para uma solução de 20 µ l de GFP-E90DOPA (20 µM) em um tampão fosfato contendo 50 milímetros Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM de NaCl.</li>
	<li>Adicionar 1 µ l de sódio periodato de H2O (400 µM) (1.0 equiv a GFP-E90DOPA) a mistura de reacção.</li>
	<li>Permitir que a reação de SPOCQ, proceder-se a 25 ° C, durante 1 h. Se for usada uma sonda sensível à luz, cobri o recipiente de reação com folha de alumínio.</li>
</ol>6. purificação da GFP rotulada
<ol><li>Dilua a mistura reacional SPOCQ pela adição de um tampão de fosfato, contendo 50 milímetros Na2HPO4 (pH 8.0) e 300 mM de NaCl, até 500 µ l.</li>
	<li>Transferi a solução diluída para uma coluna de rotação do filtro centrífugo. Centrifugue a coluna de centrifugação a 14.000 x g a 4 ° C por 15 min e descartar o escoamento. Repita este passo 3 x para remover qualquer excesso Cy5.5-Andrade.</li>
	<li>Transferi a amostra purificada da coluna de rotação para um tubo de 1,5 mL microcentrifuge.</li>
	<li>Em alternativa, efectuar uma purificação pela diálise contra a mesma reserva.</li>
	<li>Armazenar o GFP purificado a 4 ° C.</li>
</ol>7. SDS-PAGE análise e digitalização de Gel de fluorescência
<ol><li>Preparar amostras de proteínas para análise de SDS-PAGE, adicionando 5 µ l de tampão de amostra de proteína (ver Tabela de materiais) e 2 µ l de TDT (1,00 M), para µ l 13 de purificado, ou bruto, rotulado de GFP (13,6 µM ou 0,38 mg/mL). Para uma análise de GFP oligoméricas, use uma concentração mais elevada de GFP (67,8 µM ou 1,9 mg/mL). Desnature as proteínas incubando-os a 95 ° C por 10 min.</li>
	<li>Coloque uma fita de gel de SDS-PAGE de Bis-Tris 4% - 12% (gel comprado, do premade cassettes) para a célula de eletroforese e adicionar um buffer de execução (veja a Tabela de materiais). Carrega as amostras da proteína e um marcador de peso molecular. Execute a eletroforese por 35-40 min a 200 V. Nota: Evite qualquer exposição das amostras de proteínas à luz através da realização de todos os processos no escuro, para minimizar a foto-branqueamento da sonda fluorescente.</li>
	<li>Utilize um scanner de fluorescência para a imagem latente de fluorescência. Enrole um gel de eletroforese de proteína e colocá-lo em um scanner de fluorescência. Digitalizar o gel usando uma configuração de comprimento de onda apropriado. Para Cy5.5, selecione o modo de Cy5 fornecido no software do scanner.</li>
	<li>Manche o gel com uma proteína comercial reagente de coloração.</li>
</ol>8. MALDI-TOF MS análise por digestão de tripsina
<ol><li>Incube a 100 µ l de GFP-E90DOPA (2,2 mg/mL ou 80 µM) em um buffer contendo 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0,1% (p/v) SDS purificado e 25 mM DTT a 60 ° C, durante 1 h.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de Iodoacetamide em H2O (IAA, 4.0 M) (500 equiv a GFP-E90DOPA) para a solução de GFP-E90DOPA purificada (80 µM) a mesma reserva. Incube a mistura a 25 ° C por 30 min com proteção da luz.</li>
	<li>Digerir a amostra de GFP-E90DOPA adicionando tripsina (proporção 1: 100 de protease-para-substrato-proteína [w/w]) e incubar a mistura a 37 ° C por 4 h.</li>
	<li>Purifica a amostra digerida peptídeo usando um método padrão do desalting com colunas de rotação C18 .</li>
	<li>Analise os peptídeos digeridos pelo protocolo relatado por laser assistida por matriz dessorção/ionização tempo-de-voo espectrometria de massa (MALDI-TOF MS) usando ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmicos (CHCA) como uma matriz de23.</li>
</ol>

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<li>Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+copper-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded copper-free click chemistry.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50 (17), 3878-3881 (2011).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (6), 2898-2901 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste protocolo, a biossíntese e incorporação directa do DOPA são descritos. A célula bacteriana usada neste método pode sintetizar um aminoácido adicional e usá-lo como um bloco de construção natural para a síntese de proteína. A incorporação genética de aminoácidos não naturais tem sido uma tecnologia-chave para o desenvolvimento do organismo natural com um código genético expandido. No entanto, este método tem sido tecnicamente incompleto e está sendo modificado para melhorar a eficiência da incorporação e minimizar a...

DOPA é um aminoácido envolvido na biossíntese de catecolaminas em animais e plantas. Este aminoácido é sintetizado a partir de Tyr tirosina hidroxilase e oxigênio molecular (O2)1. Porque DOPA é um precursor da dopamina e pode permear a barreira sangue - cérebro, ela tem sido usada no tratamento da doença de Parkinson2. DOPA também é encontrada em proteínas de adesão de mexilhão (mapas), que são responsáveis para as propriedades adesivas de mexilhões em circunstâncias molhadas3,4,5,6,7. Tyr é inicialmente codificado nas posições onde DOPA é encontrada em mapas e em seguida é convertida em DOPA pela tyrosinases8,9. Devido às suas propriedades bioquímicas interessantes, DOPA tem utilizou uma variedade de aplicações. O grupo de dihydroxyl de DOPA é quimicamente propenso à oxidação, e o aminoácido é facilmente convertido em L-dopaquinone, um precursor de melaninas. Devido à sua alta eletrofilicidade, L-dopaquinone e seus derivados utilizámos para reticulação e conjugação com tióis e aminas10,11,12,13. 1,2-quinonas também podem funcionar como um dieno para reações de cicloadição e têm sido usados para bioconjugation por estirpe-promovido oxidação controlada cyclooctyne-1,2-quinona (SPOCQ) cicloadição14. Além disso, o grupo de dihydroxyl pode quelato íons metálicos como Fe3 + e Cu2 +e proteínas contendo DOPA têm sido utilizadas para a entrega da droga e do íon do metal sensoriamento15,16.
DOPA foi geneticamente incorporado em proteínas usando um aminoacil-tRNA ortogonal (aa-tRNA) e aminoacil-tRNA sintetase (aaRS) par17 e usado para proteína conjugação e reticulação10,11, 12,13. Neste relatório, são descritos os resultados experimentais e protocolos para a constituição genética de DOPA biossintetizados de matérias-primas baratas e suas aplicações para bioconjugation. DOPA é biossintetizados usando um TPL e a partir de catecol, piruvato e amônia em Escherichia coli. O biossintetizados DOPA é diretamente incorporado proteínas expressando um par aa-tRNA e aaRS evoluiu para DOPA. Além disso, a proteína biossintetizados contendo DOPA site-specifically está conjugada com uma sonda fluorescente e quitosana para produzir oligómeros de proteína. O presente protocolo será útil para os cientistas de proteína, a biossintetize proteínas mutantes contendo DOPA e conjugar as proteínas com testes bioquímicos ou drogas para aplicações industriais e farmacêuticas.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Construção de plasmídeo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG</td><td></td><td></td><td>opcionalmente contém o códon de parada âmbar (TAG) em uma posição desejada. Ko, W. et al. Marcação de anticorpos eficiente e específica do local por cicloadição de azida-alcino promovida por cepa. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>Plasmídeo pEvol-DHPRS2</td><td></td><td></td><td>1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., e Schultz, P. G. Um sistema aprimorado para mutagênese de aminoácidos não naturais em E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Incorporação genética de l-dihidroxifenilalanina (DOPA) biossintetizada por uma tirosina fenol-liase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).</td></tr><tr><td>DH10&beta;</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression Host Plasmid</td></tr><tr><td>Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pacote</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Intron biotechnology</td><td>32034</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Caldo</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500 g</td></tr><tr><td><forte>2. Preparação da cultura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>2.1) Eletroporação</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro pulsador&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta micro pulsadora</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>Folga do eletrodo de 0,1 cm, pacote de 50</td></tr><tr><td>Ampicilina Sódica</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Ágar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC médio</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td><forte>3. Expressão e purificação de GFP-E90DOPA por sistema biossintético</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.1 Expressão de GFP-E90DOPA por sistema biossintético</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Arabinose, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Pirocatecol, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1387</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Sulfato de amônio, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0943</td><td>500 gramas</td></tr><tr><td>ácido pirúvico, 98%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13875</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico, anidro, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0891</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fofato de potássio, monobásico, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>P1127</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio, anidro, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>M0146</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>D(+)-Glicose, anidro, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>D0092</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Glicerol, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>G0269</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Mistura de metais traço a5 com co</td><td>Sigma</td><td>92949</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>L-Prolina, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>P1257</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-fenilalanina, 98,5%</td> <td>SAMCHUN</td><td>P1982</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-triptofano</td><td>JUNSEI</td><td>49550-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-arginina, 98%</td> <td>SAMCHUN</td><td>A1149</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Glutamina, 98%</td><td>JUNSEI</td><td>27340-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Asparagina monohidratada, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>A1198</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>JUNSEI</td><td>73190-0410</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Cloridrato de L-Histidina monohidratado, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0604</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Treonina, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T2938</td><td>25 g</td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>JUNSEI</td><td>87070-0310</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de glicina, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>G0286</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de ácido L-glutâmico, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>G0233</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de L-alanina, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>A1543</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de L-isoleucina, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>I1049</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de L-valina, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>V0088</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de L-serina</td><td>SAMCHUN</td><td>S2447</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de ácido L-aspártico</td><td>SAMCHUN</td><td>A1205</td><td>25 g</td></tr><tr><td>de monocloridrato de L-lisina, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>L0592</td><td>25 g</td></tr><tr><td><forte>3.2 Lise celular</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>imidazol, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1kg</td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico, 98%</td> <td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, 99%</td> <td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td></td></tr><tr><td>Processador ultrassônico de 1 kg - 150 microlitros a 150 mililitros</td><td>SONIC & MATERIAIS</td><td>VCX130</td><td></td></tr><tr><td>3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resina</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Coluna de polipropileno</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/pacote, capacidade de 1 mL</td></tr> <tr><td>4. Oligomerização de GFP-E90DOPA&nbsp; Purificado < / forte ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>periodato de sódio, 99,8 e</td><td>Acros</td><td>419610050</td><td>5 g</td></tr><tr><td><forte>5. Conjugação de GFP-E90DOPA com uma sonda de alcino por ciclooctileno controlado por oxidação promovida por tensão&ndash; Cicloadição de 1,2-quinona (SPOCQ)&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1mg</td></tr><tr><td><forte>6. Purificação de filtros centrífugos rotulados GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0,5 mL</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/pacote, capacidade de 500ul</td></tr><tr><td>7. Análise SDS-PAGE e Varredura de Gel de Fluorescência</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99,5</td>% <td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES running buffer</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE géis</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12 bem</td></tr><tr><td>Coomassie Azul Brilhante R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>G:BOX Chemi Fluorescente & Sistema de imagem quimioluminescente</td><td>Syngene</td><td></td><td>G BOX Chemi XT4</td></tr><tr><td>8. Análise MALDI-TOF MS por digestão de tripsina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8.1 Preparação da amostra de peptídeo digerido por digestão de tripsina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Ácido clorídrico, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>de sal de sódio de sulfato de dodecil, 85%</td><td>SAMCHUN</td><td>D1070</td><td>250 g</td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Tripsina Protease, Grau MS</td><td>Thermofisher</td><td>90057</td><td>5 x 20 &micro; g/pack</td></tr><tr><td>Colunas de spin C-18</td><td>Thermofisher</td><td>89870</td><td>25/pack, 200 &micro; L capacidade</td></tr><tr><td><forte>8,2 Análise do peptídeo digerido por MALDI-TOF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitirila, 99,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>A0125</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>&alfa;-ciano-4-hidroxicinâmico ácido</td><td>Sigma</td><td>C2020</td><td>10 g</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1666</td><td>100 g</td></tr><tr><td>MTP 384 placa-alvo alvos BC de aço retificado</td><td></td> Espectrômetro maciço <td>Bruker</td> 8280784 <td></td></tr><tr><td>Bruker Autoflex da velocidade MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

incorporação de genética de biossintetizados l-dihidroxifenilalanina (dopa) e sua aplicação à conjugação de proteína

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

L-dihidroxifenilalanina (DOPA) é um aminoácido encontrado na biossíntese de catecolaminas em animais e plantas. Devido às suas propriedades bioquímicas particulares, o aminoácido tem múltiplos usos em aplicações bioquímicas. Este relatório descreve um protocolo para a constituição genética de biossintetizados DOPA e sua aplicação à conjugação de proteínas. DOPA é biossintetizados por uma tirosina fenol-liase (TPL) de catecol, piruvato e amônia, e o aminoácido é diretamente incorporado em proteínas pelo método de incorporação genética usando um aminoacil-tRNA evoluída e par de aminoacil-tRNA sintetase. Este sistema de incorporação directa eficientemente incorpora DOPA com pouca incorporação de outros aminoácidos naturais e com melhor rendimento de proteína do que o anterior sistema de incorporação genética para DOPA. Conjugação de proteínas com proteínas contendo DOPA é eficiente e site-specific e mostra sua utilidade para diversas aplicações. Este protocolo fornece os cientistas de proteína com procedimentos detalhados para o eficiente biossíntese de proteínas mutantes contendo DOPA em sites desejados e sua conjugação para aplicações industriais e farmacêuticas.

O sistema de expressão para a incorporação directa do DOPA biossintetizados de um TPL é mostrado na Figura 1. Os genes para o par aa-tRNA e aaRS evoluído são colocados em um plasmídeo e o gene da GFP (GFP-E90TAG) que contém um códon âmbar na posição 90 situa-se em mais um plasmídeo para avaliar a incorporação de DOPA por fluorescência de GFP. O gene TPL é colocado no mesmo plasmídeo de expressão contendo o gene da GFP e constitutivamente expressa para maximiz...

Aqui, apresentamos um protocolo para a incorporação genética de L-dihidroxifenilalanina biossintetizados a partir de matérias-primas simples e sua aplicação à conjugação de proteínas.

Incorporação de genética de biossintetizados L-dihidroxifenilalanina (DOPA) e sua aplicação à conjugação de proteína

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia química, como modificação de proteínas, conjugação e sistema biossintético. A principal vantagem desta técnica é que a L-DOPA pode ser citada de forma específica e eficiente, introduzindo as proteínas Tyr usando o sistema biossintético. Após a construção do plasmídeo de expressão, defina as células de cepa beta E.coli DH10 eletrocompetentes para este procedimento.Adicione um microlitro de cada DNA de plasmídeo a 20 microlitros de células competentes. Use uma pipeta para misturar suavemente. Transfira esta mistura para cubetas de eletroporação de 0,1 centímetro.Coloque uma cubeta cheia na câmara de eletroporação, certificando-se de que haja um contato firme com a câmara da cubeta. Choque a cubeta em 25 microfarad e 2,4 quilovolts. Em seguida, adicione um mililitro de meio SOC pré-aquecido.Transfira as células para um tubo de cultura. Incubar a 37 graus Celsius por uma hora agitando para resgatar as células. Espalhe de 10 a 100 microlitros das células resgatadas em uma placa de ágar caldo de lisogenia que contenha 35 microgramas por mililitro de cloranfenicol e 100 microgramas por mililitro de ampicilina.Incube

genetic-incorporation-biosynthesized-l-dihydroxyphenylalanine-dopa

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Aprenda a incorporação genética de L-DOPA biossintetizada para conjugação de proteínas usando células E. coli. Este método oferece alta especificidade e eficiência na modificação proteica para aplicações em biologia química.

Incorporação de genética de biossintetizados L-dihidroxifenilalanina (DOPA) e sua aplicação à conjugação de proteína

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