Name: Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a medir o consumo de oxigênio mitocondrial hepático e a cinética de vazamento de prótons para estimar a respiração mitocondrial em gado leiteiro Holstein. Este método permite avaliar a eficiência energética celular.

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Esta pesquisa foi apoiada pela Alltech e USDA Hatch fundos através do centro de Sanidade Animal de comida na UC Davis School de medicina veterinária.

Todos os métodos, protocolo e estudos aqui descritos foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Califórnia, Davis.
1. a obtenção de uma biópsia do fígado de uma vaca leiteira de Holstein
Nota: Uma biópsia do fígado deve ser realizada por um veterinário licenciado. Biópsias do fígado podem ser executadas no site onde se situam as vacas leiteiro. Vacas leiteiras em lactação podem continuar a ser ordenhada normalmente e leite não precisa ser retirada da fonte de alimentos antes ou após o procedimento. É recomendável que pelo menos 4 pessoas são necessários para realizar a biópsia do fígado em uma vaca leiteira: um veterinário para realizar a biópsia, um domador de animais repousar à anca da vaca para proteger a área da biópsia e veterinário, um técnico de laboratório do lado de fora da caneta de arqu er ferramentas, materiais e biópsia da amostra e para o veterinário e mantêm a área limpa, que pode ser na traseira de um veículo (Figura 1) e um técnico para recuperar a amostra de fígado e começar o isolamento mitocondrial.
<ol><li>Um mês antes de biópsias hepáticas, dar vacas uma vacinação de clostridia. Crie pacotes cirúrgicos por toalhas cirúrgicas de autoclavagem, instrumento de biópsia, titulares de bisturi e equipamento cirúrgico.</li>
	<li>Um dia antes da biópsia do fígado, injete a vaca com cloridrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg de peso corporal por via subcutânea no pescoço. Monitorar a temperatura de vaca, a ingestão e fecais Partituras para usar como uma linha de base para a função normal.</li>
	<li>Criar o manitol 220mm mitocôndrias isolamento mídia (MIM) containining, sacarose 70 mM, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA e 0,1% (p/v) ácido graxo livre BSA, pH 7,4 a 4 ° C. Serão necessários aproximadamente 30 mL por amostra.</li>
	<li>Conter a vaca fisicamente utilizando uma chave de braço com um halter conforme necessário (Figura 2). Usando o cabresto, amarre a cabeça para o lado esquerdo do poste. Se necessário, um contenção química (xilazina cloridrato 100mg/mL IV em 0.010-0.015 mg/kg de peso corporal) pode ser usado.</li>
	<li>A área da biópsia é encontrado no espaço de intercostal direito 10 - 11 (Figura 3). Desenhe uma linha reta de coxae o tubérculo certo ao ponto do ombro direito. No local da biópsia é onde esta linha cruza-se com o espaço intercostal 10-11. Esterilize a área da vaca a biopsar cortando uma área quadrada de 10 cm (Figura 4). Lave a área com esfoliante de providone de 10% (Figura 5) usando um movimento circular. Pulverizar a área com solução de etanol 70% (Figura 6). Repetição de lavagens de providone e etanol. Nota: O fígado está em uma posição ligeiramente diferente em vacas leiteiras Holstein, em comparação com bovinos de corte.</li>
	<li>Injete lidocaína a 2% HCl (10-15 mL) localmente à área para fornecer anestesia da pele e músculo subjacente e do tecido conjuntivo (Figura 7). Repeti providone e lavagens de etanol 70%. Nota: As terminações nervosas estão na pele e músculos, mas os órgãos internos não, tão somente um local anesthestic é necessária. No máximo, a vaca deve apenas sentir alguma pressão e sem dor durante o procedimento de biópsia.</li>
	<li>Faça uma facada de 1-2cm-incisão através da pele do espaço intercostal 10-11 (Figura 8). Passar de um instrumento de biópsia do fígado bovino Schackelford-Courtney através da pele e direcionar o instrumento em uma ligeira direção cranial, continuando através do diafragma e o fígado (Figura 9, Figura 10). Obter uma amostra de 1g do fígado e retire o instrumento (Figura 11). Feche a pele com a colocação de sutura (Figura 12).</li>
	<li>Colocar a amostra de fígado em um tubo cônico com suficiente de MIM para cobrir a amostra, no gelo para isolamento de mitocôndrias imediata</li>
	<li>Incisão de seleção para qualquer vermelhidão, inchaço, calor, ou dor dentro de 24 horas da biópsia e injetar a vaca com cloridrato de Ceftiofur 0,044 mL/kg de peso corporal por via subcutânea no pescoço uma vez por dia durante os próximos 3 dias (Figura 13). Monitore temperatura da vaca, a ingestão e escores fecais diariamente por 1 semana após a biópsia do fígado. Se desenvolve uma febre, continue antibióticos a critério do veterinário. Nota: Se uma vaca está exibindo sinais de dor, tais como chutar para o local da incisão, recumbancy, vermelhidão, calor ou reação ao toque dentro de 1h após a biópsia do fígado, uma injeção de IV 1 mg/kg de peso corporal de flunixin meglumine pode ser usada para aliviar a dor e inflamação. Uma segunda injeção pode ser administrada se necessário.</li>
	<li>Remova suturas 7 dias após a biópsia.</li>
</ol>2. isolar mitocôndrias de fígado de vaca leiteira
<ol><li>Logo que possível após a amostra de fígado é retirada da vaca, lave a amostra de fígado em MIM (etapa 1.3) para remover as células vermelhas do sangue e picar finamente a amostra com uma tesoura. O fígado deve ser picado num copo gelado contendo suficientes meios de isolamento para manter o tecido úmido.</li>
	<li>Coloque o fígado picado dentro de um frasco de vidro de 30 mL com um pilão de teflon de afastamento 0,16 mm incubada em gelo e contendo a MIM (1:4 w/v).</li>
	<li>Homogeneizar a amostra de fígado em um pilão de teflon em 500 rpm por um minuto com 4 ciclos/min. Nota: O fígado homogeneizado é mantido em um copo cheio de gelo em MIM durante todo o processo, e todas as seguintes etapas de centrifugação são concluídas em 4 ° C</li>
	<li>Homogeneizado em 500 x g durante 10 minutos de centrifugação, descartar a pelota, transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga refrigerada e centrifugar o sobrenadante resultante a 10.000 x g durante 10 minutos obter a pelota mitocondrial.</li>
	<li>Resuspenda e lave o pellet em 10 mL de MIM com ácido graxo livre BSA e centrifugar a 8100 x g durante 10 min. Discard sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda e lave o pellet em 10 mL de MIM sem ácido graxo livre BSA e centrifugar a 8100 x g durante 10 min. Discard sobrenadante.</li>
	<li>Suspender o sedimento em 200 µ l de mídia de isolamento e Coloque gelo até utilizado para consumo de oxigênio e ensaios cinéticos de vazamento de próton.</li>
	<li>Determine a concentração da proteína, da suspensão da pelota (diluição 1/100), usando o kit de (BCA) ácido Bicinchoninic acordo com o protocolo do fabricante com BSA como padrão. Toda proteína é considerada proteína mitocondrial.</li>
</ol>3. medição do consumo de oxigênio mitocondrial (estado 4 3 e estaduais)
<ol><li>Criar mídia de consumo de oxigênio (OCM) de 120 mM KCl, 5mm KH2PO4, 5mm MgCl2, 5mm Hepes e 1mm EGTA, pH 7,4 a 30 ° C, com 0,3% desengordurada BSA. Serão necessários aproximadamente 3 mL por amostra. Também prepare uma solução de 8 oligomicina μg/mL em etanol.</li>
	<li>Incubar a OCM a 30 ° C. Configure o eletrodo de câmara, bomba e oxigênio de respiração de acordo com as instruções do fabricante (sistema oxygraph). O software de oxygraph já deve estar instalado no computador.</li>
	<li>Coloque 1 mL de OCM na câmara de respiração e agite vigorosamente. Isso ajudará a garantir que a solução se torna saturada com ar.</li>
	<li>Adicionar a proteína de 0,35 mg de proteína mitocondrial para a câmara de respiração e manter a temperatura a 30 ° C.</li>
	<li>Registrar o consumo de oxigênio por aproximadamente 5 min. A concentração de oxigênio de registros de sistema de oxygraph assim como a respiração aumenta, a concentração de oxigênio diminui. Quando o consumo de oxigênio se torna constante (uma linha reta decrescente), consumo de oxigênio de registro (inclinação da linha = concentração de oxigênio/hora). Este é o consumo de oxigênio de linha de base.</li>
	<li>Adicionar 1,25 µ l da solução de rotenona 4mm para inibir o complexo eu e em seguida, adicione 5 µ l de solução 1 M de succinato para atingir uma concentração final de succinato de 5mm na câmara respiratória. Esta é a respiração do estado 4.</li>
	<li>Adicione 1 µ l de solução de ADP 100 mM para atingir uma concentração final de 100 μM na câmara de respiração. Concentração de oxigênio vai diminuir (respiração aumentada) e, em seguida após aproximadamente 5 min torna-se uma linha reta. Registrar o consumo de oxigênio (inclinação da linha = concentração de oxigênio/hora). Esta é a respiração do estado 3.</li>
	<li>Opcional: No final da corrida, adicione FCCP (volume total de 0,2 μM) para induzir a respiração máxima. Grave a respiração por cerca de 5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro. Este é o consumo máximo de oxigênio.</li>
	<li>Calcular o controle respiratório Ratio (RCR) usando a equação de estado 3 consumo de oxigênio / estado 4 consumo de oxigênio.</li>
	<li>Aspire todas as soluções fora da câmara de respiração. Lave a câmara várias vezes com água desionizada.</li>
</ol>4. medir o potencial de membrana mitocondrial (MMP) e força motriz de prótons (PMF)
<ol><li>Prepare a solução de 80 nigericin ng/mL em etanol. Nota: Estes produtos químicos são dissolvidos em etanol, e todo esforço deve ser feito para limitar a quantidade de etanol que é adicionada a menos de 1 μL, desde que o etanol pode desacoplar o sistema de transporte de elétrons e causar disfunção mitchondrial.</li>
	<li>Após enxaguar cuidadosamente a câmara com água desionizada, coloque 1 mL da OCM na câmara de respiração e agitar vigorosamente com uma barra de agitação magnética. Isso ajudará a garantir que a solução se torna saturada com ar. Adicione o eletrodo metil-trifenil-do phosphonium (TPMP +) sensível para instalação de câmara. TPMP + eletrodo deve ser ligado a um medidor de pH e valores são lidos a partir do medidor de pH.</li>
	<li>Adicione 0,35 mg de proteína mitocondrial para a câmara de respiração.</li>
	<li>Adicione 1,25 µ l da solução de rotenona 4mm para inibir a respiração do complexo I. registro para 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro.</li>
	<li>Adicione 0,56 μL de solução de oligomicina 8 μg/mL para uma concentração final de 2,8 µ g oligomicina 0,35 mg de proteína mitocondrial para inibir a utilização da ADP. Grave a respiração durante 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro.</li>
	<li>Adicione solução de nigericin 0.112 μL 80 ng/mL para abolir o gradiente de pH através da membrana mitocondrial interna. Grave a respiração durante 2-5 min (aproximadamente). Quando o consumo de oxigênio torna-se consumo de oxigênio constante e de registro. Nota: Rotenona e oligomicina são usados para bloquear o transporte de elétrons da cadeia no complexo I e a ATP sintase, respectivamente. Nigericin é adicionado para converter do transmembrane H + gradiente um gradiente K + que pode ser medido com um eletrodo.</li>
	<li>Prepare uma curva padrão para TPMP + pela adição de 5 µ l de solução TPMP + 10 mM para a incubação mitocondrial. Repita este passo quatro vezes mais até uma concentração total de 2,5 μM TPMP + foi adicionada.</li>
	<li>Inicie a respiração, adicionando 5 μL de succinato de 1M para a câmara.</li>
	<li>Gravar a respiração até que você tenha conseguido um traço estável e titula-se em seguida o sistema adicionando malonato. Adições de malonato devem ser 0,5 µ l, 1 µ l, 1,5 µ l, µ l 3.0, 6,0 µ l, 9.0 µ l, então 12,5 µ l de 0,1 mM malonato solução para alcançar adições sucessivas de malonato concentrações em câmara úmida de 0.1, 0.2, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 e 2,5 mM.</li>
	<li>Colete dados de dois eletrodos (oxigênio e TPMP+). Software de aquisição de dados do sistema de oxygraph pode ser usado para coletar medições simultâneas de consumo de oxigênio mitocondrial e potencial de membrana mitocondrial e observar alterações no consumo de oxigênio em tempo real. A Figura 14 mostra como o sistema de oxygraph registra o consumo de oxigênio no decorrer do experimento.</li>
	<li>Calcule MMP na mV com base na equação de Nernst: MMP = 61,5 log ([TPMP +] adicionado – external [TPMP +]) correção de ligação x TPMP+ / (x 0,001 mg de proteína/mL x TPMP [+]) Uma correção de vinculação TPMP + 0,4 µ l/mg de proteína mitocondrial-1 é usada. Cálculo de exemplo baseado em concentrações no protocolo: MMP = 61,5 x log (5 µM – 2 µM) x 0,4 / (0.001 x 0,35 mg proteína mitocondrial/mL x 2 µM) MMP = 198.9 mV</li>
	<li>Estimativa do DPP plotando um gráfico de consumo de MMP vs oxigênio (Figura 15). PMF é relatado como o consumo de oxigênio em um potencial de membrana de 165 mV. Nota: Titulada a cadeia de transporte electrónico com malonato (0,1 a 2,5 mM) mostra a resposta cinética do vazamento de protões para MMP. Em seguida, MMP a conspirar contra o consumo de oxigênio determina a cinética de vazamento do próton. PMF é determinado pelo cálculo do consumo de oxigênio em um potencial de membrana comum (165 mV).</li>
	<li>No final da última corrida da amostra, adicione FCCP (volume total de 0,2 μM) para induzir a respiração máxima e liberar TPMP + para correção de linha de base.</li>
	<li>Aspire todas as soluções fora da câmara de respiração. Lave a câmara várias vezes com água desionizada. No final do dia, a câmara deve também ser lavada várias vezes com etanol.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O ponto mais crítico no protocolo é obter uma amostra representativa de tecido hepático e começando o isolamento da mitocôndria, logo que possível após a biópsia. Variação nas medições de respiração é baixa (tabela 1) devido a um tempo de transporte curto de vaca para laboratório. Para reduzir o tempo de transporte, foi instituído um pequeno laboratório no escritório da leiteria, e amostras de fígado foram levadas para o laboratório de escritório como cada uma foi coletada para que as mitocôndrias foram ...

As mitocôndrias são muito sensíveis ao estresse e seu ambiente celular pode contribuir para uma ampla variedade de doenças metabólicas. Consumo de oxigênio e vazamento de prótons na mitocôndria são indicadores de saúde de mitocôndrias. Os métodos descritos neste papel estimativa mitocondrial eficiência de energia usando RCR baseiam no consumo de oxigênio, com e sem vazamento de próton. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes1. Mudanças no consumo e próton vazamento de oxigênio podem identificar a disfunção mitocondrial, o que contribui para doenças metabólicas e resulta em eficiência energética diminuída. Esses métodos também podem ser usados para examinar o efeito de diferentes tratamentos na respiração mitocondrial. O objectivo geral de medição de consumo de oxigênio mitocondrial e cinética de vazamento de próton é para avaliar a função mitocondrial e eficiência energética.
Disfunção mitocondrial hepática tem sido associada com várias doenças no gado leiteiro. A capacidade do metabolismo celular para alternar entre combustíveis carboidrato e lipídios quando confrontados com um déficit de energia no início da lactação é influenciada pelo número e função da mitocôndria na célula2. Defeitos na capacidade das mitocôndrias de adaptar-se a um aumento da demanda de energia e aumento da β-oxidação podem levar ao acúmulo de lipídios intracelulares associados com resistência à insulina e podem levar à formação de esteatose hepática em vacas leiteiras de início da lactação. Mitocôndrias, como local de produção do corpo de cetona e uso, podem desempenhar um papel chave em cetose em vacas leiteiras3. Falta de mitocôndrias ou disfunção mitocondrial afetará a disponibilidade de combustível para a periferia e reflectir-se em mudanças no consumo de oxigênio ou RCR.
Alterações de consumo de oxigênio mitocondrial em resposta à inflamação. Sete dias de idade frangos foram aleatoriamente a um grupo de infectados com maxima de Eimeria e um grupo de controle4. Frangos de corte que não sofreu desafio de coccidiose tinham menor consumo de oxigênio devido ao vazamento de próton e RCR superior indicando que mitocôndrias hepáticas respondem a um desafio imune por crescente fuga de próton. Durante a fuga de próton e reativa produção de espécies de oxigênio foi considerada um sinal de disfunção da membrana mitocondrial e prejudicial para a eficiência energética, agora sabe-se que é importante para a importação de proteínas e cálcio em mitocôndrias5 e para a geração de calor1.
Vazamento de elétrons da cadeia respiratória faz mitocôndrias suscetíveis à produção de espécies reativas de oxigênio e danos oxidativos às proteínas da membrana mitocondrial, lipídios e DNA mitocondrial. Como idade de mitocôndrias, dano pode acumular-se especialmente ao DNA mitocondrial, causando mais de disfunção no metabolismo mitocondrial6 e maior suscetibilidade da vaca a doença. Na prática, muitos animais de pecuária são alimentados com altos níveis de suplementos tais como Cu, Zn e Mn para impulsionar a função antioxidante. No entanto, alimentando a altos níveis de Cu, Zn e Mn diminuição da produção de leite e aumentaram do consumo de oxigênio devido a próton vazamento (respiração estado 4)7.
Pesquisas anteriores sobre o papel da função mitocondrial em eficiência energética em gado centrou-se sobre as mudanças no consumo de oxigênio mitocondrial e vazamento de próton. Poucos estudos foram publicados no gado leiteiro e a maioria dos jornais comparam a eficiência de produção sob a forma de consumo de ração residual (RFI) para a função mitocondrial em bovinos de corte. Variabilidade na respiração mitocondrial taxas foram examinadas através da medição o estado 3, estado 4 e RCR em fígados de carne de vaca em lactação e vacas em lactação de Holstein vacas (Angus, Brangus e Hereford)8. Os pesquisadores não encontrou qualquer correlação na respiração mitocondrial com crescimento ou ordenha traços dos bovinos, mas fizeram relatório uma correlação entre a respiração mitocondrial e traços para Holsteins de ordenha. Em dois estudos, RFI foi comparado em bovinos de corte para taxas de respiração mitocondrial (estado 3, estado 4 e RCR) no músculo mitocôndrias9,10. Taxas de respiração mitocondrial alterada em resposta a DMI e taxas baixas foram associadas com novilhos de carne menos eficientes. Em outro estudo, RFI de novilhos de touros de alta ou baixos RFI foram comparados com as taxas de respiração mitocondrial e cinética de vazamento de protões entre os dois grupos de descendência11. As diferenças foram devido ao ganho confirmando a conclusão de que a ganhar faz não respiração mitocondrial impacto em bovinos de corte.
Neste trabalho, um experimento para examinar o fígado RCR em resposta à alimentação 3 minerais antioxidante para gado de leite em lactação ilustra o uso de métodos para medir consumo de oxigênio durante 4 do estado e estado 3 respiração e PMF.

<table><tbody><tr><td><forte>Biópsia hepática</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instrumento de biópsia de fígado bovino Schackelford-Courtney</td><td>Sontec Instruments Englewood CO</td><td>1103-904</td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de sutura</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Incluídas com Sutura</td></tr><tr><td>Bisturis</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S2896 / S2646</td><td># para cabo e lâminas</td></tr><tr><td>Toalhas de cirurgia</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-6667</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de falcão 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Pinças</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z168750</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-314387</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de injeção (22, 2 1/2)</td> <td>VWR</td><td>MJ8881-200342</td><td></td></tr><tr><td>Cow halter</td><td>Tractor Supply Co.</td><td></td><td></td>101966599</tr><tr><td>Algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-102</td><td></td></tr><tr><td>quadrados de gaze de algodão (4x4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura médica</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coccidiosis Vaccine 0.75 bottle/cow</td><td></td><td></td><td>Fornecido por Vacina</td></tr><tr><td></td><td></td> Veterinária<td>Clostridia</td><td>Fornecida pelo Veterinário</td></tr><tr><td>Antibióticos de biópsia hepática excenel 2 cc/100 lbs por 3 dias</td><td></td><td></td><td>Fornecido pelo Veterinário</td></tr><tr><td>Providone Scrub</td><td>Aspen Veteterinary Resources</td><td>21260221</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 70%</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>793213</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de xilazina 100 mg/mL IV a 0,010-0,015 mg/kg peso</td><td></td><td></td> corporal <td>Fornecido pelo veterinário</td></tr><tr><td>2% de lidocaína HCl (10-15 mL)</td><td></td><td></td><td>Fornecido pelo veterinário</td></tr><tr><td>1 mg/kg IV injeção de flunixina meglumina</td><td></td><td></td><td>Fornecido pelo veterinário</td></tr><tr><td><forte>Isolamento de mitocôndrias (fígado)</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frasco Wheaton 30 mL com um pilão de Teflon de 0,16 mm de folga</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-527</td><td></td></tr><tr><td>Motor Homogeneizador</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04369-10</td><td></td></tr><tr><td>Sonda Homogeneizadora</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-04468-22</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Automática (10 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-74</td><td></td></tr><tr><td>Copo (500 mL) com gelo</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB100600</td><td></td></tr><tr><td>Microfuga refrigerada</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-002-441EW3</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microfuga (1,5 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>ChemicalsKit de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ensaio de proteína de ácido bicinchonínico (BCA) (microplacas para leitor de placas)</td><td>abcam</td><td>ab102536</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S7903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>EDS-1KG</td><td></td></tr><tr><td>BSA (livre de ácidos graxos)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td></td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M4125-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Água deionizada</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>38796</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Use para criar meios de isolamento de mitocôndrias: 220 mM de manitol, 70 mM de sacarose, 20 mM de HEPES, 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA e 0,1% (p/v) de BSA livre de ácidos graxos&nbsp; pH 7,4 a 4 &nbsp; C, durará 2 dias em geladeira</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte> Consumo de oxigênio mitocondrial< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento< / forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Configuração do oxígrafo + eletrodo de oxigênio tipo Clark</td><td>Hansatech (PP Systems)</td> Bomba de água termorregulada <td>OXY1</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ADInstruments</td><td>MLE2001</td><td></td></tr><tr><td>Eletrodo de oxigênio tipo Clark</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Autopipeta (1 mL)</td><td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-70</td><td>Incluído com Oxy1</td></tr><tr><td>Pequena barra de agitação magnética</td><td>Micropipeta Fisher Scientific</td><td>14-513-95</td><td></td></tr><tr><td>(10 &mu; L)</td> <td>Cole Parmer</td><td>SK-21600-60</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P9333-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>P5655-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E3889-100G</td><td></td></tr><tr><td>Use para fazer meios de consumo de oxigênio mitocondrial: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7,4 a 30 &deg; C com 0,3% de rotenona BSA</td><td></td><td></td><td></td>desengordurada</tr><tr><td>(solução de 4 mM)</td><td>Sigma - Succinato</td><td>Aldrich R8875-5G</td><td></td></tr><tr><td>(solução de 1 M)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>S3674-250G</td><td></td></tr><tr><td>ADP (solução de 100 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina (solução de 8 &mu; g/mL em etanol)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Potencial de membrana mitocondrial e força motriz de prótons<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TPMP electrode</td><td>World Precision Instruments.</td><td>DRIREF-2</td><td></td></tr><tr><td>Chemicals-solutions não precisam ser frescas, mas precisam ser mantidas em um freezer entre as execuções</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Malonate (solução de 0,1 mM)</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina (8 &mu; g/mL em etanol), manter em freezer</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin (80 ng/mL em etanol), manter em freezer</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>N7143</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C3920</td><td></td></tr><tr><td>TPMP</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T200</td><td></td></tr><tr><td>TPMP solução: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes e 1 mM EGTA,&nbsp; pH 7,4 a 30 & C com BSA</td><td></td><td></td><td></td> desengordurado a 0,3%</tr></tbody></table>

medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de holstein

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Consumo de oxigênio, prótons força (PMF) e vazamento de próton são medidas da respiração mitocondrial, ou quão bem as mitocôndrias são capazes de converter o NADH e DANIII em ATP. Desde que as mitocôndrias são também o local principal para o uso de oxigênio e nutriente oxidação de dióxido de carbono e água, quanto à eficácia, eles usam o oxigênio e produzem ATP diretamente se relaciona com a eficiência do metabolismo de nutrientes, as necessidades de nutrientes do animal, e saúde do animal. A finalidade desse método é examinar a respiração mitocondrial, que pode ser usada para examinar os efeitos das diferentes drogas, dietas e os efeitos ambientais sobre o metabolismo mitocondrial. Os resultados incluem o consumo de oxigênio, medido como respiração dependente de próton (estado 3) e respiração dependente do vazamento próton (estado 4). A relação da respiração estado 4 3 / estado é definida como índice de controlo respiratório (ICR) e pode representar a eficiência energética mitocondrial. Vazamento de próton mitocondrial é um processo que permite a dissipação do potencial de membrana mitocondrial (MMP) desacoplamento fosforilação oxidativa do ADP, diminuindo a eficiência da síntese de ATP. Oxigênio e TRMP + eletrodos sensíveis com substratos mitocondriais e inibidores da cadeia de transporte de elétrons são usados para medir o estado 3 e 4 do estado respiração, membrana mitocondrial PMF (ou o potencial para produzir ATP) e vazamento de próton. Limitações para este método são que o tecido do fígado deve ser tão fresco quanto possível e todas as biópsias e ensaios devem ser realizados em menos de 10 h. Isso limita o número de amostras que podem ser recolhidos e tratados por uma única pessoa de um dia para aproximadamente 5. No entanto, é necessário apenas 1 g de tecido hepático, então em grandes animais, como gado leiteiro, a quantidade de amostra necessária é pequena em relação ao tamanho do fígado e há pouco tempo de recuperação necessário.

Resultados positivos, mostrando a cinética de vazamento RCR e prótons são mostrados na tabela 1 e Figura 15, respectivamente. No presente estudo7, RCR e proteína vazamento cinética foram medidos em vacas leiteiras Holstein em 70 dias no leite depois que as vacas tinham sido alimentadas 1 dos 5 níveis diferentes de Cu, Zn e Mn por 28 dias. Estado 4, respiração de vazamento-dependente de próton máximo, tinha uma tendênci...

Aqui, nós compartilhamos métodos de medição do consumo de oxigênio mitocondrial, um definição conceito de nutricional energética e vazamento de prótons, a principal causa de ineficiência na geração mitocondrial de ATP. Estes resultados podem representam 30% da energia perdida na utilização de nutrientes para ajudar a avaliar a função mitocondrial.

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo energético, como saúde mitocondrial, eficiência energética e uso de energia. A principal vantagem dessa técnica é que o consumo de oxigênio de mitocôndrias isoladas é medido diretamente. Os resultados não precisam ser corrigidos para outros processos metabólicos intracelulares.Decidimos primeiro buscar esse método no gado leiteiro quando queríamos examinar como a eficiência mitocondrial impacta a eficiência alimentar. A demonstração em vídeo deste método é fundamental, pois os passos do isolamento mitocondrial são difíceis de aprender porque precisam ser consistentes e precisos. O mais rápido possível depois que a amostra hepática é removida da vaca lave a amostra na mídia de isolamento das mitocôndrias para remover os glóbulos vermelhos.Usando uma tesoura finamente pica o tecido em um béquer resfriado que contém mídia de isolamento suficiente para manter o tecido úmido. Transfira o fígado picado para um frasco de vidro de 30 mililitros contendo mídia de isolamento de mitocôndrias. Adicione um pilão de Teflon que tenha uma folga de 0,16 milímetros e que tenha sido incubado em gelo e homogeneize a amostra hepática a 500 RPM por um minuto com quatro golpes por minuto.Depois disso, transfira o homogeneado para um tubo contendo mídia de isolamento mitocôndria e coloque-o em um béquer embalado no gelo. Centrífuga homogeneiza a 500 vezes G e 4 graus Celsius por 10 minutos. Descarte a pelota e transfira o supernatante para um tubo de centrífuga refrigerado.Centrifugar o supernante resultante a 10.000 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos para obter a pelota mitocondrial. Resuspend e lave a pelota em 10 mililitros de mídia de isolamento de mitocôndrias com BSA livre de ácidos graxos. Em seguida, centrífuga a 8,100 vezes G e quatro graus Celsius por 10 minutos.Descarte o supernatante e resuspenja a pelota em 200 microliters de mídia de isolamento. Coloque isso no gelo até estar pronto para usar para o consumo de oxigênio e ensaios cinéticos de vazamento de prótons. Determine a concentração proteica da suspensão da pelota usando um kit de ácido bicinchonínico por instruções do fabricante usando BSA como padrão.Primeiro, crie mídia de consumo de oxigênio conforme descrito no protocolo de texto. Incubar a mídia de consumo de oxigênio a 30 graus Celsius. Em seguida, configure a câmara de respiração, bomba e eletrodo de oxigênio para o sistema de oxígrafo de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, coloque um mililitro de mídia de consumo de oxigênio na câmara de respiração. Em seguida, adicione 0,35 miligramas de proteína mitocondrial à câmara. Mexa vigorosamente para garantir que a solução fique saturada de ar e mantenha uma temperatura de 30 graus Celsius.Regisso o consumo de oxigênio por aproximadamente cinco minutos. Quando o consumo de oxigênio se torna constante representado por uma linha reta decrescente, regise isso como o consumo de oxigênio na linha de base. Adicione 1,25 microlitres de uma solução rotenona de quatro milimilas para inibir um complexo e, em seguida, adicione cinco microliters de uma solução de succinita molar para alcançar uma concentração final de cinco milimilas de succinato na câmara respiratória.Isto é consumo de oxigênio iv estadual. Depois disso, adicione um microliter de uma solução ADP de 100 milimões para atingir uma concentração final de 100 micromolares na câmara de respiração. O consumo de oxigênio diminuirá por aproximadamente cinco minutos e, em seguida, se tornará uma linha reta.Regisso consumo de oxigênio como o estado III respiração. Calcule a razão de controle respiratório conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, aspire todas as soluções para fora da câmara de respiração.Enxágüe a câmara várias vezes com água deionizada dupla. Primeiro, prepare uma solução de 80 nanogramas por mililitro de nigericin no etanol limitando a quantidade de etanol adicionada a menos de um microliter. Além disso, prepare uma solução de oito microgramas por oligomicina mililitro no etanol.Depois de enxaguar completamente a câmara com água deionizada dupla, coloque um mililitro da mídia de consumo de oxigênio na câmara de respiração e mexa vigorosamente com uma barra de agitação magnética. Adicione 0,35 miligramas de proteína mitocondrial à câmara de respiração. Adicione um eletrodo sensível ao triphenylphosphonium à configuração da câmara certificando-se de que a outra extremidade esteja adequadamente conectada a um medidor de pH.Adicione 1,25 microliters de uma solução rotenona de quatro milimonas para inibir o Complexo I.Grave a respiração por dois a cinco minutos. Regissue o valor de consumo de oxigênio quando se tornar constante. Em seguida, adicione 0,56 microliters de uma solução de oligomicina para inibir a utilização de ADP.Regisso o tempo por cerca de dois a cinco minutos. Regissue o valor de consumo de oxigênio quando se tornar constante. Em seguida, adicione 0,112 microliters de uma solução de 80 nanogramas por mililitro nigericin para abolir o gradiente de pH através da membrana interna mitocondrial.Regissão a respiração por dois a cinco minutos e observe o valor de consumo de oxigênio quando ele se torna constante. Adicione cinco microliters de 10 milimolars de solução de triphenylphosphonium de metila à incubação mitocondrial para começar a preparar uma curva padrão. Repita esta adição quatro vezes adicionais até uma concentração total de 2,5.micromolar foi adicionado. Depois disso, adicione cinco microliters de uma solução de succinita molar à câmara para iniciar a respiração. Regisso a respiração até que um traço estável seja alcançado.Em seguida, adicione malonato para titular o sistema conforme descrito no protocolo de texto. Neste estudo, a cinética de vazamento de RCR e prótons é medida no leite de vacas leiteiras holstein 70 dias após as vacas leiteiras terem sido alimentadas com diferentes níveis de cobre, zinco e manganês por 28 dias. A respiração do Estado IV é vista como a mais alta em vacas, dado baixos níveis de manganês, mas é mais baixa nas vacas de controle, indicando que o manganês desempenha um papel importante na minimização da respiração dependente de vazamento de prótons.A análise da respiração hepática dependente de vazamento de prótons revela que essa respiração é maior em vacas tratadas com baixo manganês, e a mais baixa em vacas de controle. Esses resultados confirmam que o grupo de baixo manganês tem a maior respiração iv estadual, enquanto o grupo controle tem o menor. Embora a eficiência alimentar seja maior em bois Angus nascidos de touros de RFI baixos do que touros RFI altos, isso não se refletiu no RCR mitocondrial ou na cinética de vazamento de prótons.Ao realizar este procedimento é importante manter todos os frascos e béquers no gelo enquanto processam as mitocôndrias. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de nutrição leiteira explorarem o papel da eficiência das mitocôndrias na eficiência alimentar e na função mitocondrial no fígado. Não se esqueça que trabalhar com rotenone pode ser perigoso, e precauções como usar luvas, proteção ocular e EPI adequado devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

measuring-liver-mitochondrial-oxygen-consumption-proton-leak-kinetics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fonte:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste vídeo explica como o fluxo de oxigênio é usado para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas de mamíferos. Demonstra o uso sequencial de digitonina, substratos metabólicos, ADP, um desacoplador e um inibidor para caracterizar diferentes estados respiratórios. O perfil de fluxo de oxigênio resultante revela a função mitocondrial e a eficiência do acoplamento de energia...

Medições de fluxo de oxigênio para avaliar a respiração mitocondrial em células vivas e permeabilizadas

Os métodos apresentados fornecem instruções passo a passo para a realização de uma coleção de ensaios respirométricos baseados em microplacas usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de músculo esquelético de camundongo. Esses ensaios são capazes de medir mudanças/adaptações mecanicistas no consumo de oxigênio mitocondrial em um modelo animal comumente usado.

Usando mitocôndrias isoladas de quantidades mínimas de Rato Músculo Esquelético para alta taxa de transferência de microplacas respiratórias Medições

respirometria de alta resolução é usado para determinar o consumo de oxigênio mitocondrial. Esta é uma técnica simples para determinar mitocondrial complexos da cadeia respiratória "(I-IV) taxa respiratória, capacidade mitocondrial máxima do sistema de transporte de elétrons e de integridade mitocondrial externa da membrana.

De alta resolução Respirometria para avaliar a função mitocondrial em permeabilizadas e células intactas

Neste trabalho, é descrito um método para medir o consumo de oxigênio usando respirometria de alta resolução em permeabilized avermelhado da drosófila. Esta técnica requer uma quantidade mínima de tecido, em comparação com a técnica de isolamento mitocondrial clássico e os resultados obtidos são fisiologicamente mais relevantes.

Medição do consumo de oxigênio mitocondrial nas fibras Permeabilized da drosófila usando quantidades mínimas de tecido

Projetamos e construímos um laboratório móvel para medir as taxas respiratórias em mitocôndrias isoladas de animais silvestres capturados em locais de campo. Aqui, descrevemos o projeto e o equipamento de um laboratório mitocondrial móvel e os protocolos laboratoriais associados.

Desenvolvimento de um laboratório móvel de fisiologia mitocondrial para medir a energia mitocondrial no campo

A respirometria de alta resolução acoplada aos sensores de fluorescência determina o consumo mitocondrial de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). O presente protocolo descreve uma técnica para avaliar as taxas respiratórias mitocondriais e a produção de ROS no nervo ciático permeabilizado.

Avaliação da função mitocondrial no nervo ciático por respirometria de alta resolução

Descrevemos protocolos stepwise medindo a respiração mitocondrial de neutrófilos humanos e camundongos e células HL60 usando o analisador de fluxo extracelular metabólico.

Mensuração em Tempo Real do Perfil Bioenergético Mitocondrial de Neutrófilos

Os cavalos têm uma excepcional capacidade de exercício aeróbio, tornando o músculo esquelético equino um tecido importante tanto para o estudo da fisiologia do exercício equino quanto para a fisiologia mitocondrial de mamíferos. Este artigo descreve técnicas para a avaliação abrangente da função mitocondrial no músculo esquelético equino.

Fluor-respirometria de alta resolução do músculo esquelético equino

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Aqui, descrevemos um método abrangente para medir a fosforilação oxidativa mitocondrial em fibras musculares esqueléticas permeabilizadas frescas de músculos humanos ou de camundongos. Este método permite a quantificação em tempo real da respiração mitocondrial e a avaliação da preferência de combustível e flexibilidade metabólica, preservando as redes mitocondriais existentes e a integridade da membrana.

Medição da respiração mitocondrial em fibras musculares esqueléticas humanas e de camundongos por respirometria de alta resolução

Aprenda a medir o consumo de oxigênio mitocondrial hepático e a cinética de vazamento de prótons para estimar a respiração mitocondrial em gado leiteiro Holstein. Este método permite avaliar a eficiência energética celular.

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein (Vídeo) | JoVE Journal

Medição de consumo de oxigênio mitocondrial hepática e cinética de vazamento de protões para estimar a respiração mitocondrial no gado leiteiro de Holstein

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