Ressonância de superfície melhorada Raman dispersão nano-sonda Ratiometry para detecção de câncer de ovário microscópico através do Receptor de folato como alvo

Este método emprega a aplicação tópica de nanopartículas para imagem de tumores microscópicos, especialmente em malignidades que ainda não têm acesso à vasculatura, como a metástase do câncer de ovário. Esta técnica é ratiométrica, imagens direcionadas e nanopartículas não direcionadas em um único exame para diminuir sinais falsos e revelar a verdadeira extensão do tumor. Essas nanopartículas podem ser administradas por injeção intraperitoneal ou intravenosa para imagens de alta precisão do câncer de ovário e muitos outros tipos de tumores.

Para a síntese do núcleo nanostar dourado coloque um frasco cônico contendo 800 mililitros de solução de ácido ascórbico recém-preparada em uma placa de agitação magnética a quatro graus Celsius e induza um vórtice constante. Adicione rapidamente oito mililitros de solução de ácido tetracloroaurico recém-preparada ao vórtice. Dentro de segundos nanostars se formarão e a solução assumirá uma cor azul escuro.

Despeje a suspensão nanostar em tubos cônicos de 50 mililitros para centrifugação e aspire todos, exceto os últimos 200 microliters de supernascer de cada tubo no final do giro. Use uma micropipette para resuspensar as nanopartículas em cada tubo antes de juntar todas as nanopartículas em um único de diálise. Em seguida, dilou as nanopartículas por pelo menos três dias contra dois litros de água deionizada que trocam a água diariamente.

Para formação de conchas de sílica, primeiro adicione 10 mililitros de isopropanol, 500 microliters de TEOS, 200 microliters de água desionizada, e 60 microliters de corante a um tubo cônico de 50 mililitros. E adicione três mililitros de etanol, e 200 microliters de hidróxido de amônio a um tubo de 15 mililitros. Em seguida, sonicar as nanoestrelas dialisadas para dispersar quaisquer aglomerados e adicionar 1,2 mililitros de nanoestrelas ao tubo.

Coloque o tubo de 50 mililitros em um misturador de vórtice e induza um vórtice constante. Adicione rapidamente a solução nanostar ao tubo de 50 mililitros com cerca de cinco segundos a mais de mistura antes de transferir rapidamente o tubo para um agitador por 15 minutos a 300 RPM à temperatura ambiente. Os dois tubos devem ser combinados rapidamente e sob constante nixing para garantir que a reação de silicação aconteça nas nanoestrelas e para minimizar a produção gratuita de sílica.

No final da incubação encha o tubo com etanol para saciar a reação e coletar as nanoestrelas por centrifugação. Aspire tudo, mas sobre os últimos 500 microliters de supernadante tomando cuidado para não perturbar a pelota e resuspend as nanopartículas em um mililitro de etanol fresco. Em seguida, transfira a solução para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro para quatro mililitros de lavagem de etanol por centrifugação, reutilizando a pelota por ultrassônica por aproximadamente um segundo entre cada lavagem.

Para introduzir thiols nas superfícies de partículas, após a última lavagem resuspend a pelota em um mililitro de um etanol de 85%, 10%3-mercaptopropil-trimexysilane, e 5% solução de água deionizada para uma incubação de uma a duas horas à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as nanopartículas funcionalizadas de tiol por centrifugação como indicado, reutilizando a pelota por ultrassônica entre as lavagens. Para o receptor de anticorpos funcionalizados, os nanoprobes do receptor de anti-folato reagem 200 microgramas de anticorpo proteico de ligação anti-folato com excesso de dez vezes molar de peg cross-linker em 500 microliters de buffer HEPES.

Após 30 minutos concentre o anticorpo por centrífuga em um filtro centrífuga, recuperando o anticorpo invertendo o filtro em um novo tubo para uma centrifugação adicional. Em seguida, misture as nanopartículas funcionalizadas do tiol com o anticorpo concentrado e incubar a mistura por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente. Para formar nanoprobes não-direcionados adicione cinco miligramas de metanfetamina com direito a PEG 5000 maleimidas dissolvidas em DMSO às nanopartículas funcionalizadas por tiol em 500 microliters de tampão HEPES para uma incubação de pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente.

Para a injeção de nanoprobe gire para baixo ambos os sabores nanoprobe e resuspende as pelotas em tampão MES fresco em uma concentração de 600 picomolar. Misture as nanopartículas e carregue um mililitro da solução resultante em uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 26 por rato e injete intraperitoneally todo o volume no abdômen de cada rato. Em seguida, massageie suavemente o abdômen para distribuir as nanopartículas por toda a cavidade peritoneal.

Após pelo menos 25 minutos, proteja os membros de um animal injetado eutanizado em uma plataforma cirúrgica e use fórceps serrilhados e tesouras de dissecção para remover a pele para expor o peritônio. Inciso o peritônio. Anexe os retalhos peritoneal à plataforma e lave o interior da cavidade peritoneal com pelo menos 60 mililitros de PBS.

Em seguida, transfira a plataforma para um espectrômetro Raman com uma configuração óptica vertical e um estágio motorizado e imagem do abdômen sob os parâmetros de imagem apropriados. Isso é crucial que o plano focal para a varredura Raman esteja na superfície da maioria das vísceras. Se os órgãos estiverem fora do avião, o sinal adquirido não será útil.

Para fins de controle de qualidade, as nanopartículas podem ser caracterizadas usando uma variedade de métodos durante o processo de síntese, incluindo microscopia eletrônica de transmissão, dispersão dinâmica de luz, análise de rastreamento de nanopartículas e espectroscopia absorvente visível ultravioleta. As medidas de Raman revelam a presença do espectro único de cada sabor de nanopartícula ao longo da síntese. Rendimentos e concentrações típicas de reação dependem fortemente da técnica de pipetação durante as etapas de lavagem.

O espectro de Raman pode ser processado para remover a fluorescência e normalizado para a área unitária para compensar a força do sinal antes de aplicar os quadrados mínimos clássicos. Embora os escores clássicos menos quadrados em cada espectro de referência nanoprobe não forneçam individualmente os locais específicos dos tumores, as razões pontuais revelam a presença da disseminação microscópica disseminada. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de validar as nanopartículas em cada etapa da síntese, pois a qualidade das nanopartículas afeta fortemente os resultados finais.

Essa técnica demonstra o potencial para os pesquisadores usarem nanoprobes SERRS para a detecção de marcadores relacionados ao tumor em modelos animais e tecidos de pacientes excisados com alto grau de precisão microscópica.