Identificação, caracterização histológica e dissecação dos lobos da próstata do rato para em Vitro Spheroid 3D modelos de cultura

Este método pode ajudar no início de modelos de camundongos geneticamente modificados de câncer de próstata e investigação do mecanismo de câncer de próstata através de análise in vivo e in vitro. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite uma análise completa do modelo de camundongos cancerosos de próstata, desde a dissecção tecidual até o isolamento celular e a cultura. Depois de expor o sistema urogenital, ou UGS, segure firmemente a bexiga urinária com fórceps médios e levante todo o sistema do abdômen do rato.

Deslize um par de tesouras sob a bexiga e próstata até a coluna para fazer uma incisão através da medula espinhal, e corte todas as conexões restantes com a cavidade abdominal para permitir a remoção de todo o UGS. Transfira o UGS para uma placa de Petri de seis centímetros contendo dois a seis mililitros de PBS sob um microscópio dissecador. E use um par de fórceps finos e tesouras de microdisseção para limpar cuidadosamente toda a gordura dos lados dorsal e ventral do sistema tecidual sem cortar nenhum tecido da próstata.

Quando toda a gordura tiver sido removida, puxe a bexiga com os fórceps e extirpe a bexiga em sua base. Coloque o lado ventral do tecido restante para cima e segurando uma extremidade do duto com as fórceps, siga o vaso até sua base com uma tesoura e extirpe o vaso em sua base. Remova o mesmo vaso do outro lado e insira os fórceps entre as vesículas seminal e a próstata para permitir o corte de qualquer tecido conjuntivo adjacente conforme necessário.

Em seguida, rastreie os vesículos seminais até sua base na uretra e remova os vasos sem perfurar-os. Quando ambas as vesículas tiverem sido removidas, coloque o lado dorsal do tecido para cima para que os lobos dorsais que se assemelham às asas de uma borboleta sejam visíveis. Segurando cada lobo dorsal com fórceps, corte o tecido em sua base com uma tesoura para coletar os lóbulos dorsais e gire o tecido para o lado ventral.

Colete os lóbulos laterais, que são pequenos e geralmente envolvem a uretra ao lado e ficam presos entre os lobos anterior, ventral e dorsal da mesma forma. Colete os lóbulos ventral, que são maiores que os lóbulos laterais e deite-se na uretra ventrally. Em seguida, corte e descarte a uretra para colher os lóbulos anteriores.

Para processar o tecido da próstata para a cultura 3D, transfira os lóbulos para um prato de 10 centímetros contendo dois a três mililitros de DMEM, e use um bisturi para picar os túbulos da próstata da forma mais fina e uniforme possível. Transfira os fragmentos de tecido para uma capa de cultura tecidual estéril e adicione a solução de tecido a um novo tubo de 15 mililitros. Leve o volume no tubo até nove mililitros com meio fresco, e adicione um mililitro de solução de estoque de colagenase TenX à mistura de tecido.

Após o vórtice, incubar o tubo com agitação por duas horas a 37 graus Celsius para degradar a matriz extracelular. No final da incubação, recolham o tecido por centrifugação e suspendam a pelota em dois mililitros de tiras quentes de 05% em EDTA. Após cinco minutos de 37 graus Celsius para facilitar o corte das aderências célula-a-célula e célula-matriz, use uma pipehead P1000 com uma ponta de placa larga para triturar o tecido oito a dez vezes para quebrar qualquer aglomerado.

Repita a dissociação com uma ponta p200 pipehead. Em seguida, neutralize o trypsin com três mililitros de meio completo. Misture 500 unidades de DNASE1 no chorume tecidual e passe a solução cinco a dez vezes através de uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha calibre 18, seguida por cinco vezes através de uma agulha de calibre 20.

Quando não houver mais pedaços de tecido grande visível, filtre a suspensão através de um filtro de 40 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros e colete as células por centrifugação. Para o revestimento celular e cultura, suspenda a pelota em 0,5 mililitros de meio completo de crescimento epitelial da próstata, e aludir as células a cinco vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração média de crescimento de células epiteliais da próstata. Misture as células com a matriz extracelular da membrana do porão a um volume de dois a três volumes de razão de solução, e plaque a suspensão celular no recipiente de cultura celular experimental apropriado.

Em seguida, coloque as células em uma incubadora de cultura celular por 30 minutos. Quando a matriz extracelular se solidificar, cubra a cultura com meio de crescimento completo de células epiteliais da próstata pré-aquecida, tomando cuidado para não perturbar o plug da matriz extracelular da membrana do porão. Em seguida, devolva as células à incubadora de cultura celular por cinco a dez dias, refrescando metade do meio a cada dois ou três dias.

Para colher esferas, aspire o meio cuidadosamente sem perturbar o plug de gel de matriz extracelular da membrana do porão, e adicione um mililitro de solução Disbase para 100 microliters de membrana extracelular da membrana do porão. Usando um raspador de célula, raspe ao longo da parte inferior da placa para levantar os géis extracelulares da membrana do porão da parte inferior da placa para o supernaente, e encanar toda a solução uma vez para quebrar o plugue em pedaços menores. Incubar as peças de matriz celular extra na incubadora de cultura celular por uma a duas horas até que a matriz extracelular da membrana do porão tenha se dissolvido completamente.

Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. E coletar as células por centrifugação para mais manipulação a jusante. A próstata do rato é composta por quatro pares de lóbulos localizados dorsalmente e ventricamente para os vesículos seminal e uretra.

Os lobos da próstata são compostos por múltiplos perfis de glândulas, cada um composto por um lúmen, cercado por células epiteliais secretary. As formas dos lóbulos, a organização das células e a natureza da secreção variam de lobo ao lobo. As células isoladas da próstata começam a crescer em organoides até quatro dias após a cultura da matriz extracelular da membrana do porão.

Durante os próximos um a seis dias, a maioria das células cresce em esferas sólidas com uma fração das esferas exibindo um lúmen parcial ou completo. Os esferoides também demonstram uma forte coloração beta catenin nas junções célula-célula que co-localizam com a coloração F-actin. Ao tentar este procedimento, é muito importante seguir meticulosamente as etapas de microdisseção.

Por exemplo, isole os lóbulos da próstata enquanto eles ainda estão ligados à uretra, então você sabe qual lóbulo é o que se baseia em onde eles estão em relação à uretra. Após o procedimento de dissecção, os lóbulos isolados podem ser usados para análise a jusante, como sequenciamento rma, mancha ocidental ou imunostaining. A técnica primária de cultura 3D permite que você obtenha mais insights sobre o mecanismo do câncer de próstata, porque você pode monitorar a vida com esferoides para mudanças de morfologia e comportamento e identificar quaisquer alterações neoplásicas no mesmo.

Em resumo, esses métodos de dissecção e cultura da próstata podem estar incorporando a várias aplicações a jusante para fornecer informações valiosas para investigar o mecanismo do câncer de próstata usando modelos de camundongos geneticamente modificados.