Particulas de Lentivirus terapia gênica mediada por vetor de hepatócitos Ex Vivo para transplante autólogo em suínos

Este protocolo destina-se a descrever o hepatócito porcina isolamento e ex vivo gene entrega para curar modelos de doenças metabólicas através do transplante de células autólogas. Embora este modelo em particular beneficia de vantagens únicas que favorecem a terapia bem sucedida, o aplicativo é uma Fundação relevante para tratar doenças adicionais e indicações.

A terapia genética ex vivo e o transplante de células autólogas para o tratamento de erros de inato do metabolismo no fígado é uma alternativa importante à terapia para esses distúrbios. E nos permite não só tratar esses transtornos, mas descobrir a biomassa necessária para conseguir alcançar um resultado terapêutico. Essa abordagem também evita as consequências significativas da imunossupressão e outras consequências com diferentes tipos de terapias.

No contexto atual, estamos usando essa abordagem para tratar a tyrosinemia hereditária tipo 1. No entanto, a ideia é que esta será uma abordagem de plataforma para tratar uma infinidade de diferentes doenças hepáticas com alteração mínima. É importante poder visualizar essa técnica porque há alguma variabilidade quando se trata de visualizar a eficiência da perfusão, que é essencial para obter hepatócitos viáveis para o transplante.

Procedimento cirúrgico realizado por Robert Kaiser e Joseph Lillegard. Isolamento celular realizado por Zeji Du, Bruce Amiot. A purificação celular UAU e a transdução ex vivo das células foram feitas por Caitlin VanLith.

A preparação dos animais e a preparação do OR foi feita por Kari Allen e Laurie Hillin. Para realizar a entrada inicial do local do porto, realize uma técnica hasson aberta para o umbigo de um anestesizado, de até três meses de idade, grande porco de fazenda branca. Introduzindo um trocarte de 12 milímetros na cavidade abdominal, onde o peritônio é visível.

Quando o trocarte estiver no lugar, passe um escopo de 5 milímetros de 30 graus através da porta de entrada e insuflou o abdômen com dióxido de carbono a 15 milímetros de mercúrio. Sob visualização direta com a câmera laparoscópica, coloque 2 portas adicionais de 5 milímetros, triangulando no lobo lateral esquerdo do fígado. E coloque o laparscópio em um dos novos portos.

Identifique o segmento lateral esquerdo do fígado no ponto da maior fissura do lobo esquerdo que separa os segmentos lateral medial e esquerdo. E use um grampeador cirúrgico para proteger as estruturas vasculares e a veia hepática ao longo desta fissura. Transecte o parenchyma através desta fissura usando disparos sequenciais e 60, 45 ou 30 milímetros de carga vascular longa.

Quando a ressecção estiver completa, avalie o fígado remanescente para garantir uma hemostasia adequada e use agarradores endoscópicos e um saco de recuperação de tecido endoscópico para recuperar a seção hepática. Agora, remova as portas e use uma sutura de tamanho zero interrompida para a fáscia midline. Uma sutura 2-0 para a camada dérmica profunda.

E uma sutura 4-0 para a camada subcuticular, para fechar a incisão da porta de 12 milímetros nas três camadas. Em seguida, feche as portas de cinco milímetros em uma camada com suturas 2-0. E coloque um curativo estéril nas incisões.

Para o isolamento do hepatocitado, primeiro conecte uma bomba peristáltica para fornecer as soluções de dispersão, mantidas em um banho de água de 43 graus Celsius, aos cateteres a serem colocados nos vasos grandes e expostos da seção hepática. Prime a bomba e tubo com a solução de perfusão dois, até uma posição de pare galo para alternar entre a perfusão um e perfusão duas entrega de solução para o tecido. E mude o pau de parada para a posição de perfusão.

Em seguida, prime o resto do conjunto de tubos. Preenchendo completamente uma armadilha de bolhas inline para evitar a introdução de bolhas de ar no tecido. Em seguida, faça uma incisão transversal limpa, perpendicular à circulação hepática para revelar seções transversais dos ramos venosos do portal e das veias hepáticas para cateterismo.

E use um cateter de encaixe confortável para cateterizar as veias disponíveis e expostas. Quando os cateteres estiverem no lugar, perfumam o tecido hepático ressecado com uma solução de perfusão quente a uma taxa de fluxo de 100 milímetros por minuto. Movendo o tubo de saída da veia para a veia a cada 30 a 60 segundos.

E usando um tubo de evacuação para remover o excesso de tampão da bandeja de tecido. Depois de pedalar por todas as veias disponíveis por 15 a 20 minutos, mude para perfusão duas soluções sob as mesmas condições. Usando uma bomba de retorno para reciclar a solução de perfusão dois de volta ao reservatório, a uma taxa de fluxo mais lenta, para re-administração no tecido.

Verifique a temperatura da superfície da armadilha da bolha e, ou o fígado a cada cinco minutos para confirmar que os hepatócitos não estão esfriando. Quando o fígado branquear após cerca de 30 minutos de perfusão, transfira o tecido para um recipiente estéril, embrulhado com uma cortina estéril, e coloque o recipiente em uma capa de cultura celular para manter a esterilidade durante o processamento do hepatocitte. O isolamento colagenase dos hepatócitos e da dissociação celular precisa ser feito completamente para que você não tenha aglomerado as células que diminui a viabilidade das células e a frequência de transdução.

Submergir o fígado com hepatocitte lavar o meio e arrastar tesouras pelo topo do tecido para interromper a cápsula hepática. Usando luvas estéreis, massageie suavemente o fígado para liberar os hepatócitos no meio. E filtrar o supernazio tecidual, através de gaze estéril, em garrafas centrífugas de 200 mililitros.

Colete os hepatócitos filtrados por centrifugação. Agrupando as células em 150 mililitros de hepatocitte fresco, lave o meio em uma única garrafa de 200 mililitros para 2 lavagens adicionais. E contando as células após a terceira centrifugação.

Em seguida, diluir as células para 1 vezes 10 a nona hepatócitos por concentração salina mililitro. Para autotransplantação dos hepatócitos isolados, use um transdutor de dois a cinco mega-hertz para identificar a veia portal via ultrassom e direcionar uma agulha de 5 polegadas e 18 para a veia principal do portal, aproximada à bifurcação. Carregue as células em uma seringa de 60 mililitros, de acordo com o volume total da célula e conecte a seringa à agulha, tomando cuidado para não introduzir bolhas.

Em seguida, deprime lentamente o êmbolo da seringa para infundir manualmente até 1 vezes 10 a nona hepatócitos através da veia portal usando um cateter de infusão para monitorar a pressão poral durante o transplante. Quando todas as células tiverem sido entregues, remova o cateter e monitore a veia portal para a presença de eventos trombóticos e fluxo avançado por ultrassom. Em uma coorte representativa de cinco suínos, que foram submetidos à ressecção hepática, a maioria apresentou rendimentos superiores a 10 aos nonos hepatócitos com aproximadamente 80% de viabilidade.

Fornecendo um número suficiente de células para qualquer tipo de manipulação desejada, incluindo terapia genética. A cultura subsequente da porção não transplantada desses hepatócitos preparados, demonstrou uma boa viabilidade e adesão com uma morfologia hepatócica típica 46 horas após sua transdução e revestimento inicial. Um enxerto inicial varia de acordo com o número de células reintroduzidas durante o transplante.

Essas biópsias representativas demonstram uma linha do tempo de expansão celular corrigida por genes. Exclusivo de doenças, como a tyrosinemia hereditária tipo 1, que desfrutam de uma pressão positiva selecionada para células saudáveis. Esta expansão é tipicamente completa 12 meses após o transplante.

Uma vez que um animal de hidrolase hidrolase transplantado tenha alcançado cerca de 20% de re-população dos hepatócitos corrigidos dentro do fígado, os níveis de tyrosina normalizarão em comparação com animais do tipo selvagem. Enquanto animais não corrigidos apresentam uma elevação significativa tanto na fosfatase alcalina quanto na transaminase asparta em comparação com animais do tipo selvagem, a terapia genética ex vivo retorna esses níveis de enzimas séricos ao normal. Além disso, a saúde metabólica hepática geral é interrompida em suínos não tratados, como indicado por elevações na amônia circulante que são corrigidas após a re-população com os hepatócitos tratados.

É importante lembrar com o uso desta técnica para manusear e manipular o tecido com cuidado e o mínimo possível. O aumento do manuseio ou manipulação do tecido, leva à diminuição da viabilidade das células e à diminuição do rendimento. Essa abordagem também pode ser aplicável para pessoas interessadas em estudar distribuição de arcos e ineficiências de gráficos em técnicas de rotulagem, utilizando outras técnicas fora dos protocolos de transdução viral.

Não se esqueça que trabalhar com vetores virais pode ser perigoso, portanto, seguir procedimentos adequados de bio segurança, bem como usar equipamentos de proteção individual é necessário ao usar essas técnicas.