Name: Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a isolar núcleos da medula espinhal de camundongos para sequenciamento de ARN de núcleo único. Este método permite analisar perfis de expressão gênica em tecidos difíceis de dissociar e amostras congeladas.

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Este trabalho foi financiado pelo programa intramural de NINDS (1 ZIA NS003153 02) e NIDCD (1 ZIA DC000059 18). Agradecemos a L. Li e C.I. Dobrott pelo apoio técnico e discussões úteis e C. Kathe para revisar o manuscrito.

Todo o trabalho animal foi realizado em conformidade com um protocolo aprovado pelo Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso cuidado do Animal e Comitê de uso. Balanceamento de amostras de masculinos e femininos, ratos do selvagem-tipo da ICR/CD-1, entre 8 e 12 semanas velho, foram usados para todos os experimentos. Os ratos devem ser tratados em conformidade com as orientações institucionais Cuidado Animal e Comitê de uso locais.
1. preparação de materiais e Buffers
<ol><li>Preparar todos os buffers no dia do uso e pre-chill no gelo (ver tabela 1).<ol>
<li>Se utilizar detergente-mecânica Lise, prepare o detergente do lysis (> 500 μL por amostra), buffer de sacarose baixa (> 6 mL por amostra), buffer de densidade de sacarose (> 12,5 mL por exemplo) e a solução de ressuspensão (> 1 mL).</li>
		<li>Se usando lise hipotónica-mecânico, preparar o tampão de Lise hipotónica (> 5 mL por amostra), médio HEB (> 5 mL por amostra), buffer de sacarose baixa (> 3 mL por amostra), buffer de densidade de sacarose (> 12,5 mL por exemplo) e a solução de ressuspensão (> 1 mL).</li>
		<li>Adicione 25 μL de ditiotreitol (DTT) para 25 mL de tampão de baixa sacarose e outra 25 μL de TDT para 25 mL de buffer de gradiente de densidade de sacarose, pouco antes de iniciar o protocolo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cubra a superfície dissecação com folha de alumínio para minimizar a contaminação da amostra com fibras de papel toalha ou protetores de banco, que podem obstruir canais microfluídicos usados para capturar o único núcleos.</li>
	<li>Pulverizador ferramentas de dissecção e espaço de bancada com uma solução de descontaminação de RNase. Além disso, pulverize o interior do tubo homogenizador de homogenizacao (se estiver usando o lysis da pilha de detergente-mecânica) e tubo de Oak Ridge com uma solução de descontaminação de RNase. Enxague com água ultrapura, RNase-livre o tubo homogenizacao e Oak Ridge.</li>
	<li>Pre-relaxa todos os tubos de coleta (50ml cónico, Oak Ridge) e tubos de homogeneizador homogenizacao no gelo.</li>
	<li>Fogo polir uma série de pipetas Pasteur (se estiver usando o lysis da pilha hipotônica-mecânico).</li>
</ol>2. preparação da medula espinhal
<ol><li>Se usar tecido fresco, eutanásia o mouse por inalação de CO2 . Após eutanásia, pulverize o casaco do mouse com etanol a 70% para minimizar a contaminação de cabelo na amostra.</li>
	<li>Decapitar o mouse com uma tesoura cirúrgica afiada, RNase-livre. Em seguida, levantando suavemente o abdominal da pele com pinças e fazer uma incisão ao longo do comprimento do corpo para expor os órgãos internos.</li>
	<li>Acabo com o mouse, puxando os órgãos internos da cavidade de corpo usando fórceps. Não utilize toalhas de papel para limpar a área ou para retirar os órgãos como isto pode introduzir contaminantes. Usando a tesoura, corte a coluna vertebral, entre as vértebras da coluna vertebral L2 e L3. Nota: Com a prática, esta etapa pode ser alcançada em menos de 30 segundos.<ol>
<li>Para ejetar a medula espinhal, cabe uma seringa de 3 mL contendo PBS gelado com uma agulha de ¼ de polegada de 25 G. Coloca a ponta da agulha no final sacral da coluna vertebral. Use dois dedos de beliscar as vértebras para criar um selo apertado em torno da ponta da agulha e pressione o êmbolo para ejetar a medula espinhal rostralmente. Lugar da medula espinhal em uma placa de Petri com PBS gelado.</li>
		<li>Neste momento, congelar o tecido e armazenar a-80 ° C ou usá-lo imediatamente para detergente-mecânica (etapa 3) ou lise de hipotônica-mecânica (passo 4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se usar tecido congelado, manter o tecido em gelo seco, prosseguir para detergente-mecânica (etapa 3) ou lise de hipotônica-mecânica (passo 4).</li>
</ol>3. lise celular detergente-mecânica
<ol><li>Coloque a medula espinhal lombar em um homogeneizador homogenizacao pre-refrigerado e adicione 500 mL previamente refrigeradas lise detergente. Nota: Uma rato da medula espinhal lombar é 325,5 mg mg 63,9 ± erro-padrão da média (SEM, N = 4). 50 mg – 1,5 g de tecido pode ser utilizado com sucesso.</li>
	<li>Homogenizacao com 5 golpes de pilão um (pilão 'solto'), então a 5-10 golpes de pilão B (pilão 'apertado'). Evitar levantar o homogenizador fora a solução de Lise entre traços e evitar a introdução de bolhas.</li>
	<li>Coloque um filtro de 40mm sobre um tubo cónico de 50ml pre-refrigerados e prewet com 1 mL de tampão de baixa sacarose.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de tampão de baixa sacarose para o homogeneizador homogenizacao contendo os núcleos brutos na Lise e misture suavemente pipetando 2 – 3 vezes.</li>
	<li>Passe a preparação de núcleos bruto o filtro de 40mm no tubo cónico de 50ml previamente refrigerados.</li>
	<li>Passe um adicional 1 mL de tampão de baixa sacarose sobre o filtro de 40mm, trazendo o volume final de 3 mL do buffer baixa sacarose e 500 mL de tampão de Lise.</li>
	<li>Repita as etapas 3.1 – 3.6 se combinando vários cabos, reunindo no mesmo tubo cónico.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 3.200 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Uma vez concluída a centrifugação, decante o sobrenadante. Prossiga para a etapa 5.</li>
</ol>4. lysis da pilha hipotônica-mecânica
<ol><li>Lugar da medula espinhal lombar em 5 mL de tampão de Lise hipotónica em um prato de cultura de tecidos. Use o fim brusco da tesoura de mola para dividem a medula espinhal e, em seguida, use tesoura de mola para cortar o cordão em pedaços de 3 – 4 mm, mas não picar. Nota: 50mg – 1,5 g de tecido pode ser utilizado com sucesso.</li>
	<li>Incube no gelo por 15 min, agitando 2 – 3 vezes.</li>
	<li>Adicione 5 mL de meio HEB para diluir a Lise hipotónica.</li>
	<li>Triture o tecido 10 vezes com pipeta sorológica 5ml, ou até que todas as peças do tecido mover suavemente através da abertura da pipeta.</li>
	<li>Triture com uma série de três pipetas Pasteur fogo-lustrado com diâmetros progressivamente mais estreitos (~ 900 – 600 mm).<ol>
<li>Para cada pipeta, Triture 5 - 15 vezes, permitir que o tecido resolver, retire 1 a 2 mL do sobrenadante contendo núcleos dissociados e passar por um filtro de 40mm em um tubo cônico de 50ml previamente refrigerados.</li>
		<li>Após a trituração com pipeta Pasteur de menor porte, certifique-se de que o homogenate flui suavemente a ponta da pipeta. Passe o restante da solução sobre o filtro de 40mm no tubo cónico de 50 mL. Nota: O número total de triturations pode ser ajustado como desejado. As meninges da medula espinhal do mouse permanecerá, mas é importante triture qualquer pedaços visíveis da medula espinhal. Passe o restante homogenate a peneira de 40 m. Evite a introdução de bolhas durante a trituração.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar a amostra filtrada a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Uma vez concluída a centrifugação, decantar e descartar o sobrenadante. Prossiga para a etapa 5.</li>
</ol>5. homogeneização e gradiente de densidade de sacarose
<ol><li>Após a etapa 3 ou 4, resuspenda o pellet usando 3 mL de tampão de baixa sacarose. Agite suavemente para remover o sedimento da parede para facilitar a ressuspensão. Deixe a amostra sentar no gelo por 2 min e transferir a suspensão para um tubo de Oak Ridge.</li>
	<li>Usando o homogenizador na configuração 1, homogeneizar os núcleos no buffer de sacarose baixa para 15 a 30 s, mantendo a amostra em gelo. Nota: Use 15 s se usando uma lombar da medula espinhal ou 30 s se usando em pool de amostras ou um inteiro da medula espinhal.</li>
	<li>Usando uma pipeta sorológica, camada 12,5 mL de tampão de sacarose densidade sob a baixa sacarose homogenate de tampão, tomando cuidado para não criar uma bolha que interrompe as camadas de densidade.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 3.200 x g por 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Uma vez concluída a centrifugação, imediatamente decante o sobrenadante em um movimento flicking. Nota: Um volume residual (inferior a 400 mL) de tampão de sacarose pode ser Descartado se desejado para produzir um volume menor e limpador amostra final, mas este volume residual contém núcleos e pode ser preservado para maximizar o rendimento de núcleos.</li>
	<li>Usando 100 mL - 1 mL de solução de ressuspensão, resuspenda os núcleos restantes na parede. Evite a mielina 'cara feia' que permanece com a preparação do detergente baseada.</li>
	<li>Os núcleos do filtro através de um filtro de tamanho de poro de 30 – 35 mm e recolher em um tubo previamente refrigerado.</li>
	<li>Determine os núcleos rendem usando um hemocytometer a contagem de núcleos sob um objetivo X 10. Nota: Trypan azul pode ser adicionado para visualizar núcleos que devem aparecer azuis. Observe a quantidade de restos celulares.</li>
	<li>Prossiga para o passo 6 ou 7.</li>
</ol>6. maciçamente paralelo snRNA-sequenciamento: plataforma académica7
<ol><li>Realizar o sequenciamento de snRNA maciçamente paralelo (por exemplo, Drop-Seq) método conforme descrito anteriormente7 com as seguintes modificações:4<ol>
<li>Ajuste os núcleos para uma concentração final de 225 núcleos por mL.</li>
		<li>Prepare-se grânulos de código de barras em uma concentração de 250 contas por mL.</li>
		<li>Prepare a Lise com sarkosyl de 0,7%.</li>
		<li>Ajuste as taxas de fluxo a 35 mL / min para grânulos, 35 mL / min para núcleos e 200 mL / min para o óleo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. maciçamente paralelo snRNA-sequenciamento: plataforma comercial26
<ol><li>Executar maciçamente paralelo snRNA-em sequência usando a plataforma comercial (por exemplo, cromo solução de expressão de Gene único de célula) produtos de acordo com instruções26 com a seguinte modificação as indicações do fabricante:<ol>
<li>Seguindo transcrição reversa, adicione um ciclo PCR adicional ao número calculado de ciclos de amplificação do cDNA baseada a recuperação da célula alvo para compensar a diminuição do cDNA de núcleos em comparação com as células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
<li>Hu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Cell-Type+Composition+and+Activity-Dependent+Transcriptional+State+in+Mammalian+Brains+by+Massively+Parallel+Single-Nucleus+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq.</a> Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
<li>Sathyamurthy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Single+Nucleus+Transcriptional+Profiling+Defines+Spinal+Cord+Neurons+and+Their+Activity+during+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior.</a> Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).</li>
<li>Campbell, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+census+of+arcuate+hypothalamus+and+median+eminence+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types.</a> Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Reveals+Hypothalamic+Cell+Diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity.</a> Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+RNA-seq+for+marker-free+decomposition+of+tissues+into+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types.</a> Science. 343 (6172), 776-779 (2014).</li>
<li>Li, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatosensory+neuron+types+identified+by+high-coverage+single-cell+RNA-sequencing+and+functional+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity.</a> Cell Research. 26 (8), 967(2016).</li>
<li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+with+Waterfall+Reveals+Molecular+Cascades+underlying+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).</li>
<li>Villani, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+reveals+new+types+of+human+blood+dendritic+cells%2C+monocytes%2C+and+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors.</a> Science. 356 (6335), (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).</li>
<li>Lacar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+RNA-seq+of+single+neurons+reveals+molecular+signatures+of+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation.</a> Nature Communications. 7, 11022(2016).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/110/49/19802.short">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Krishnaswami, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+single+nuclei+for+RNA-seq+to+capture+the+transcriptome+of+postmortem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons.</a> Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+nuclei+isolation+from+human+postmortem+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).</li>
<li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Filtration-based+Method+of+Preparing+High-quality+Nuclei+from+Cross-linked+Skeletal+Muscle+for+Chromatin+Immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).</li>
<li>Halder, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+changes+in+plasticity+genes+accompany+the+formation+and+maintenance+of+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory.</a> Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-nucleus+RNA-seq+with+DroNc-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq.</a> Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).</li>
<li>10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing">https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing</a> (2018).</li>
<li>10X Genomics. <a target="_blank" href="https://www.salk.edu/wp-content/uploads/2017/11/10XUserGuide.pdf">Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide</a>. , (2018).</li>
<li>Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+characterizing+postnatal+development+and+maturation+of+the+mouse+brain+and+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord.</a> Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/12/25/239749">Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Habib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Div-Seq%3A+Single-nucleus+RNA-Seq+reveals+dynamics+of+rare+adult+newborn+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons.</a> Science. 353 (6302), 925-928 (2016).</li>
</ol>

Temos sem conflitos de interesse a divulgar.

O objetivo final do presente protocolo é isolar núcleos contendo RNA de alta qualidade para análise transcricional a jusante. Adaptamos snRNA-Seq métodos para o perfil de todos os tipos de células na medula espinhal. Inicialmente, achamos que métodos de dissociação típica célula eram ineficazes para sequenciamento do RNA de única célula, como os neurônios da medula espinhal são particularmente vulneráveis à morte celular. Além disso, métodos de dissociação celular induzem a expressão de vários genes de atividade - e -res...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 &#956;L pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 &#956;L of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion. 
NOTE: A residual volume (less than 400 &#956;L) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 &#956;L - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin &#8216;frown&#8217; that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were&#160;updated from:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.</li>
</ol>
to:
<ol>
	<li>Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per &#956;L.</li>
	<li>Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per &#956;L.</li>
	<li>Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.</li>
	<li>Adjust the flow rates to 35 &#956;L per min for beads, 35 &#956;L per min for nuclei, and 200 &#956;L per min for oil.</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58413/isolation-adult-spinal-cord-nuclei-for-massively-parallel-single">Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing</a>. The Protocol section was updated.

Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

O sistema nervoso é composto por grupos heterogêneos de células que exibem uma disposição diversa de propriedades morfológicas, bioquímicas e eletrofisiológicas. Enquanto o sequenciamento de RNA em massa tem sido útil para determinar todo o tecido alterações na expressão do gene em condições diferentes, isso impede a detecção de alterações transcricionais no nível de célula única. Avanços recentes na célula única análise transcricional permitiram a classificação de células heterogêneas em grupos funcionais com base em seu repertório molecular e ainda podem ser aproveitados para detectar conjuntos de neurônios que tinham sido recentemente ativos. 1 , 2 , 3 , 4 nos últimos dez anos, o desenvolvimento de uma única célula RNA sequenciamento (scRNA-Seq) permitiu o estudo da expressão do gene em células individuais, proporcionando uma visão sobre a diversidade do tipo de célula. 5
O surgimento das abordagens escaláveis como maciçamente paralelo scRNA-Seq, forneceu plataformas para tecidos heterogêneos de sequência, incluindo muitas regiões do sistema nervoso central. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 entretanto, métodos de dissociação única célula podem originar a morte celular, bem como alterações experimentais na expressão gênica. 16 trabalho recente adaptou-se métodos de sequenciamento única célula para permitir a preservação dos perfis transcriptional endógenas. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 estas estratégias têm sido particularmente adequadas para a detecção imediata expressão de gene (IEG) inicial após estímulo sensorial ou comportamento. 3 , 4 no futuro, esta estratégia poderia também ser usada para estudar as mudanças dinâmicas nos tecidos nos Estados de doença ou na resposta ao estresse. Esses métodos, sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma abordagem promissora que não envolve a dissociação de células indutoras de stress e pode ser usada na difícil dissociar o tecido (por exemplo, a medula espinhal), bem como congelados tecido. 4 , 17 , 18 , 19 adaptado de métodos de isolamento de núcleos anteriores,20,21,22,23,25 snRNA-Seq normalmente utiliza celular e ruptura rápida de tecido Lise sob condições de frio, centrifugação e separação dos núcleos de restos celulares. 4 núcleos podem ser isolados para o sequenciamento de próxima geração a jusante em múltiplas plataformas de encapsulamento de gotículas microfluidic. 4 , 7 , 24 , 25 este método permite um instantâneo da atividade transcricional de milhares de células em um momento no tempo.
Existem várias estratégias para liberação de núcleos de células antes de isolamento e sequenciamento, cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Aqui, descrevemos e comparar dois protocolos para permitir o isolamento dos núcleos da medula espinhal adulto para a jusante maciçamente paralelo snRNA-Seq: lise detergente-mecânica e lise hipotónica-mecânica. Lise de detergente-mecânica fornece tecido completo rompimento e um maior rendimento final de núcleos. Mecânica-lise hipotónica inclui um grau controlável de ruptura do tecido, proporcionando uma oportunidade para a seleção de um equilíbrio entre a quantidade e a pureza do rendimento final nuclear. Estas abordagens fornecem rendimento comparável do RNA, detectado um número de genes por núcleo e o tipo de célula de criação de perfil e também podem ser usados com sucesso para snRNA-Seq

<table><tbody><tr><td>Sacarose</td><td>Invitrogen</td><td>15503-022</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES (pH = 8,0)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgAc</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5661-50G</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH = 8,0)</td><td>Corning</td><td>MT-46034CI</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Adicione TDT antes de usar</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Crystalgen</td><td>221-238-10</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7,4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Crystalgen</td><td>221-133-10</td><td></td></tr><tr><td>0.04% BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>0.2 U/ &mu; L Inibidor de RNAse</td><td>Lucigen</td><td>30281-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Centrífuga Oak Ridge</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur de Vidro Borosilicato-Plugado Descartável de Algodão</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de Tecido de Vidro (2 mL)</td><td>Kimble</td><td>885303-002</td><td></td></tr><tr><td>Pilão de vidro de grande folga</td><td>Kimble</td><td>885301-0002</td><td></td></tr><tr><td>Pilão de vidro pequeno para folga</td><td>Kimble</td><td>885302-002</td><td></td></tr><tr><td>T 10 Basic Ultra Turrax Homogeneizador</td><td>IKA</td><td>3737001</td><td></td></tr><tr><td>Ferramenta de dispersão (S 10 N &ndash; 5G)</td><td>IKA</td><td>3304000</td><td></td></tr><tr><td>Mancha Azul de Tripano (0.4%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; Filtro de célula m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers, 30 &mu; m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos</td><td>Denville Scientific</td><td>1000799</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004505</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F15-6 x 100y Rotor de ângulo fixo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Esterológicas: 5 mL, 10 mL</td><td>Denville Scientific</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>Chemgenes Barcoding Beads</td><td>Chemgenes</td><td>Macosko-2011-10</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Descontaminação RNase RNaseZap Tubo de</td> Teste <td>Falcon Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>com Tampa de Filtro de Células (35 &mu; m)</td> <td>Classificador</td><td>de</td> Células MoFlo Astrios da Corning 352235 <td></td></tr> Kit Multiplex <tr><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>B25982</td><td></td></tr><tr><td>Chromium i7, 96 rxns</td><td>10X Genômica</td><td>120262</td><td></td></tr><tr><td>Célula Única de Cromo 3' Kit de Biblioteca e Gel Bead v2, 4 rxns</td><td>10X Genomics</td><td>120267</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Single Cell A Chip Kit, 16 rxns</td><td>10X Placa de Cultura de Tecidos Genomics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(60 mm x 15 mm)</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do arn de single-núcleo maciçamente paralelo

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Sondando a expressão de gene de uma célula individual permite que a identificação do tipo de célula e estado da célula. A sequenciação do ARN monocelulares tem emergido como uma poderosa ferramenta para estudar perfis transcriptional de células, particularmente nos tecidos heterogêneos, tais como o sistema nervoso central. No entanto, métodos de dissociação necessários para sequenciamento única célula podem levar a mudanças experimentais na morte gene expressão e celular. Além disso, esses métodos são geralmente restritos ao tecido fresco, limitando assim os estudos sobre arquivamento e material de bio-banco. Sequenciamento de núcleo único RNA (snRNA-Seq) é uma alternativa atraente para estudos transcricionais, dado que com precisão identifica os tipos de células, permite o estudo de tecido que é difícil dissociar, ou congelados e reduz induzida por dissociação transcrição. Aqui, apresentamos um protocolo de alto rendimento para isolamento rápido de núcleos para jusante snRNA-Seq Esse método permite o isolamento dos núcleos de amostras frescas ou congeladas da medula espinhal e pode ser combinado com duas plataformas de encapsulamento maciçamente paralelo da gota.

Aqui, realizamos o isolamento dos núcleos da medula espinhal lombar rato adulto para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. O protocolo envolveu três componentes principais: tecido celular e ruptura da lise, homogeneização e sacarose densidade centrifugação (Figura 1). Em poucos segundos, a lise de detergente-mecânica rendeu uma preparação de núcleos bruto com um grande número de núcleos, bem como os restos celulares e tecido (<strong class="xf...

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar rapidamente núcleos de alta qualidade do tecido fresco ou congelado para a sequenciação do ARN maciçamente paralelo a jusante. Inclui opções de Lise rompimento e célula tecido detergente-mecânica e hipotônica-mecânico, ambos dos quais podem ser usados para isolamento dos núcleos.

Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

O sequenciamento de RNA unicelular é uma ferramenta poderosa para estudar perfis transcricionais de células, particularmente em tecido heterogêneo, como o sistema nervoso central. Este protocolo fornece um método para isolar núcleos para sequenciamento de RNA de núcleo único. Usando núcleos em vez de células, este método pode ser aplicado a tecidos difíceis de dissociar, bem como tecido congelado.Além disso, este método pode ser aplicado para estudar alterações específicas do tipo celular nas células após doença ou lesão. Inicie este procedimento com eutanásia de rato, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, faça uma incisão ao longo do comprimento do corpo para expor os órgãos internos.Eviscerar o rato puxando os órgãos internos da cavidade corporal usando fórceps. Não use toalhas de papel para limpar a área ou para remover órgãos, pois isso pode introduzir contaminantes. Usando uma tesoura, corte a coluna vertebral entre as vértebras espinhal L2 e L3.Para ejetar a medula espinhal, coloque uma seringa de três mililitros contendo PBS gelado com uma agulha de 25 metros de calibre 1/4 polegada. Coloque a ponta da agulha na extremidade sacral da coluna vertebral. Use dois dedos para beliscar as vértebras para criar uma vedação apertada ao redor da ponta da agulha, e pressione para baixo no êmbolo para ejetar a medula espinhal rostrally.Coloque a medula espinhal em uma placa de Petri com PBS gelado. Se for necessária apenas a porção lombar do cordão, corte as porções sacral e torácica da medula espinhal. Neste ponto, congele o tecido e armazene a menos 80 graus Celsius, ou use imediatamente para lise celular mecânica detergente como descrito aqui, ou lise mecanicamente hipotônica, conforme descrito no protocolo de texto.Para determinar a lise celular mecânica detergente, coloque a medula espinhal lombar em um homogeneizador Dounce pré-refrigerado e adicione 500 microliters de tampão de detergente pré-refrigerado. Dounce com cinco golpes do pilão solto, A, e depois cinco a 10 golpes do pilão apertado, B.Evite levantar o homogeneizador fora da solução de lise entre os traços, e evite introduzir bolhas. Agora, coloque um coador de 40 mícrons sobre um tubo cônico pré-refrigerado de 50 mililitros e pré-molhado com um mililitro de baixo tampão de sacarose.Adicione um mililitro de tampão de sacarose baixa ao homogeneizador Dounce contendo os núcleos brutos no tampão de lise e misture suavemente por pipetar duas a três vezes. Passe os núcleos brutos de preparação sobre o coador de 40 mícrons, para o tubo cônico pré-refrigerado de 50 mililitros. Passe um amortecedor de sacarose de um mililitro adicional sobre o filtro de 40 mícrons, trazendo o volume final para três mililitros do tampão de sacarose baixa e 500 microliters do tampão de lise.Repita estas etapas se combinar vários cabos, resfriando no mesmo tubo cônico. Em seguida, centrifugar a amostra a 3200 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Uma vez que a centrifugação esteja completa, decante o supernatante.Suspendemos a paleta usando três mililitros de baixo tampão de sacarose. Gire suavemente para remover a pelota da parede para facilitar a suspensão. Depois de deixar a amostra no gelo por dois minutos, transfira a suspensão para um tubo de Oak Ridge.Utilizando o homogeneizador na configuração um, homogeneize os núcleos em baixo tampão de sacarose por 15 a 30 segundos, mantendo a amostra no gelo. Em seguida, use uma pipeta sorológica para a camada 12,5 mililitros de tampão de sacarose de densidade, sob o baixo tampão de sacarose homogeneizar, tomando cuidado para não criar uma bolha que interrompa as camadas de densidade. Centrifugar os tubos a 3200 vezes G, por 20 minutos a quatro graus Celsius.Uma vez que a centrifugação esteja completa, decante imediatamente o supernatante em um movimento de movimento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de remover imediatamente o tubo de Oak Ridge da centrífuga, e rapidamente decantar o supernante. Usando 100 microlitres para um mililitro de solução de resuspensão, suspendemos os núcleos restantes na parede.Evite a carranca de mielina que permanece com a preparação à base de detergente. A falha em fazer essas etapas rapidamente pode resultar em uma preparação de núcleos com detritos celulares em excesso, ou mielina, o que pode impedir o sequenciamento de RNA de núcleo único a jusante. Filtre os núcleos através de um coador de tamanho de poros de 30 a 35 mícrons e colete em um tubo pré-refrigerado.Determine o rendimento dos núcleos, utilizando um hemótmetro para contar núcleos sob um objetivo de 10 x, antes de prosseguir para o sequenciamento de RNA de núcleo único, conforme descrito no protocolo de texto. O campo brilhante e imagens epifluorescentes dos núcleos, isolados usando o protocolo de lise mecânica detergente, são mostrados a 10 x. Esses núcleos são isolados de forma imparcial, permitindo o estudo de perfis de expressão genética endógena ao nível de uma única célula.Mostrado aqui, é um gráfico tSNE representativo de sequenciamento de RNA de núcleo único, de uma medula espinhal lombar de rato, usando uma plataforma de encapsulamento de gotículas massivamente paralela. Núcleos isolados de tecido fresco ou congelado podem ser usados para sequenciamento em plataformas comerciais e acadêmicas. Essa técnica permite que os pesquisadores explorem perfis transcricionais no nível unicelular, utilizando tecidos difíceis de dissociar, como a medula espinhal, ou mesmo tecido congelado, como material biobanco.Ao tentar esse procedimento, é importante reduzir o tempo entre eutanásia e lise celular. Além disso, é importante minimizar as bolhas introduzidas em soluções desde a lise celular até a ressuspensão, e comprar núcleos de animais de estimação com cuidado. Após esse procedimento, os núcleos podem ser utilizados para aplicações alternativas, como a triagem de facs, a fim de isolar tipos de células específicas.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

Esta publicação descreve um protocolo para o isolamento de núcleos de adipócitos maduros, purificação por classificação ativada por fluorescência e transcrição de nível unicelular.

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O isolamento de núcleos únicos depende da dissociação e da permeabilização baseada em detergente da membrana celular, passos que precisam de otimização e são propensos a introduzir artefatos técnicos. Demonstramos um protocolo detergente e sem enzimas para o rápido isolamento de núcleos intactos diretamente de todo o tecido, produzindo núcleos adequados para RNA-seq de núcleo único (snRNA-Seq) ou ATAC-seq.

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A heterogeneidade intra-tumoral é uma característica inerente aos tumores, incluindo gliomas. Desenvolvemos um protocolo simples e eficiente que utiliza uma combinação de buffers e centrífugas gradientes para isolar núcleos únicos de tecidos glioma congelados frescos para estudos de sequenciamento de núcleo único RNA e ATAC.

Isolamento de núcleos de tumores cerebrais congelados frescos para RNA-seq de núcleo único e ATAC-seq

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar núcleos de alta qualidade de rins de camundongos congelados que melhoram a representação de tipos de células renais medulares e evitam os artefatos de expressão gênica da dissociação do tecido enzimático.

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Este protocolo descreve a preparação detalhada e de baixa entrada da amostra para sequenciamento de núcleo único, incluindo a dissecção de gânglios cervicais e estelares superiores do rato, dissociação celular, criopreservação, isolamento do núcleo e bar codificação de hashtag.

Isolamento de núcleo de baixa entrada e multiplexing com anticorpos de código de barras de ganglia simpatizante do rato para sequenciamento de RNA de núcleo único

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Um Protocolo Simples, Rápido e Parcialmente Automatizado para o Isolamento de Núcleos Únicos de Tecidos Congelados de Mamíferos para Sequenciamento de Núcleo Único

O protocolo fornece uma abordagem confiável e otimizada para o isolamento de núcleos de espécimes tumorais sólidos para sequenciamento de multioma usando a plataforma 10x Genomics, incluindo recomendações para condições de dissociação tecidual, criopreservação de suspensões unicelulares e avaliação de núcleos isolados.

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Isolamento dos núcleos de adultos da medula espinhal para a sequenciação do ARN de Single-núcleo maciçamente paralelo

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