Name: Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprenda a purificar tripanosomas africanos do sangue usando colunas de trocadores de aniões DEAE-celulose. Este método padronizado concentra parasitas para diagnóstico preciso da tripanossomíase e pesquisa imunológica, bioquímica e molecular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a todos os membros do UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento interno da Universidade de Bordeaux e apoio da ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 e da Associação pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale e o serviço de Coopération et d'Action culturelle de L'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).

Investigações em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório (NIH publicação n º 85±23, revista em 1996). Os protocolos foram aprovados pelo nosso Comitê de ética local.
1. os animais
<ol><li>Manter camundongos Swiss (de-1) fêmeas com idade de oito a dez semanas de idade, 20-25 g, em um animal habitação facilidade quinze dias antes de cada experimento. Colocá-los em caixas ventiladas que são mantidas em um protegido, temperatura (22 ° C) e umidade (50%) controlado por quarto, com 12 horas on/off ciclo de luz.</li>
	<li>Dê animais livre acesso à comida e água. Minimizar a dor, sofrimento e angústia e proporcionar o enriquecimento do ambiente.</li>
	<li>Para a carcaça, use clear-murado gaiolas, enriquecimento com varas de madeira e papelão túneis. Delicadamente, desenhe um animal dentro de um túnel para transferi-lo da gaiola para a palma da mão.</li>
	<li>Realize monitoramento diário para avaliar sinais de prostração, isolamento social, lesão de corpo, cabelo babado ou falta de higiene.</li>
	<li>Pese cada animal uma vez por semana. Realize inspecções periódicas por um veterinário.</li>
	<li>Para parasitas naturais, coletar sangue no pico da parasitemia e parasitas causando a morte de animais, coletar sangue na véspera da morte presumida. Nota: Todas as experiências com agentes infecciosos são realizadas em salas dedicadas, de acordo com as diretrizes da Universidade aprovada.</li>
</ol>2. buffers, preparações de mídia
<ol><li>Pesar cada substância e adicionar água destilada para os buffers de seguintes:<ol>
<li>Prepare-se concentrada tampão fosfato-salino (2x): Na2HPO4 (anidro) (MW 141,96 g) g 10,14 NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,62 g NaCl (58,44 g de MW) 2,55 g Destilada, H2O para 1 L</li>
		<li>Prepare o tampão fosfato salino-glicose: Na2HPO4 (anidro) (MW 141,96 g) 5,39 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,31 g NaCl (58,44 g de MW) 1,70 g Glicose (180g de MW) 10 g Destilada, H2O para 1 L</li>
		<li>Prepare 1 M KH2PO4.</li>
		<li>Preparar o tampão de eluição: Suplemento tampão fosfato salino-glicose com Penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e vermelho de fenol (5 µ g/mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação do DEAE-celulose
<ol><li>Plano de cerca de 5 horas para a preparação de DEAE-celulose.</li>
	<li>Lave a 100 g de DEAE-celulose com água destilada em um balão com uma garganta estreita e deixe para resolver e, em seguida, descartar partículas finas. Repita lavagens até que o sobrenadante é claro.</li>
	<li>Adicione 3 L de concentrado 2x Phosphate-Buffered salina e mexa.</li>
	<li>Ajustar o pH para 8,0 com 1 M KH2PO4 e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Lave duas vezes com água destilada e deixe repousar.</li>
	<li>Lave e deixe de resolver duas vezes com 3 litros Phosphate-Buffered salina-glicose e descartar os sobrenadantes.</li>
	<li>Medir o volume de celulose e adicionar um volume igual de solução salina Phosphate-Buffered-glicose, distribuir em garrafas de plástico e armazenar a-20 ° C.</li>
</ol>4. parasitas
<ol><li>Recolha as estirpes tripanossoma em áreas endêmicas para tripanossomíase humana e animal. Manter parasitas congeladas em nitrogênio líquido. Nota: Trypanosoma disponibilizado é não-patogênicas para os seres humanos e é uma tripanossoma extracelular usada para substituir com segurança tripanosomas patogênicas em vários experimentos de laboratório.</li>
	<li>No caso de exames laboratoriais que exigem agentes patogénicos humanos, lidar com experiências com cuidado em condições de nível (BSL) apropriadas de risco biológico dedicado segurança e precauções; BSL2 por T. b. gambiense e BSL3 por T. b. rhodesiense. Em condições de campo, prática padrão microbiológica é estabelecida: secure amostragem, pipetagem mecânica, frequente descontaminação de superfícies e esterilização de resíduos.</li>
</ol>5. infecção do Mouse
<ol><li>Descongelar rapidamente parasitas em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Observa-se uma gota de sangue infectado descongelada com um microscópio. Avalie a viabilidade de parasita medindo a porcentagem de formas móveis17.</li>
	<li>Injete parasitas intraperitonealmente em camundongos (0,5 mL por rato). Cada dia, pós infecção, coletar 20 µ l de sangue por punção com agulha e observar ao microscópio. Avalie a parasitemia de acordo com Herbert e Lumsden18 pela contagem de parasitas em vários campos, microscópio, ou usando um haemocytometer.</li>
	<li>Quando a parasitemia atinge um limite definido para cada estirpe, colete o sangue (1 mL/mouse) no tampão de eluição (5 mL/mouse) contendo heparina (10 U/mL). Nota: O trabalho original e inovador de Lanham e Godfrey relatou que a força iônica ideal de fosfato tamponado salina glicose para diversas espécies de parasita/hospedeiro de uma solução de pH 8.0.</li>
</ol>6. separação de parasita
Nota: Todas as experiências a partir deste momento devem ser feitas em uma capa de tecido cultura usando luvas. A temperatura e a umidade nos laboratórios utilizados foram a 22 ° C e 45% respectivamente. Em condições de campo, separação do parasita tem sido realizou com sucesso a 34 ° C.
<ol><li>Coloque uma seringa de 10 mL em um suporte vertical e adicionar uma circular previamente cortada, pedaço de papel de filtro, lã de vidro ou uma esponja de celulose.</li>
	<li>Despeje a celulose DEAE a seringa até o nível 8 mL é alcançada e em seguida lavar com 25 mL de tampão de eluição.</li>
	<li>Cuidadosamente, adicionar 2 mL de sangue diluído no topo da coluna e em seguida, adicionar meio de eluição. Regularmente adicione tampão de eluição de acordo com o trânsito dos tripanosomas.</li>
	<li>Coletar efluentes gotas de colunas em um tubo de centrífuga e verificar regularmente a presença de parasitas com um microscópio.</li>
	<li>Quando parasitas já não são detectadas no efluente da coluna, centrifugar o tubo (1.800 x g, 10 minutos, a 4 ° C no laboratório e à temperatura ambiente em condições de campo).</li>
	<li>Remover o sobrenadante e suspender os parasitas em 1 mL de meio de relevantes necessário para o próximo passo da investigação.</li>
	<li>Contagem de parasitas com um hemocytometer e diluí-los em meio apropriado, se necessário.</li>
</ol>

<ol><li>Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li>
<li>Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).</li>
<li>Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P., Barrett, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+animal+trypanosomiases+and+their+chemotherapy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The animal trypanosomiases and their chemotherapy: a review.</a> Parasitology. 143 (14), 1862-1889 (2016).</li>
<li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis+control%3A+Achievements+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454(2017).</li>
<li>Büscher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li>
<li>Truc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+human+infections+by+animal+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Atypical human infections by animal trypanosomes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (9), e2256(2013).</li>
<li>Lumsden, W. H., Kimber, C. D., Evans, D. A., Doig, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+miniature+anion-exchange+centrifugation+technique+for+detection+of+low+parasitaemias%3A+adaptation+for+field+use%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: miniature anion-exchange centrifugation technique for detection of low parasitaemias: adaptation for field use.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (3), 312-317 (1979).</li>
<li>Büscher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Models+of+Mini+Anion+Exchange+Centrifugation+Technique+%28mAECT%29+and+Modified+Single+Centrifugation+%28MSC%29+for+sleeping+sickness+diagnosis+and+staging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Improved Models of Mini Anion Exchange Centrifugation Technique (mAECT) and Modified Single Centrifugation (MSC) for sleeping sickness diagnosis and staging.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (11), e471(2009).</li>
<li>Lanham, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+trypanosomes+from+the+blood+of+infected+rats+and+mice+by+anion-exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of trypanosomes from the blood of infected rats and mice by anion-exchangers.</a> Nature. 218 (5148), 1273-1274 (1968).</li>
<li>Lanham, S. M., Godfrey, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+salivarian+trypanosomes+from+man+and+other+mammals+using+DEAE-cellulose%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose.</a> Experimental Parasitology. 28 (3), 521-534 (1970).</li>
<li>Humphrey, P. A., Ashraf, M., Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+trypanosomes+in+vivo%2C+host+body+weight+gains%2C+and+food+consumption+in+zinc-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Growth of trypanosomes in vivo, host body weight gains, and food consumption in zinc-deficient mice.</a> Journal of the National Medical Association. 89 (1), 48-56 (1997).</li>
<li>Lowry, J. E., Leonhardt, J. A., Yao, C., Belden, E. L., Andrews, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+C57BL%2F6+mice+by+Trypanosoma+musculi+modulates+host+immune+responses+during+Brucella+abortus+cocolonization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Infection of C57BL/6 mice by Trypanosoma musculi modulates host immune responses during Brucella abortus cocolonization.</a> Journal of Wildlife Diseases. 50 (1), 11-20 (2014).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M., Daulouede, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+antibody+classes+and+Fc+receptors+responsible+for+phagocytosis+of+Trypanosoma+musculi+by+mouse+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Identification of antibody classes and Fc receptors responsible for phagocytosis of Trypanosoma musculi by mouse macrophages.</a> Infection and Immunity. 53 (3), 600-605 (1986).</li>
<li>Vincendeau, P., Daëron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM%2C+IgE%2C+and+IgG+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse%3A+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?</a> Frontiers in Immunology. 9, 778(2018).</li>
<li>Abrahamson, I. A., Da Silva, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-dependent+cytotoxicity+against+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Antibody-dependent cytotoxicity against Trypanosoma cruzi.</a> Parasitology. 75 (3), 317-323 (1977).</li>
<li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+a+rapid+%26%2334%3Bmatching%26%2334%3B+method+for+estimating+the+host%27s+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: a rapid &#34;matching&#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li>
<li>Dauchy, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei+CYP51%3A+Essentiality+and+Targeting+Therapy+in+an+Experimental+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei CYP51: Essentiality and Targeting Therapy in an Experimental Model.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (11), e0005125(2016).</li>
<li>Raz, B., Iten, M., Grether-Bühler, Y., Kaminsky, R., Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Alamar+Blue+assay+to+determine+drug+sensitivity+of+African+trypanosomes+%28T.+b.+rhodesiense+and+T.+b.+gambiense%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">The Alamar Blue assay to determine drug sensitivity of African trypanosomes (T. b. rhodesiense and T. b. gambiense) in vitro.</a> Acta Tropica. 68 (2), 139-147 (1997).</li>
<li>Albright, J. W., Albright, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+growth+of+Trypanosoma+musculi+in+cell-free+medium+conditioned+by+rodent+macrophages+and+mercaptoethanol%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro growth of Trypanosoma musculi in cell-free medium conditioned by rodent macrophages and mercaptoethanol.</a> International Journal for Parasitology. 10 (2), 137-142 (1980).</li>
<li>Gobert, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-Arginine+availability+modulates+local+nitric+oxide+production+and+parasite+killing+in+experimental+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">L-Arginine availability modulates local nitric oxide production and parasite killing in experimental trypanosomiasis.</a> Infection and Immunity. 68 (8), 4653-4657 (2000).</li>
<li>De Muylder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Trypanosoma+brucei+kinesin+heavy+chain+promotes+parasite+growth+by+triggering+host+arginase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">A Trypanosoma brucei kinesin heavy chain promotes parasite growth by triggering host arginase activity.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), e1003731(2013).</li>
<li>Nzoumbou-Boko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+Infection+in+Mice+Critically+Relies+on+Mannose+Receptor-Mediated+Arginase+Induction+by+a+TbKHC1+Kinesin+H+Chain+Homolog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi Infection in Mice Critically Relies on Mannose Receptor-Mediated Arginase Induction by a TbKHC1 Kinesin H Chain Homolog.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1762-1771 (2017).</li>
<li>Bonhivers, M., Nowacki, S., Landrein, N., Robinson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+the+trypanosome+endo-exocytotic+organelle+is+cytoskeleton+mediated%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of the trypanosome endo-exocytotic organelle is cytoskeleton mediated.</a> PLoS Biology. 6 (5), e105(2008).</li>
<li>Albisetti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+flagellar+pocket+collar+and+the+hook+complex+via+a+novel+microtubule-binding+protein+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Interaction between the flagellar pocket collar and the hook complex via a novel microtubule-binding protein in Trypanosoma brucei.</a> PLoS Pathogens. 13 (11), e1006710(2017).</li>
<li>Cross, G. A. M., Klein, R. A., Linstead, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+amino+acids+by+Trypanosoma+brucei+in+culture%3A+L-threonine+as+a+precursor+for+acetate%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Utilization of amino acids by Trypanosoma brucei in culture: L-threonine as a precursor for acetate.</a> Parasitology. 71 (2), 311-326 (1975).</li>
<li>Bringaud, F., Rivière, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+trypanosomatids%3A+adaptation+to+available+carbon+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 149 (1), 1-9 (2006).</li>
<li>Mazet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+the+central+metabolism+of+the+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei%3A+production+of+acetate+in+the+mitochondrion+is+essential+for+the+parasite+viability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Revisiting the central metabolism of the bloodstream forms of Trypanosoma brucei: production of acetate in the mitochondrion is essential for the parasite viability.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (12), e2587(2013).</li>
<li>Coutton, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CFAP43+and+CFAP44+cause+male+infertility+and+flagellum+defects+in+Trypanosoma+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mutations in CFAP43 and CFAP44 cause male infertility and flagellum defects in Trypanosoma and human.</a> Nature Communications. 9 (1), 686(2018).</li>
<li>Cnops, J., Magez, S., De Trez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escape+mechanisms+of+African+trypanosomes%3A+Why+trypanosomosis+is+keeping+us+awake%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Escape mechanisms of African trypanosomes: Why trypanosomosis is keeping us awake.</a> Parasitology. 142 (3), 417-427 (2015).</li>
<li>Barrett, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-Based+Approaches+to+the+Isolation+of+African+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-Based Approaches to the Isolation of African Trypanosomes.</a> Pathogens. 6 (4), (2017).</li>
<li>Taylor, A. E., Lanham, S. M., Williams, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+methods+of+preparation+on+the+infectivity%2C+agglutination%2C+activity%2C+and+ultrastructure+of+bloodstream+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Influence of methods of preparation on the infectivity, agglutination, activity, and ultrastructure of bloodstream trypanosomes.</a> Experimental Parasitology. 35 (2), 196-208 (1974).</li>
<li>Gutteridge, W. E., Cover, B., Gaborak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+blood+and+intracellular+forms+of+Trypanosoma+cruzi+from+rats+and+other+rodents+and+preliminary+studies+of+their+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Isolation of blood and intracellular forms of Trypanosoma cruzi from rats and other rodents and preliminary studies of their metabolism.</a> Parasitology. 76 (2), 159-176 (1978).</li>
<li>Cruz-Saavedra, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Trypanosoma+cruzi+metacyclic+trypomastigotes+by+ion+exchange+chromatography+in+sepharose-DEAE%2C+a+novel+methodology+for+host-pathogen+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes by ion exchange chromatography in sepharose-DEAE, a novel methodology for host-pathogen interaction studies.</a> Journal of Microbiological Methods. 142, 27-32 (2017).</li>
<li>Lemesre, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+protection+against+canine+visceral+leishmaniasis+using+the+LiESAp-MDP+vaccine+in+endemic+areas+of+France%3A+double-blind+randomised+efficacy+field+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Long-lasting protection against canine visceral leishmaniasis using the LiESAp-MDP vaccine in endemic areas of France: double-blind randomised efficacy field trial.</a> Vaccine. 25 (21), 4223-4234 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Tripanosomas purificadas representam um meio poderoso para estudar imunologia, bioquímica, celular e biologia molecular. Grandes extensões de dados e os resultados foram obtidos de tripanosomas, que então tem ajudado a obter informações de outras células eucarióticas30. Tripanosomas são também objecto de investigação importante e interessante porque eles criaram numerosos mecanismos que lhes permitam sobreviver e crescer em dois ambientes muito diferentes: o vetor mosca tsé-tsé e o hospedeiro mamí...

O método apresentado descrito aqui, permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação de parasita permite robusto inquérito sorológico e pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense1. Estes protozoários parasitas multiplicam extracelularmente no sangue, linfa e líquidos intersticiais durante a primeira fase da doença (estágio hemolinfático). O segundo estágio (meningoencephalitic) começa quando parasitas atravessam a barreira hemato-encefálica; sinais neurológicos, incluindo um distúrbio do sono, que deu o seu nome "doença do sono" para esta doença, são típicos deste segundo estágio2. Tripanosomas relacionadas (T. evansi, T. congolensee, T. vivax, T. b. brucei) são os agentes causadores de animal tripanossomose Africana (AAT)3.
A Organização Mundial de saúde (OMS) tem como objetivo eliminar o chapéu como um problema de saúde pública até 2020 e para parar a transmissão por 20304. A recente introdução de testes de diagnóstico rápido tem melhorado diagnóstico sorológico1,4,5. Foram desenvolvido vários testes de diagnóstico molecular, mas seu papel no diagnóstico de campo ainda não foi estabelecido5. Eles são usados para identificar as sub-espécies do grupo brucei e tripanossomíase atípica causada por parasitas responsáveis pela tripanossomose animal6.
A detecção do parasita é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento, como serologia pode dar resultados falsos positivos e infelizmente falso negativo1. A observação microscópica direta destes protistas hemoflagelado é difícil nos casos de chapéu que são causados por T. b. gambiense, (mais de 95% dos casos) como parasitemias baixas são a regra, Considerando que para chapéu causada por T. b. rhodesiense, um grande número de parasitas está frequentemente presente no sangue. Várias técnicas de concentração têm sido utilizadas, tais como a gota espessa e centrifugação do tubo capilar (CTC), mas a separação de parasitas do sangue por uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) seguido de centrifugação e observação microscópica do pellet, é o método mais sensível (cerca de 50 parasitas/mL de sangue pode ser detectado)1,7. Consequentemente, a purificação de tripanosomas por esse método de ânion-trocadores (celulose DEAE) é o melhor e, até à data, o método de referência para visualização e isolando os parasitas do sangue para o diagnóstico de chapéu. Em condições de campo, uma mini coluna de celulose DEAE tem sido utilizada com sucesso e várias melhorias facilitaram a observação microscópica7,8.
O método de separação de tripanossoma do sangue, descrito abaixo, depende a carga superficial do parasita, que é menos negativa do que células de sangue de mamíferos9. Curiosamente, este método foi desenvolvido há 50 anos atrás, em 1968 pelo Dr. Sheila Lanham e continua a ser o padrão ouro para detecção e preparação de tripanosomas da corrente sanguínea. É rápido e reprodutível para salivarian tripanosomas de uma grande variedade de mamíferos, permitindo o diagnóstico de ambos tripanossomíase humana e animal,10.
Para obter vida, purificadas de parasitas, sangue infectado é adicionado em uma coluna de permutador de aniões. Condições cromatográficas (principalmente pH, força iônica de amortecedores/mídia) têm de ser adaptadas a cada espécie de tripanossoma e mais geralmente, para cada combinação de células de sangue de mamíferos e tripanosomas10. Tampão de eluição é precisamente ajustada ao pH de 8 para mais africano tripanosomas10. Esse método favorece a concentração de parasitas no sangue dos pacientes, porque parasitemias pode ser muito baixa para ser detectada por observação microscópica sozinha, e também permite a exames laboratoriais. Trabalhar com tripanosomas recém isoladas e no sangue de animais infectados, usando esta técnica, é mais pertinente para diversas investigações do que os estudos com parasitas que têm sido cultivadas em condições de axénica no laboratório por um período indeterminado.
Relações hospedeiro-parasita são mais bem estudadas com um parasita a infectar seu hospedeiro natural, portanto, T. disponibilizado, um parasita murino natural, que é representante de tripanosomas extracelulares, tem muitas vantagens como infecção murino envolve-se em um animal de laboratório pequeno e não requer condições de nível (BSL) de segurança de risco biológico. T. disponibilizado não mata camundongos imunocompetentes, ao contrário de muitas outras espécies de Trypanosoma , incluindo patógenos humanos. T. disponibilizado não são eliminadas em ratos privados de células T e parasitemias pode ser aumentada em ratos infectados, modificando a ingestão de alimentos e nutrientes11. Este parasita modula a resposta imune em co-infecções com outros patógenos12. T. disponibilizado de diferenças de exposição de ratos infectados de culta T. disponibilizado, por exemplo, a expressão de receptores de membrana Fc é perdida em culturas de axénica T. disponibilizado , em comparação com parasitas purificadas de ratos infectados13 , 14. fatores secretados por Excreted (FSE) também são qualitativa e quantitativamente menos expressos em culturas de tripanossoma axénica e diferem entre as cepas isoladas em áreas endêmicas15. ESF são os antígenos primeiros a ser exibido para o sistema imunológico do hospedeiro e portanto desempenham um papel importante no acolhimento inicial da resposta imune16.
Em animais experimentalmente infectados para exames laboratoriais, este protocolo facilita a experimentação em um número maior de parasitas, minimizando o número de ratos necessárias especialmente ao utilizar animais imunossuprimidos. As glicoproteínas de superfície variantes (VSGs) que são usadas no teste de aglutinação de cartão para tripanossomíase (CATT) em triagem em massa ainda são purificadas de tripanosomas que são propagadas em ratos. Os dois testes diagnósticos rápidos (cassettes embrulhados individualmente) que agora estão disponíveis para uso no campo, ainda estão usando uma fonte infecciosa modelo de nativo VSGs e não em vitro cultivadas tripanosomas1,4, 5. o avanço no estudo da imunologia tripanossoma e biologia tem sido facilitado, desde que estes DEAE celulose purificada parasitas podem ser facilmente obtidas em grandes quantidades de hospedeiros naturalmente ou experimentalmente infectados e em particulares, roedores.

<table><tbody><tr><td>Pipetas de 10 mL&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>357,551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 2 mL&nbsp;</td>Tubo de centrifugação <td>Falcon</td><td>352,507</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td>352,070</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4K15</td><td></td></tr><tr><td>DEAE celulose</td><td>Santa Cruz</td><td>s/c- 211213</td> papel de filtro <td>100 G</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>1,001,125</td><td></td></tr><tr><td>Balão de fundo plano pescoço estreito</td><td>Duran</td><td>21 711 76</td><td>6000 mL</td></tr><tr><td>Glicose&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td>5 000 U</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>120 26936.260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>CH-20</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de microscópio</td><td>Thermofisher scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td> <td>de microscópioThermofisher scientific</td><td>AGAA000001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>100 28026; 260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td>1 KG</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>110 33616; 262</td><td>Garrafas</td></tr><tr><td>de mídia plástica Nalgene de 500 g tamanho 125 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0125</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de mídia plástica Nalgene tamanho 500 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0500</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Pasteur VWR</td><td>BRND125400</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina 10.000 UI/Streptomycin 10.000 &micro; g</td><td>EUROBIO</td><td>CABPES01 OU</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Fenol vermelho</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td>Seringa de 100 mL</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>SS+10S21381</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de cultura de tecidos</td><td>Thermoelectro Corporation</td><td>MSC-12</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei brucei</td><td>Institute of Tropical Medicine (Antuérpia, Bélgica).</td><td></td><td>ANTAT 1.1</td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei gambiense</td><td>Instituto de Medicina Tropical (Antuérpia, Bélgica).</td><td></td><td>ITMAP 1893</td></tr><tr><td>Trypanosoma musculi</td><td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td><td></td><td>Partinico II</td></tr></tbody></table>

purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-diethylaminoethyl)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Este método permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue infectado. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação do parasita permite serológico e investigações de pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense. Tripanosomas relacionadas são os agentes causadores da tripanossomíase animal. Detecção de tripanossoma é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento de chapéu. A técnica descrita aqui é a técnica de deteção de parasita mais sensível, adaptada às condições de campo para o diagnóstico de T. b. gambiense chapéu e pode ser concluída no prazo de uma hora. Sangue é mergulhado em uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) previamente ajustada ao pH 8 e tampão de eluição é adicionado. Altamente negativamente carregados de glóbulos são adsorvidos na coluna Considerando que atravessam as tripanosomas menos negativamente carregadas. Tripanosomas coletadas peletizadas por centrifugação e observadas por microscopia. Além disso, parasitas preparam-se, sem dano celular, embora mantendo sua infecciosidade.
Tripanosomas purificadas são necessárias para testes imunológicos; Eles são usados no ensaio de trypanolysis, o padrão-ouro na serologia de chapéu. Manchado de parasitas são utilizadas no teste de aglutinação de cartão (CATT) para sorologia de campo. Antígenos de tripanosomas purificadas, como a glicoproteína de superfície variante, exoantigens, também são utilizados em diversos imunoensaios. O procedimento descrito aqui é projetado para tripanosomas africanas; por conseguinte, condições cromatográficas tem que ser adaptado para cada estirpe tripanossoma e mais geralmente, para o sangue de cada espécie de hospedeiro mamífero.
Estas fascinantes patógenos são facilmente purificada e disponíveis para uso em bioquímicos, moleculares e estudos de biologia, incluindo co-cultura com células hospedeiras para investigar relações hospedeiro-parasita a nível dos receptores de membrana, sinalização e gene da pilha expressão; drogas testes em vitro; investigação de exclusão genética, mutação ou superexpressão em processos metabólicos, a biogênese do citoesqueleto e a sobrevivência do parasita.

Tripanosomas purificadas foram usadas em testes farmacêuticos. Parasitas são transferidas para poços de cultura contendo diluições em série de drogas específicas, sozinho ou misturado19. Observações microscópicas, avaliar a motilidade é um marcador da viabilidade, pode ser executada quando estão a ser testados apenas alguns dugs, Considerando que o ensaio da viabilidade de células AlamarBlue é um excelente método para ensaios de grande mobilidade durante<sup class=...

Este método de separação de tripanossoma do sangue varia de acordo com sua carga de superfície, sendo menos negativo do que células de sangue de mamíferos. Sangue contaminado é colocado e tratado em uma coluna de permutador de aniões. Esse método, o mais apropriado diagnóstico para tripanossomíase africana, fornece parasitas purificadas para investigações de imunológicos, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e de biologia molecular.

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Os trypanosomes africanos são responsáveis pela triplosomiase africana humana, ou doença do sono e tripanosomiase animal africano. Os trypanosomos que causam a doença do sono são parasitas protistas transmitidos por moscas tsé-tsé presentes em muitos focos geográficos na África subsaariana. A detecção do parasita é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento.Uma sorologia pode dar falso positivo e, infelizmente, resultados falsos negativos. Para ajudar na detecção do sangue, os tripanossomos devem estar concentrados. Várias técnicas de concentração de parasitas foram usadas.O método mais sensível é a separação de parasitas do sangue por uma coluna de trocador de ânion, celulose DEAE seguida de centrifugação e observação microscópica. Consequentemente, o método de celulose DEAE é o melhor e permanece até o momento, o método de referência para visualizar e isolar parasitas do sangue para o diagnóstico de tripanosomiase africana humana, especialmente em condições de campo. Este método, o diagnóstico mais adequado para a triplosomiase africana também fornece parasitas purificados para investigações biológicas, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e moleculares.Todas as

purification-extracellular-trypanosomes-including-african-from-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Mama é uma proteína Magnetosome único associado que foi mostrado para ser envolvido na ativação magnetosome. Aqui apresentamos o protocolo de purificação da Mama exclusão mutante (MamAΔ41)...

Purificação do M. magneticum Strain AMB-1 proteína associada Magnetosome MamAΔ41

Neste vídeo, demonstramos uma técnica de cromatografia de troca aniônica para purificar a proteína de ligação ao cálcio humano S100A12 com base na carga superficial líquida da proteína de uma cultura de Escherichia coli.

Purificação de proteínas baseada em cromatografia de troca aniônica: uma técnica de separação para isolar uma proteína de interesse do lisado bacteriano dialisado com base na carga líquida

Este vídeo demonstra a técnica de cromatografia de troca catiônica para isolar a proteína recombinante do lisado de proteína de célula de inseto.

Cromatografia de troca catiônica: uma técnica para isolar a proteína recombinante alvo do lisado de células de insetos com base na carga superficial líquida

Este vídeo demonstra a técnica de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para purificar vesículas extracelulares bacterianas (EVs) do filtrado de cultura de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). A técnica utiliza uma coluna porosa embalada com resina para obter frações purificadas de EVs. As partículas porosas permitem seletivamente que proteínas menores entrem nos poros, resultando em eluição mais lenta. Ao mesmo tempo, os EVs são excluídos de entrar nos poros devido ao seu tamanho maior e são...

Uma técnica de cromatografia de exclusão de tamanho para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

Medindo função anticorpo é fundamental para compreender a imunidade para Plasmodium falciparum da malária. Este método descreve o purificação dos merozoitos viáveis, e medição da fagocitose dependente de opsonização por citometria de fluxo.

High Yield purificação<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoítos Para uso em opsonizantes Anticorpo Ensaios

O método Tandem Affinity Purification (TAP) tem sido amplamente utilizado para isolar complexos nativos de extrato celular, principalmente eucariótico, para proteômica. Aqui, apresentamos um protocolo do método TAP otimizado para purificação de complexos nativos para estudos estruturais.

Purificação de Native Complexos de estudo estrutural usando um método Tag Tandem Affinity

Este protocolo descreve a purificação de F1-ATPase do palco inseto cultivado de Trypanosoma brucei. O procedimento produz um complexo altamente puro, homogêneo e ativo adequado para estudos estruturais e enzimáticos.

Isolamento de F1-ATPase do Protista parasita Trypanosoma brucei

Este protocolo isola vesículas extracelulares (EVs) longe de virions com alta eficiência e rendimento através da incorporação de precipitação EV, ultracentlee gradiente de densidade, e captura de partículas para permitir um fluxo de trabalho simplificado e uma redução de partida requisitos de volume, resultando em preparações reprodutíveis para uso em todas as pesquisas EV.

Purificação de preparações de vesículas extracelulares de alto rendimento longe do vírus

Este protocolo descreve um método da purificação para a proteína obrigatória tag-livre de recombinação do cálcio S100A12 e seus oligômeros íon-induzidos para ensaios humanos da estimulação do monocyte.

Purificação do S100A12 humano e seus Oligomers íon-induzidos para a estimulação imune da pilha

O protocolo descreve a preparação de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) com fragmentos de membrana celular imobilizada contendo proteínas funcionais do receptor B transmembrano. Também é explicado o uso de colunas CMAC na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com esses receptores e presentes em complexas misturas naturais.

Colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular para identificar metabólitos de plantas especializadas interagindo com tropomyosina quinase imobilizada receptor B

As bactérias secretam vesículas extracelulares (EVs) de tamanho nanométrico que transportam moléculas biológicas bioativas. A pesquisa EV se concentra na compreensão de sua biogênese, papel nas interações micróbio-micróbio e hospedeiro-micróbio e doença, bem como suas potenciais aplicações terapêuticas. Um fluxo de trabalho para isolamento escalável de EVs de várias bactérias é apresentado para facilitar a padronização da pesquisa de EV.

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Aprenda a purificar tripanosomas africanos do sangue usando colunas de trocadores de aniões DEAE-celulose. Este método padronizado concentra parasitas para diagnóstico preciso da tripanossomíase e pesquisa imunológica, bioquímica e molecular.

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl) (Vídeo) | JoVE Journal

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

Explorar mais vídeos