Name: Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Aprenda a purificar tripanosomas africanos do sangue usando colunas de trocadores de aniões DEAE-celulose. Este método padronizado concentra parasitas para diagnóstico preciso da tripanossomíase e pesquisa imunológica, bioquímica e molecular.

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Agradecemos a todos os membros do UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Esta pesquisa foi apoiada pelo financiamento interno da Universidade de Bordeaux e apoio da ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024 e da Associação pour le développement de la recherche en parasitologie et médecine tropicale e o serviço de Coopération et d'Action culturelle de L'Ambassade de France à Bangui (Centrafrique).

Investigações em conformidade com as orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório (NIH publicação n º 85±23, revista em 1996). Os protocolos foram aprovados pelo nosso Comitê de ética local.
1. os animais
<ol><li>Manter camundongos Swiss (de-1) fêmeas com idade de oito a dez semanas de idade, 20-25 g, em um animal habitação facilidade quinze dias antes de cada experimento. Colocá-los em caixas ventiladas que são mantidas em um protegido, temperatura (22 ° C) e umidade (50%) controlado por quarto, com 12 horas on/off ciclo de luz.</li>
	<li>Dê animais livre acesso à comida e água. Minimizar a dor, sofrimento e angústia e proporcionar o enriquecimento do ambiente.</li>
	<li>Para a carcaça, use clear-murado gaiolas, enriquecimento com varas de madeira e papelão túneis. Delicadamente, desenhe um animal dentro de um túnel para transferi-lo da gaiola para a palma da mão.</li>
	<li>Realize monitoramento diário para avaliar sinais de prostração, isolamento social, lesão de corpo, cabelo babado ou falta de higiene.</li>
	<li>Pese cada animal uma vez por semana. Realize inspecções periódicas por um veterinário.</li>
	<li>Para parasitas naturais, coletar sangue no pico da parasitemia e parasitas causando a morte de animais, coletar sangue na véspera da morte presumida. Nota: Todas as experiências com agentes infecciosos são realizadas em salas dedicadas, de acordo com as diretrizes da Universidade aprovada.</li>
</ol>2. buffers, preparações de mídia
<ol><li>Pesar cada substância e adicionar água destilada para os buffers de seguintes:<ol>
<li>Prepare-se concentrada tampão fosfato-salino (2x): Na2HPO4 (anidro) (MW 141,96 g) g 10,14 NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,62 g NaCl (58,44 g de MW) 2,55 g Destilada, H2O para 1 L</li>
		<li>Prepare o tampão fosfato salino-glicose: Na2HPO4 (anidro) (MW 141,96 g) 5,39 g NaH2PO4∙2H2O (MW 156,01 g) 0,31 g NaCl (58,44 g de MW) 1,70 g Glicose (180g de MW) 10 g Destilada, H2O para 1 L</li>
		<li>Prepare 1 M KH2PO4.</li>
		<li>Preparar o tampão de eluição: Suplemento tampão fosfato salino-glicose com Penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 µ g/mL) e vermelho de fenol (5 µ g/mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparação do DEAE-celulose
<ol><li>Plano de cerca de 5 horas para a preparação de DEAE-celulose.</li>
	<li>Lave a 100 g de DEAE-celulose com água destilada em um balão com uma garganta estreita e deixe para resolver e, em seguida, descartar partículas finas. Repita lavagens até que o sobrenadante é claro.</li>
	<li>Adicione 3 L de concentrado 2x Phosphate-Buffered salina e mexa.</li>
	<li>Ajustar o pH para 8,0 com 1 M KH2PO4 e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Lave duas vezes com água destilada e deixe repousar.</li>
	<li>Lave e deixe de resolver duas vezes com 3 litros Phosphate-Buffered salina-glicose e descartar os sobrenadantes.</li>
	<li>Medir o volume de celulose e adicionar um volume igual de solução salina Phosphate-Buffered-glicose, distribuir em garrafas de plástico e armazenar a-20 ° C.</li>
</ol>4. parasitas
<ol><li>Recolha as estirpes tripanossoma em áreas endêmicas para tripanossomíase humana e animal. Manter parasitas congeladas em nitrogênio líquido. Nota: Trypanosoma disponibilizado é não-patogênicas para os seres humanos e é uma tripanossoma extracelular usada para substituir com segurança tripanosomas patogênicas em vários experimentos de laboratório.</li>
	<li>No caso de exames laboratoriais que exigem agentes patogénicos humanos, lidar com experiências com cuidado em condições de nível (BSL) apropriadas de risco biológico dedicado segurança e precauções; BSL2 por T. b. gambiense e BSL3 por T. b. rhodesiense. Em condições de campo, prática padrão microbiológica é estabelecida: secure amostragem, pipetagem mecânica, frequente descontaminação de superfícies e esterilização de resíduos.</li>
</ol>5. infecção do Mouse
<ol><li>Descongelar rapidamente parasitas em banho maria a 37 ° C.</li>
	<li>Observa-se uma gota de sangue infectado descongelada com um microscópio. Avalie a viabilidade de parasita medindo a porcentagem de formas móveis17.</li>
	<li>Injete parasitas intraperitonealmente em camundongos (0,5 mL por rato). Cada dia, pós infecção, coletar 20 µ l de sangue por punção com agulha e observar ao microscópio. Avalie a parasitemia de acordo com Herbert e Lumsden18 pela contagem de parasitas em vários campos, microscópio, ou usando um haemocytometer.</li>
	<li>Quando a parasitemia atinge um limite definido para cada estirpe, colete o sangue (1 mL/mouse) no tampão de eluição (5 mL/mouse) contendo heparina (10 U/mL). Nota: O trabalho original e inovador de Lanham e Godfrey relatou que a força iônica ideal de fosfato tamponado salina glicose para diversas espécies de parasita/hospedeiro de uma solução de pH 8.0.</li>
</ol>6. separação de parasita
Nota: Todas as experiências a partir deste momento devem ser feitas em uma capa de tecido cultura usando luvas. A temperatura e a umidade nos laboratórios utilizados foram a 22 ° C e 45% respectivamente. Em condições de campo, separação do parasita tem sido realizou com sucesso a 34 ° C.
<ol><li>Coloque uma seringa de 10 mL em um suporte vertical e adicionar uma circular previamente cortada, pedaço de papel de filtro, lã de vidro ou uma esponja de celulose.</li>
	<li>Despeje a celulose DEAE a seringa até o nível 8 mL é alcançada e em seguida lavar com 25 mL de tampão de eluição.</li>
	<li>Cuidadosamente, adicionar 2 mL de sangue diluído no topo da coluna e em seguida, adicionar meio de eluição. Regularmente adicione tampão de eluição de acordo com o trânsito dos tripanosomas.</li>
	<li>Coletar efluentes gotas de colunas em um tubo de centrífuga e verificar regularmente a presença de parasitas com um microscópio.</li>
	<li>Quando parasitas já não são detectadas no efluente da coluna, centrifugar o tubo (1.800 x g, 10 minutos, a 4 ° C no laboratório e à temperatura ambiente em condições de campo).</li>
	<li>Remover o sobrenadante e suspender os parasitas em 1 mL de meio de relevantes necessário para o próximo passo da investigação.</li>
	<li>Contagem de parasitas com um hemocytometer e diluí-los em meio apropriado, se necessário.</li>
</ol>

<ol><li>Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).</li>
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<li>Aksoy, S., Buscher, P., Lehane, M., Solano, P., Van Den Abbeele, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis+control%3A+Achievements+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis control: Achievements and challenges.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (4), e0005454(2017).</li>
<li>Büscher, P., Deborggraeve, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+can+molecular+diagnostics+contribute+to+the+elimination+of+human+African+trypanosomiasis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">How can molecular diagnostics contribute to the elimination of human African trypanosomiasis?</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 15 (5), 607-615 (2015).</li>
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<li>Vincendeau, P., Daëron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+musculi+co-express+several+receptors+binding+rodent+IgM%2C+IgE%2C+and+IgG+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma musculi co-express several receptors binding rodent IgM, IgE, and IgG subclasses.</a> Journal of Immunology. 142 (5), 1702-1709 (1989).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+pathogenicity+patterns+of+Trypanosoma+bruceigambiense+field+isolates+in+experimentally+infected+mouse%3A+differences+in+host+immune+response+modulation+by+secretome+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Virulence and pathogenicity patterns of Trypanosoma bruceigambiense field isolates in experimentally infected mouse: differences in host immune response modulation by secretome and proteomics.</a> Microbes and Infections. 10 (1), 79-86 (2008).</li>
<li>Holzmuller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+parasites+and+their+excreted-secreted+factors+modulate+the+inducible+metabolism+of+L-arginine+in+macrophages%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">How do parasites and their excreted-secreted factors modulate the inducible metabolism of L-arginine in macrophages?</a> Frontiers in Immunology. 9, 778(2018).</li>
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<li>Herbert, W. J., Lumsden, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosoma+brucei%3A+a+rapid+%26%2334%3Bmatching%26%2334%3B+method+for+estimating+the+host%27s+parasitemia%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosoma brucei: a rapid &#34;matching&#34; method for estimating the host's parasitemia.</a> Experimental Parasitology. 40 (3), 427-431 (1976).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Tripanosomas purificadas representam um meio poderoso para estudar imunologia, bioquímica, celular e biologia molecular. Grandes extensões de dados e os resultados foram obtidos de tripanosomas, que então tem ajudado a obter informações de outras células eucarióticas30. Tripanosomas são também objecto de investigação importante e interessante porque eles criaram numerosos mecanismos que lhes permitam sobreviver e crescer em dois ambientes muito diferentes: o vetor mosca tsé-tsé e o hospedeiro mamí...

O método apresentado descrito aqui, permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação de parasita permite robusto inquérito sorológico e pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense1. Estes protozoários parasitas multiplicam extracelularmente no sangue, linfa e líquidos intersticiais durante a primeira fase da doença (estágio hemolinfático). O segundo estágio (meningoencephalitic) começa quando parasitas atravessam a barreira hemato-encefálica; sinais neurológicos, incluindo um distúrbio do sono, que deu o seu nome "doença do sono" para esta doença, são típicos deste segundo estágio2. Tripanosomas relacionadas (T. evansi, T. congolensee, T. vivax, T. b. brucei) são os agentes causadores de animal tripanossomose Africana (AAT)3.
A Organização Mundial de saúde (OMS) tem como objetivo eliminar o chapéu como um problema de saúde pública até 2020 e para parar a transmissão por 20304. A recente introdução de testes de diagnóstico rápido tem melhorado diagnóstico sorológico1,4,5. Foram desenvolvido vários testes de diagnóstico molecular, mas seu papel no diagnóstico de campo ainda não foi estabelecido5. Eles são usados para identificar as sub-espécies do grupo brucei e tripanossomíase atípica causada por parasitas responsáveis pela tripanossomose animal6.
A detecção do parasita é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento, como serologia pode dar resultados falsos positivos e infelizmente falso negativo1. A observação microscópica direta destes protistas hemoflagelado é difícil nos casos de chapéu que são causados por T. b. gambiense, (mais de 95% dos casos) como parasitemias baixas são a regra, Considerando que para chapéu causada por T. b. rhodesiense, um grande número de parasitas está frequentemente presente no sangue. Várias técnicas de concentração têm sido utilizadas, tais como a gota espessa e centrifugação do tubo capilar (CTC), mas a separação de parasitas do sangue por uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) seguido de centrifugação e observação microscópica do pellet, é o método mais sensível (cerca de 50 parasitas/mL de sangue pode ser detectado)1,7. Consequentemente, a purificação de tripanosomas por esse método de ânion-trocadores (celulose DEAE) é o melhor e, até à data, o método de referência para visualização e isolando os parasitas do sangue para o diagnóstico de chapéu. Em condições de campo, uma mini coluna de celulose DEAE tem sido utilizada com sucesso e várias melhorias facilitaram a observação microscópica7,8.
O método de separação de tripanossoma do sangue, descrito abaixo, depende a carga superficial do parasita, que é menos negativa do que células de sangue de mamíferos9. Curiosamente, este método foi desenvolvido há 50 anos atrás, em 1968 pelo Dr. Sheila Lanham e continua a ser o padrão ouro para detecção e preparação de tripanosomas da corrente sanguínea. É rápido e reprodutível para salivarian tripanosomas de uma grande variedade de mamíferos, permitindo o diagnóstico de ambos tripanossomíase humana e animal,10.
Para obter vida, purificadas de parasitas, sangue infectado é adicionado em uma coluna de permutador de aniões. Condições cromatográficas (principalmente pH, força iônica de amortecedores/mídia) têm de ser adaptadas a cada espécie de tripanossoma e mais geralmente, para cada combinação de células de sangue de mamíferos e tripanosomas10. Tampão de eluição é precisamente ajustada ao pH de 8 para mais africano tripanosomas10. Esse método favorece a concentração de parasitas no sangue dos pacientes, porque parasitemias pode ser muito baixa para ser detectada por observação microscópica sozinha, e também permite a exames laboratoriais. Trabalhar com tripanosomas recém isoladas e no sangue de animais infectados, usando esta técnica, é mais pertinente para diversas investigações do que os estudos com parasitas que têm sido cultivadas em condições de axénica no laboratório por um período indeterminado.
Relações hospedeiro-parasita são mais bem estudadas com um parasita a infectar seu hospedeiro natural, portanto, T. disponibilizado, um parasita murino natural, que é representante de tripanosomas extracelulares, tem muitas vantagens como infecção murino envolve-se em um animal de laboratório pequeno e não requer condições de nível (BSL) de segurança de risco biológico. T. disponibilizado não mata camundongos imunocompetentes, ao contrário de muitas outras espécies de Trypanosoma , incluindo patógenos humanos. T. disponibilizado não são eliminadas em ratos privados de células T e parasitemias pode ser aumentada em ratos infectados, modificando a ingestão de alimentos e nutrientes11. Este parasita modula a resposta imune em co-infecções com outros patógenos12. T. disponibilizado de diferenças de exposição de ratos infectados de culta T. disponibilizado, por exemplo, a expressão de receptores de membrana Fc é perdida em culturas de axénica T. disponibilizado , em comparação com parasitas purificadas de ratos infectados13 , 14. fatores secretados por Excreted (FSE) também são qualitativa e quantitativamente menos expressos em culturas de tripanossoma axénica e diferem entre as cepas isoladas em áreas endêmicas15. ESF são os antígenos primeiros a ser exibido para o sistema imunológico do hospedeiro e portanto desempenham um papel importante no acolhimento inicial da resposta imune16.
Em animais experimentalmente infectados para exames laboratoriais, este protocolo facilita a experimentação em um número maior de parasitas, minimizando o número de ratos necessárias especialmente ao utilizar animais imunossuprimidos. As glicoproteínas de superfície variantes (VSGs) que são usadas no teste de aglutinação de cartão para tripanossomíase (CATT) em triagem em massa ainda são purificadas de tripanosomas que são propagadas em ratos. Os dois testes diagnósticos rápidos (cassettes embrulhados individualmente) que agora estão disponíveis para uso no campo, ainda estão usando uma fonte infecciosa modelo de nativo VSGs e não em vitro cultivadas tripanosomas1,4, 5. o avanço no estudo da imunologia tripanossoma e biologia tem sido facilitado, desde que estes DEAE celulose purificada parasitas podem ser facilmente obtidas em grandes quantidades de hospedeiros naturalmente ou experimentalmente infectados e em particulares, roedores.

<table><tbody><tr><td>Pipetas de 10 mL&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>357,551</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de 2 mL&nbsp;</td>Tubo de centrifugação <td>Falcon</td><td>352,507</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td>352,070</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4K15</td><td></td></tr><tr><td>DEAE celulose</td><td>Santa Cruz</td><td>s/c- 211213</td> papel de filtro <td>100 G</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Whatman</td><td>1,001,125</td><td></td></tr><tr><td>Balão de fundo plano pescoço estreito</td><td>Duran</td><td>21 711 76</td><td>6000 mL</td></tr><tr><td>Glicose&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101174Y</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149-50KU</td><td>5 000 U</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>VWR</td><td>120 26936.260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>CH-20</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de microscópio</td><td>Thermofisher scientific</td><td>CB00100RA020MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas</td> <td>de microscópioThermofisher scientific</td><td>AGAA000001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>100 28026; 260</td><td>500 G</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR</td><td>27800.291</td><td>1 KG</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp;</td><td>VWR</td><td>110 33616; 262</td><td>Garrafas</td></tr><tr><td>de mídia plástica Nalgene de 500 g tamanho 125 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0125</td><td></td></tr><tr><td>Garrafas de mídia plástica Nalgene tamanho 500 mL</td><td>Thermofisher scientific</td><td>342024-0500</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Pasteur VWR</td><td>BRND125400</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina 10.000 UI/Streptomycin 10.000 &micro; g</td><td>EUROBIO</td><td>CABPES01 OU</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Fenol vermelho</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0290</td><td>Seringa de 100 mL</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Dutscher</td><td>SS+10S21381</td><td></td></tr><tr><td>Capuz de cultura de tecidos</td><td>Thermoelectro Corporation</td><td>MSC-12</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei brucei</td><td>Institute of Tropical Medicine (Antuérpia, Bélgica).</td><td></td><td>ANTAT 1.1</td></tr><tr><td>Trypanosoma brucei gambiense</td><td>Instituto de Medicina Tropical (Antuérpia, Bélgica).</td><td></td><td>ITMAP 1893</td></tr><tr><td>Trypanosoma musculi</td><td>London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK)</td><td></td><td>Partinico II</td></tr></tbody></table>

purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-diethylaminoethyl)

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

Este método permite a separação dos tripanosomas, parasitas responsáveis pela tripanossomíase africana animal e humana (chapéu), do sangue infectado. Este é o melhor método para o diagnóstico da primeira etapa de chapéu e além disso, este método de purificação do parasita permite serológico e investigações de pesquisa.
CHAPÉU é causada pela mosca tsé-tsé transmitida o Trypanosoma brucei gambiense e T. b. rhodesiense. Tripanosomas relacionadas são os agentes causadores da tripanossomíase animal. Detecção de tripanossoma é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento de chapéu. A técnica descrita aqui é a técnica de deteção de parasita mais sensível, adaptada às condições de campo para o diagnóstico de T. b. gambiense chapéu e pode ser concluída no prazo de uma hora. Sangue é mergulhado em uma coluna de permutador de aniões (celulose DEAE) previamente ajustada ao pH 8 e tampão de eluição é adicionado. Altamente negativamente carregados de glóbulos são adsorvidos na coluna Considerando que atravessam as tripanosomas menos negativamente carregadas. Tripanosomas coletadas peletizadas por centrifugação e observadas por microscopia. Além disso, parasitas preparam-se, sem dano celular, embora mantendo sua infecciosidade.
Tripanosomas purificadas são necessárias para testes imunológicos; Eles são usados no ensaio de trypanolysis, o padrão-ouro na serologia de chapéu. Manchado de parasitas são utilizadas no teste de aglutinação de cartão (CATT) para sorologia de campo. Antígenos de tripanosomas purificadas, como a glicoproteína de superfície variante, exoantigens, também são utilizados em diversos imunoensaios. O procedimento descrito aqui é projetado para tripanosomas africanas; por conseguinte, condições cromatográficas tem que ser adaptado para cada estirpe tripanossoma e mais geralmente, para o sangue de cada espécie de hospedeiro mamífero.
Estas fascinantes patógenos são facilmente purificada e disponíveis para uso em bioquímicos, moleculares e estudos de biologia, incluindo co-cultura com células hospedeiras para investigar relações hospedeiro-parasita a nível dos receptores de membrana, sinalização e gene da pilha expressão; drogas testes em vitro; investigação de exclusão genética, mutação ou superexpressão em processos metabólicos, a biogênese do citoesqueleto e a sobrevivência do parasita.

Tripanosomas purificadas foram usadas em testes farmacêuticos. Parasitas são transferidas para poços de cultura contendo diluições em série de drogas específicas, sozinho ou misturado19. Observações microscópicas, avaliar a motilidade é um marcador da viabilidade, pode ser executada quando estão a ser testados apenas alguns dugs, Considerando que o ensaio da viabilidade de células AlamarBlue é um excelente método para ensaios de grande mobilidade durante<sup class=...

Este método de separação de tripanossoma do sangue varia de acordo com sua carga de superfície, sendo menos negativo do que células de sangue de mamíferos. Sangue contaminado é colocado e tratado em uma coluna de permutador de aniões. Esse método, o mais apropriado diagnóstico para tripanossomíase africana, fornece parasitas purificadas para investigações de imunológicos, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e de biologia molecular.

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

Os trypanosomes africanos são responsáveis pela triplosomiase africana humana, ou doença do sono e tripanosomiase animal africano. Os trypanosomos que causam a doença do sono são parasitas protistas transmitidos por moscas tsé-tsé presentes em muitos focos geográficos na África subsaariana. A detecção do parasita é essencial para o diagnóstico, tratamento e acompanhamento.Uma sorologia pode dar falso positivo e, infelizmente, resultados falsos negativos. Para ajudar na detecção do sangue, os tripanossomos devem estar concentrados. Várias técnicas de concentração de parasitas foram usadas.O método mais sensível é a separação de parasitas do sangue por uma coluna de trocador de ânion, celulose DEAE seguida de centrifugação e observação microscópica. Consequentemente, o método de celulose DEAE é o melhor e permanece até o momento, o método de referência para visualizar e isolar parasitas do sangue para o diagnóstico de tripanosomiase africana humana, especialmente em condições de campo. Este método, o diagnóstico mais adequado para a triplosomiase africana também fornece parasitas purificados para investigações biológicas, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e moleculares.Todas as investigações conformes ao guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e acordo foram obtidas das autoridades francesas e todos os protocolos utilizados foram aprovados pelo nosso comitê de ética local. Pesar cada substância de acordo com o protocolo escrito. Adicione água destilada e ajuste precisamente ao pH 8 com fosfato de dihidrogênio de potássio para fazer as seguintes soluções tamponadas, concentrado tampão de fosfato salina 2X.Adicione água destilada e glicose para glicose salina tamponada com fosfato. Para 100 mililitros de tampão de elução, adicione 100 unidades por mililitro de penicilina, 100 microgramas por mililitro de estreptomicina, e cinco microgramas mililiter de fenol vermelho à glicose salina tamponada fosfato. 100 gramas de celulose DEAE é primeiro lavada com três litros de água destilada e depois deixada para se instalar.Partículas finas são descartadas. As lavagens são repetidas até que o supernatante esteja claro. O soro fisiológico tamponado 2X é adicionado e a celulose DEAE é agitada.O pH é ajustado para oito com um fosfato de potássio molar. A celulose é então lavada duas vezes com água destilada e duas vezes com glicose salina tamponada de fosfato. A glicose salina tamponada de celulose DEAE e fosfato são misturadas em volumes iguais.A ação esquartejada e armazenada à temperatura ambiente ou a quatro graus celsius ou a menos 20 graus celsius para armazenamento prolongado. O sangue infectado por tripanossomo é armazenado em nitrogênio líquido. Um litro de liga de um mililitro é descongelado à temperatura ambiente.Os parasitas são cuidadosamente coletados do crioboto usando uma agulha e uma seringa de um mililitro. A viabilidade dos parasitas descongelados é avaliada pela motilidade visualizada pela observação da microscopia leve antes da infecção. Parasitas são injetados nas cavidades peritoneais de dois camundongos, 500 microliters por rato.A cada dia após a infecção, a parasitamia é avaliada coletando uma gota de sangue da cauda com uma agulha e verificada por microscopia. Quando a parasitamia está em um nível adequado, o sangue infectado é coletado. Uma seringa de 10 mililitros é suportada em um grampo ou suporte e um pedaço de papel filtro pré-cortado é adicionado.A celulose DEAE preparada é derramada na seringa até o nível de oito ou nove mililitros. A coluna é lavada com o tampão de eluição. Dois mililitros de sangue infectado são cuidadosamente colocados no topo da coluna e os trypanosomes são coletados na coluna elunato em um tubo de centrifugação de 50 mililitros.O buffer de elução é adicionado regularmente de acordo com o trânsito de tripanossmos. O trânsito de trypanossomes através da coluna é verificado tomando uma gota de elunato de coluna em intervalos regulares e observando para trypanossomes usando microscopia leve. Quando os trypanossomos não são mais observados no eluato, o tubo cônico é centrifugar a 1.800 vezes G durante 10 minutos a quatro graus celsius.O supernatante é descartado e os trypanossomes na paleta são contados com um hemócito. Os trypanossmos coletados são posteriormente diluídos no meio necessário para a investigação planejada. Este método, o diagnóstico mais adequado para a triplosomiase africana fornece parasitas purificados para investigações biológicas, biológicas, bioquímicas, farmacêuticas e moleculares.Esses estudos foram desenvolvidos porque parasitas purificados de celulose DEAE podem ser facilmente obtidos em grandes quantidades de hospedeiros infectados naturalmente ou experimentalmente e, em particular, roedores. A viabilidade do tripanossomo na presença de agentes farmacêuticos é avaliada pela observação microscópica. A viabilidade do parasita está associada à motilidade e, portanto, pode ser verificada olho sob um microscópio leve a 40 vezes ou maior ampliação.A viabilidade do parasita é avaliada medindo a porcentagem de formas motile. Diluições de compostos de teste são adicionadas em cada poço de uma placa de cultura de tecido de 96 poços, enquanto poços de controle são tratados simulados. Cada concentração é avaliada em triplicado.O número de parasitas viáveis para cada diluição é comparado com o número de parasitas em poços de controle. Os efeitos da Pentamidina, uma droga de referência, usada na terapia de tripanosomiase africana humana é exibida nesta figura. Co-culturas de macrófago trypanosome permitem a investigação da interação do parasita hospedeiro no nível celular.Nas co-culturas de parasitas macrófagos, tripanossomos celulares extras induzem a produção de arginase macrófago que hidrolisa arginina à ornitina. Ornitina é o precursor de poliaminas e tripanothione, essencial para a sobrevivência e crescimento de parasitas. Além disso, o esgotamento da arginina diminui a produção de óxido nítrico trypanocida.Posteriormente, a adição de um inibidor de arginase, S-L-cisteína às co-culturas reduz drasticamente o crescimento de parasitas induzidos pelo macrófago. A indução de arginase é mediada por fatores excretados e ou secretados. Este fator de indução de arginase foi identificado como uma cinesina orthina.A cinesina se liga aos receptores de ligação de lectina lectina tipo C. Arginase é induzida e produz ornitina que favorece o crescimento de parasitas. Arginase não é induzida por cinesina em macrófagos cultivados com 12,5 miliame mannose ou em macrófagos de camundongos onde os receptores de manose do macrófago foram excluídos.Outros exemplos de biologia celular e experimentação bioquímica usando tripanosse purificado de celulose DAEA são demonstrados em estudos onde novas proteínas citoesqueletal como BILBO1 foram identificadas. BILBO1 é necessário para a biogênese de importantes estruturas citoesqueletal e sobrevivência de parasitas. Assim, o BILBO1 representa um importante alvo de intervenção em tripanossomos patogênicos.Uma imagem mostrando a rotulagem de imunoflourescência de uma forma de cultura de corrente sanguínea, célula de trypanosoma brucei sondada com um anticorpo anti-BILBO1 é mostrada nesta figura. Além disso, o metabolismo de glicose e threonina foram descritos usando triplóculos purificados de celulose DEAE e as enzimas envolvidas nesses processos foram validadas experimentalmente. Uma representação esquemática do metabolismo de glicose e threonina nos tripanossomos formados pela corrente sanguínea é mostrada nesta figura.Purificação de tripanossos africanos do sangue por anion troca colunas de celulose DEAE com melhorias recentes continua sendo o padrão ouro para detecção de trypanosome, não apenas em hospedeiros naturais com baixa parasitamias em áreas endêmicas, mas também para a exigência de parasitas em grande número para investigações experimentais. As investigações permitiram identificar moléculas de tripanossomo desempenhando papéis essenciais na sobrevivência e crescimento dos parasitas. Alvos identificados podem representar a base para uma futura vacina com antígenos potenciais para humanos e animais em uma abordagem única de saúde.

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Research

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Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl) (Vídeo) | JoVE Journal

Purificação de tripanosomas extracelulares, incluindo africanos, de sangue por permutadores de aniões (colunas de celulose-Diethylaminoethyl)

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