Name: Fabricação de um Nafion-revestido, reduzido grafeno óxido/polianilina Chemiresistive Sensor de pH de Monitor em tempo real durante a fermentação microbiana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Aprenda a fabricar um sensor quimiresistivo de pH revestido com Nafion e polianilina para monitoramento em tempo real durante a fermentação microbiana de Lactococcus lactis.

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Os autores reconhecem a Universidade de Groningen, apoio financeiro.

1. preparação de óxido de grafite
Nota: Óxido de grafite é preparado de acordo com o método de10,11 dos Hummers.
<ol><li>Adicione 3 g de grafite em 69 mL de concentrado H2para4 e agitar a solução até o grafite completamente se dispersou. Adicionar 1,5 g de nitrito de sódio e deixe por 1h, agitando. Então, coloque o recipiente em banho de gelo.</li>
	<li>Adicionar 9 g de permanganato de potássio para a dispersão e remova o recipiente do banho de gelo. Permitir que a solução aquecer a temperatura ambiente.</li>
	<li>Primeiro, adicione 138 mL de água destilada gota a gota. Em seguida, continue a adicionar 420 mL de água destilada. Manter a temperatura a 90 ° C por 15 min, usando uma placa de aquecimento. Adicione 7,5 mL de peróxido de hidrogênio 30% para a dispersão.</li>
	<li>Recolher o produto por centrifugação a 10.000 x g por 20 min e descartar o sobrenadante. Lave o pellet 4 x com água bidestilada morna e 2x com uma solução de HCl (v/v) de 10%. Finalmente, lavá-lo 2 x com etanol e secar a 50 ° C no forno.</li>
</ol>2. GO-depositado eletrodo preparação
<ol><li>Dispersar a 10 mg de óxido de grafite em 10 mL de água e em seguida proceda à sonicação isso em um banho ultra-sônico para 6 h.</li>
	<li>Retire os flocos de óxido de grafite unexfoliated por centrifugação por 30 min em 2.700 x g. descartar as partículas sólidas após centrifugação e usar o sobrenadante para novas experiências. Nota: Usamos esta dispersão de flocos esfoliada GO como solução-mãe.</li>
	<li>Dilua a solução-mãe ir duas vezes. Sempre prepare uma solução de trabalho de GO fresca de solução-mãe.</li>
	<li>Adicione 2 µ l da solução de trabalho de ir em cima de um eletrodo ouro interdigitantes exposta (figura 1A e Figura 2). Após a queda de fundição, seque o eletrodo em temperatura ambiente por 12 h. Este é o eletrodo de GO-depositado.</li>
</ol>3. redução de ir para óxido de grafeno eletroquimicamente reduzida
<ol><li>Inserir o eletrodo no porta-eletrodo polydimethylsiloxane (PDMS) (parte inferior). Coloque a outra parte do porta-eletrodo, que serve como um reservatório de solução, em cima do eletrodo como mostrado na figura 1A - 1C. Monte os suportes por recorte as duas partes juntas, usando dois clipes de papel. Certifique-se de que o titular PDMS não abrange a parte do eletrodo GO-depositado.</li>
	<li>Pipeta 300 µ l de tampão de fosfato 0,2 M (pH 7) no reservatório. Em seguida, coloque a referência e o eletrodo contador na solução de tal forma que os eléctrodos são colocados perto da superfície do filme GO, como mostrado na Figura 1. Esta afinação serve como uma célula eletroquímica para realizar redução eletroquímica de GO e para deposição de polianilina.</li>
	<li>Conecte os eletrodos com o potentiostat ligado a um computador para aquisição de dados. Use voltametria cíclica de redução eletroquímica: Selecione 0 para -1,2 V como uma gama de potencial e 50 mV/s como a velocidade de varredura. Ciclo da tensão sobre o eletrodo entre 0 a -1,2 V 10 x (Figura 3).</li>
	<li>Após o experimento, retire o eletrodo do porta e lavá-lo várias vezes com água bidestilada. Em seguida, seque o eletrodo em um forno a 101 ° C, durante 12 h.</li>
	<li>Quando o eletrodo estiver seco, retire o eletrodo do forno e deixe-o arrefecer à temperatura ambiente. Em seguida, medir a condutividade do eléctrodo com um multímetro. O eletrodo é agora referido como um eletrodo de óxido (ERGO) grafeno eletroquimicamente reduzida.</li>
</ol>4. a polianilina Functionalization do ERGO eletrodo
<ol><li>Prepare o monômero anilina de 10 mM para a polianilina functionalization. Dissolver 5 µ l de anilina de 10 mM em 5 mL de 1 M H2então4.</li>
	<li>Para a polianilina functionalization, adicione 300 µ l de monômero anilina para o reservatório de solução. Coloque o eléctrodo ERGO-depositada no porta-eletrodo, conforme descrito no procedimento para redução de ir.</li>
	<li>Use voltametria cíclica para a electropolymerization de anilina para funcionalizar ERGO em ERGA-polianilina (ERGO-PA): Selecione 0 para 0.9 V como uma gama de potencial e 50 mV/s como a velocidade de varredura. Ciclo da tensão sobre o eletrodo entre 0 a 0,9 V para 50 x (Figura 4).</li>
	<li>Após a deposição de polianilina, remover o eléctrodo e lavá-lo várias vezes com água bidestilada. Em seguida, seque o eletrodo a 80 ° C no forno por 12 h.</li>
	<li>Retire o eletrodo do forno e deixe-o arrefecer à temperatura ambiente antes de medir a condutividade do eléctrodo com um multímetro.</li>
	<li>Prepare uma solução tampão de pH 5 pela adição de 0,2 M de NaOH a solução-tampão de Britton-Robinson até pH 5 (consulte a etapa 5.1). Mantenha o eletrodo no buffer pH 5 para 24h.<ol>
<li>Para preparar uma solução-tampão universal Britton-Robinson, misture 0,04 mol de ácido fosfórico, 0,04 mol de ácido acético e 0,04 mol de ácido bórico, 0,8 litros de água ultrapura. Adicione 0,2 M de hidróxido de sódio gota a gota à solução tampão até pH desejado é atingido4. Adicionar água ultrapura até o volume final é 1 L.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ERGO-PA eletrodo testes em diferente pH (pré-calibração antes Nafion revestimento)
<ol><li>Após condicionamento o eletrodo em uma solução tampão de pH 5, medir a resistência do eletrodo em soluções de pH diferente (de pH 4, pH 9; consulte a Figura 5).<ol>
<li>Para esta medição, mergulhe o eletrodo diretamente a solução-tampão e conecte a outra parte do eletrodo para a potentiostat controlada por computador para aquisição de dados. Altere o pH, titulada com 0,2 M de NaOH.</li>
		<li>Escolher a curva de t i chronopotentiometry ou amperometry na lista de técnicas e aplicar uma diferença de potencial 100 mV para o eletrodo. Nota: O potentiostat mede a corrente contra o tempo. O software que controla o potentiostat fornece uma representação gráfica da corrente contra o tempo.</li>
		<li>Usar a lei de Ohm (resistência é igual a tensão dividida pela corrente) para calcular o valor da resistência da tensão de medição atual e aplicado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após as medições, seca o eletrodo em temperatura ambiente por 12 h.</li>
</ol>6. preparação do eléctrodo revestido Nafion ERGO-PA
<ol><li>Adicionar 5 µ l de 5% em peso Nafion em cima o eletrodo ERGO-PA e seque o eletrodo em temperatura ambiente por 12 h.</li>
	<li>Após o revestimento de Nafion, manter o eletrodo na solução tampão a pH 5 para 24h antes de medições de pH.</li>
	<li>Após o condicionamento em pH 5, remover o eletrodo revestido Nafion ERGO-PA (ERGO-PA-NA) e medir a resistência do eletrodo de pH 4 pH 9 conforme mencionado na seção 5.1 (Figura 6).</li>
</ol>7. preparação de meio de cultura de L. lactis
<ol><li>Adicione 9,3 g de M17 pó em 250 mL de água ultrapura. Agite lentamente a solução até que o pó se dissolva completamente. Autoclave a solução a 121 ° C por 15 min.</li>
	<li>Pegue um balão de 250 mL esterilizado com uma barra de agitador magnético e adicionar 50 mL de meio de M17 esterilizado no balão. Em seguida, adicione 8 mL de solução de glicose 1m esterilizada. Inocule a solução com 10 µ l de uma cultura de L. lactis , anteriormente cultivada em meio de cultura mesmo. Nota: A estirpe bacteriana foi obtida Jan Kok, Genética Molecular, Universidade de Groningen.</li>
	<li>Colocar o balão com o meio de cultura inoculado por 18 h em um prato de agitador magnético em um forno de incubação a 30 ° C, agitando e monitorar o pH.</li>
</ol>8. teste do pH ERGO-PA-NA resposta em um experimento de fermentação de L. lactis
<ol><li>Coloque o eléctrodo de ERGO-PA-para a cultura de L. lactis e fechá-lo com um tampão de algodão. Em seguida, coloque o set-up para o termostato a 30 ° C a crescer L. lactis.</li>
	<li>Aplicar 100 mV para o eletrodo e a medida da corrente contra o tempo.</li>
	<li>Colher amostras de 0,5 mL em pontos diferentes do tempo (ver, por exemplo, a Figura 7) off-line medir a densidade óptica em 600 nm e o pH com um eletrodo de vidro convencional. Continue as medições até que a densidade óptica da cultura torna-se constante, indicando que as bactérias não crescem mais.</li>
</ol>

<ol><li>Gou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+Nanotube+Chemiresistor+for+Wireless+pH+Sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Carbon Nanotube Chemiresistor for Wireless pH Sensing.</a> Scientific Reports. 4, 4468(2014).</li>
<li>Hols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+Lactococcus+lactis+from+homolactic+to+homoalanine+fermentation+through+metabolic+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Conversion of Lactococcus lactis from homolactic to homoalanine fermentation through metabolic engineering.</a> Nature Biotechnology. 17, 588-592 (1999).</li>
<li>Luedeking, R., Piret, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+study+of+the+lactic+acid+fermentation.+Batch+process+at+controlled+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Microbiological+Technology+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">A kinetic study of the lactic acid fermentation. Batch process at controlled pH.</a> Journal of Biochemical and Microbiological Technology and Engineering. 1, 393-412 (1959).</li>
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<li>Ambrosi, A., Chua, C. K., Bonanni, A., Pumera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemistry+of+Graphene+and+Related+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Electrochemistry of Graphene and Related Materials.</a> Chemical Reviews. 114, 7150-7188 (2014).</li>
<li>Xie, F., Cao, X., Qu, F., Asiri, A. M., Sun, X. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S092540051731523X">Cobalt nitride nanowire array as an efficient electrochemical sensor.</a> Sensors and Actuators B. 255, 1254-1261 (2018).</li>
<li>Xie, F., Liu, T., Xie, L., Sun, X., Luo, Y. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517317616">Metallic nickel nitride nanosheet: An efficient catalyst electrode for sensitive and selective non-enzymatic glucose sensing.</a> Sensors and Actuators B. 255, 2794-2799 (2018).</li>
<li>Xie, L., Asiri, A. M., Sun, X. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400516320640">Monolithically integrated copper phosphide nanowire: An efficient electrocatalyst for sensitive and selective nonenzymatic glucose detection.</a> Sensors and Actuators B. 244, 11-16 (2017).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ternary+NiCoP+nanosheet+array+on+a+Ti+mesh%3A+A+high-performance+electrochemical+sensor+for+glucose+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Ternary NiCoP nanosheet array on a Ti mesh: A high-performance electrochemical sensor for glucose detection.</a> Chemical Communications. 52, 14438-14441 (2016).</li>
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<li>Guo, H. L., Wang, X. F., Qian, Q. Y., Wang, F. B., Xia, X. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+green+approach+to+the+synthesis+of+graphene+nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">A green approach to the synthesis of graphene nanosheets.</a> ACS Nano. 3, 2653-2659 (2009).</li>
<li>Ramesha, G. K., Sampath, S. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp811377n">Electrochemical Reduction of Oriented Graphene Oxide Films: An in Situ Raman Spectroelectrochemical Study.</a> The Journal of Physical Chemistry C. 113, 7985-7989 (2009).</li>
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<li>Deshmukh, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517324930">EDTA-Modified PANI/SWNTs Nanocomposite for Differential Pulse Voltammetry Based Determination of Cu(II) Ions.</a> Sensors and Actuators B Chemical. 260, 331-338 (2018).</li>
<li>Deshmukh, M. A., Shirsat, M. D., Ramanaviciene, A., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composites+Based+on+Conducting+Polymers+and+Carbon+Nanomaterials+for+Heavy+Metal+Ion+Sensing+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Composites Based on Conducting Polymers and Carbon Nanomaterials for Heavy Metal Ion Sensing (Review).</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 48, 293-304 (2018).</li>
<li>Deshmukh, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517305932">A Hybrid Electrochemical/Electrochromic Cu(II) Ion Sensor Prototype Based on PANI/ITO-Electrode.</a> Sensors and Actuators B Chemical. 248, 527-535 (2017).</li>
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<li>Sha, R., Komori, K., Badhulika, S. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/7959556/">Amperometric pH Sensor Based on Graphene-Polyaniline Composite.</a> IEEE Sensors Journal. 17 (16), 5038-5043 (2017).</li>
<li>Huai-Ping, C., Xiao-Chen, R., Ping, W., Shu-Hong, Y. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/ee/c2ee24203f">Flexible graphene-polyaniline composite paper for high-performance supercapacitor.</a> Energy & Environmental Science. 6, 1185-1191 (2013).</li>
<li>Xiang, J., Drzal, L. T. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0032386112006106">Templated growth of polyaniline on exfoliated graphene nanoplatelets (GNP) and its thermoelectric properties.</a> Polymer. 53, 4202-4210 (2012).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

É essencial que o GO camadas completamente cobrir os fios de ouro eletrodo após a deposição de GO. Se os eletrodos de ouro não são cobertos com GO, polianilina não só depositará na ERGO, mas também sobre os fios do eletrodo de ouro visível diretamente. Deposição de polianilina sobre os fios de ouro eletrodo pode ter implicações sobre o desempenho do eletrodo. Após a redução de ir para o ERGO, o eletrodo é seca a 100 ° C, para reforçar a ligação entre a camada ERGO e os fios de ouro do eletrodo. A resistência de cada elet...

pH desempenha um papel vital em muitos processos químicos e biológicos. Mesmo as pequenas alterações no valor do pH alteram o processo e afectar negativamente o resultado do processo. Portanto, é necessário monitorar e controlar o valor de pH durante todas as fases dos experimentos. O eletrodo de pH com base em vidro tem sido utilizado com sucesso para monitorar o pH em muitos processos químicos e biológicos, embora a utilização de um eléctrodo de vidro representa várias limitações para medir o pH. O eletrodo de pH com base em vidro é relativamente grande, frágil, e as pequenas fugas do eletrólito para a amostra são possíveis. Além disso, o eletrodo e eletrônica é relativamente caras para aplicações em triagem de 96 poços sistemas de fermentação. Além disso, os sensores eletroquímicos são invasivos e consomem a amostra. Portanto, é mais vantajoso usar sensores não-invasivo, sem referência.
Hoje em dia, sistemas miniaturizados de reação são favorecidos em muitas aplicações de biotecnologia e engenharia química, como estes microsystems fornecem controle de processo avançado, juntamente com muitas outras vantagens sobre seu macro análogos de sistema. Para monitorar e controlar os parâmetros em um sistema miniaturizado é uma tarefa desafiadora, como os tamanhos do sensor para medir, por exemplo, pH e O2, precisa ser minimizada também. O sucesso da produção de microreactors para sistemas biológicos requerem diferentes tipos de ferramentas analíticas para monitoramento de processo. Portanto, o desenvolvimento de Microssensores inteligente desempenha um papel significativo na realização de processos biológicos em microreactors.
Recentemente, tem havido várias tentativas de desenvolver sensores de pH inteligente usando chemiresistive sensoriamento materiais como nanotubos de carbono e realização de polímeros1. Estes sensores de chemiresistive não exigem nenhum eletrodo de referência e são fáceis de integrar com circuitos eletrônicos. Sensores chemiresistive sucesso tornam possível para produzir sensores inteligentes que são de baixo custo e fácil de fabricar, requerem um volume pequeno para testes e são invasivos.
Aqui, nós relatamos um método para desenvolver um eletrodo com óxido de grafeno eletroquimicamente reduzida, acrescida de polianilina. O eletrodo de chemiresistive funciona como um sensor de pH durante uma fermentação de L. lactis . L. lactis é uma bactéria produtoras de ácido láctico utilizada na fermentação de alimentos e processos de conservante de alimentos. Durante a fermentação, a produção de ácido lático diminui o pH, e a bactéria para de crescer em um baixo pH2,3,4.
Um meio de fermentação é um complexo ambiente químico que contém peptídeos, sais e moléculas redox que tendem a interferir com o sensor de superfície5,6,7,8,9. Este estudo mostra que um sensor de pH com base em material chemiresistive com uma camada de proteção de superfície adequada poderia ser usado para medir o pH neste tipo de mídia de fermentação complexo. Neste estudo, com sucesso usamos Nafion como a camada de proteção para óxido de grafeno polianilina-revestido, eletroquimicamente reduzida para medir o pH em tempo real durante uma fermentação de L. lactis .

<table><tbody><tr><td>Flocos de grafite</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico (H2SO4)</td><td>Nitrito</td> de sódio Merck <td></td><td></td></tr><tr><td>(NaNO2)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permanganato de potássio (KMnO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5% em peso Nafion</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M17 em pó</td><td>BD Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido fosfórico (H3PO4)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico (HBO3)</td> <td>Ácido acético Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Hidróxido de sódio <td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-hidrogenofosfato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dipostassium hidrogenofosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Au Eletrodos interdigitados</td><td>Tecnologia BVT - CC1 W1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Potenciostato</td><td>CH Instruments Inc (CH-600, CH-700)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fabricação de um nafion-revestido, reduzido grafeno óxido/polianilina chemiresistive sensor de ph de monitor em tempo real durante a fermentação microbiana

Manufacturing of a Nafion-coated, Reduced Graphene Oxide/Polyaniline Chemiresistive Sensor to Monitor pH in Real-time During Microbial Fermentation

Aqui, nós relatamos a engenharia de um sensor de estado sólido micro pH baseado no óxido de grafeno eletroquimicamente reduzida, acrescida de polianilina (ERGO-PA). Óxido de grafeno eletroquimicamente reduzida atua como a camada de condução e polianilina age como uma camada de sensíveis ao pH. A condutividade pH-dependente de polianilina ocorre por doping de buracos durante a protonação e o dedoping de buracos durante deprotonação. Nós achamos que um eletrodo de estado sólido de ERGO-PA não era funcional como tal em processos de fermentação. A espécie eletroquimicamente ativa que as bactérias produzem durante o processo de fermentação interfere com a resposta do eletrodo. Aplicamos com sucesso Nafion como uma camada de próton-conduzindo sobre ERGO-PA. Os eletrodos revestidos Nafion (ERGO-PA-NA) mostram uma boa sensibilidade de 1,71 Ω/pH (pH 4-9) para medições de sensor chemiresistive. Nós testamos o eléctrodo de ERGO-PA-em tempo real na fermentação de Lactococcus lactis. Durante o crescimento de L. lactis, o pH do meio alterado de pH 7,2 pH 4,8 e a resistência do eletrodo ERGO-PA-NA Solid-State mudado de Ω 294.5 para 288.6 Ω (5.9 Ω por unidade de pH 2,4). A resposta de pH do eléctrodo ERGO-PA-em comparação com a resposta de um eletrodo de pH com base em vidro convencional mostra que as matrizes de referência-menos estado sólido microsensor operam com sucesso em uma fermentação microbiológica.

A aparência de um pico de forte redução em torno de -1,0 V (Figura 3) ilustrado a redução de ir para o ERGO12,13,14,22. A intensidade do pico depende do número de camadas GO sobre o eletrodo. Uma película preta grossa coberta completamente os fios de ouro sobre o eletrodo. Nesse ponto, os dois eletrodos de ouro isolados foram condut...

Aqui, nós relatamos o protocolo para a preparação de um sensor de pH micro grafeno Nafion-revestido, acrescida de polianilina, eletroquimicamente reduzida de óxido de chemiresistive. Este sensor de estado sólido, baseado em chemiresistor, pH micro pode detectar mudanças de pH em tempo real durante o processo de fermentação Lactococcus lactis .

Fabricação de um Nafion-revestido, reduzido grafeno óxido/polianilina Chemiresistive Sensor de pH de Monitor em tempo real durante a fermentação microbiana

Here, we report the engineering of a solid-state micro pH sensor based on polyaniline-functionalized, electrochemically reduced graphene oxide (ERGO-PA). ...

Essa tecnologia pode nos ajudar a responder a perguntas-chave em um campo da tecnologia de bioprocesso, como a conversão de biomassa, ou a produção de biogás a partir de resíduos orgânicos. A principal vantagem deste sensor de pH chemiresistive é que os eletrodos são pequenos, é o tubo se replicar em grande número, e trabalhar sem eletrodo de referência. As implicações dessa técnica se estendem a múltiplos microreatores, pois o pH é um parâmetro importante.Os eletrodos convencionais de pH são muito caros ou grandes demais para serem usados em uma plataforma de triagem de microreatores. Este método pode fornecer informações sobre várias passagens de permutação em pequena escala. Também pode ser aplicado em outras passagens químicas ou biológicas onde as medidas de pH são importantes.Primeiro, adicione três gramas de grafite a 69 mililitros de ácido sulfúrico concentrado, e mexa a solução até que o grafite se disperse completamente. Adicione 1,5 gramas de nitrito de sódio. Depois de uma hora de agitação, coloque o recipiente em um banho de gelo.Adicione nove gramas de permangã de potássio à dispersão e remova o recipiente do banho de gelo. Depois de permitir que a solução aqueça à temperatura ambiente, adicione 138 mililitros de gota de água Milli-Q. Em seguida, adicione 420 mililitros de água Milli-Q e mantenha a temperatura a 90 graus Celsius por 15 minutos usando uma placa quente.Adicione 7,5 mililitros de peróxido de hidrogênio de 30% à dispersão quente. Depois de transferir a dispersão para um tubo de centrífuga, colete o produto por centrifugação a 10.000 vezes G durante 20 minutos. Depois de descartar o supernasce, lave a pelota quatro vezes com água quente dupla destilada, e duas vezes com ácido clorídrico de 10%.Por fim, lave a pelota duas vezes com etanol e seque-a a 50 graus Celsius no forno. Disperse 10 miligramas de óxido de grafite em 10 mililitros de água Milli-Q, e depois sonicar a dispersão em um banho ultrassônico por seis horas. Após a ultrassonação, remova os flocos de óxido de grafite não esfoliados por centrifugação por 30 minutos a 2700 vezes g.Após centrifugação, descarte as partículas sólidas e use o sobrenatante para outros experimentos.Para preparar a solução de trabalho, diluir a solução de estoque de óxido de grafeno duas vezes com água Milli-Q. Agora adicione dois microliters da solução de trabalho de óxido de grafeno em cima de um eletrodo de ouro interdigiado exposto. Após a queda, seque o eletrodo de óxido de grafeno à temperatura ambiente por 12 horas.Insira o eletrodo em um suporte de eletrodo PDMS. Coloque a outra parte do suporte de eletrodos, que serve como reservatório de solução, em cima do eletrodo. Monte os suportes recorrando as duas partes usando dois clipes de papel.Em seguida, pipeta 300 microliters de 2 tampão de fosfato molar no reservatório. Em seguida, coloque a referência e contra os eletrodos na solução de tal forma que eles sejam colocados perto da superfície do filme de óxido de grafeno. Conecte os eletrodos com um potencialiostat, conectado a um computador para aquisição de dados.Use voltametria cíclica para a redução eletroquímica e selecione a faixa potencial apropriada e a taxa de varredura. Pedale a tensão sobre o eletrodo 10 vezes entre zero e menos 1,2 volts. Após o experimento, remova o eletrodo do suporte e lave-o repetidamente com água Milli-Q.Em seguida, seque o eletrodo em um forno a 101 graus Celsius por 12 horas. Quando o eletrodo estiver seco, remova-o do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Em seguida, meça a condutividade do eletrodo ErGO com um multimetro.Prepare uma solução de 10 milimil de monômero anilina para a funcionalização da polianilina, dissolvendo cinco microlitadores de 10 mililitros em cinco mililitros de um ácido sulfúrico molar. Adicione 300 microliters de monômero anilina ao reservatório de solução. Em seguida, coloque o eletrodo depositado erGO no suporte de eletrodo como descrito anteriormente.Use voltametria cíclica para a eletropolimerização da anilina para funcionalizar o ErGO em ErGO-PA e selecione a faixa potencial apropriada e a taxa de varredura. Pedale a tensão sobre o eletrodo 50 vezes, entre zero a 9 volts. Após a deposição de polianilina, remova o eletrodo e lave-o repetidamente com água Milli-Q.Em seguida, seque o eletrodo a 80 graus Celsius no forno por 12 horas. Quando o eletrodo estiver seco, remova-o do forno e deixe esfriar até a temperatura ambiente antes de medir a condutividade do eletrodo com um multimetro. Em seguida, adicione 2 hidróxido de sódio molar à solução tampão Britton-Robinson, até que o pH seja cinco.Para preparar uma solução tampão universal Britton-Robinson, misture 04 mols de ácido fosfórico, 04 mols de ácido acético e 04 mols de ácido bórico, em 8 litros de água Milli-Q. Em seguida, adicione água Milli-Q até que o volume final seja de um litro. Depois de condicionar o eletrodo na solução tampão pH cinco, meça sua resistência em soluções de diferentes pH, primeiro mergulhando-o diretamente na solução tampão.Em seguida, conecte a outra parte do eletrodo a um potencializador controlado por computador para aquisição de dados. Escolha a corrente de amperometria versus a curva de tempo da lista de técnicas e aplique uma diferença potencial de 100 milívolos para o eletrodo. Após as medições, seque o eletrodo à temperatura ambiente por 12 horas.Adicione cinco microliters de cinco nafion de peso em cima do eletrodo ErGO-PA, e seque o eletrodo à temperatura ambiente por 12 horas. Após o revestimento de nafion, aqueça o eletrodo na solução tampão em pH cinco por 24 horas antes das medições de pH. Após o condicionamento na solução tampão pH cinco, remova o eletrodo ErGO-PA revestido de nafion e meça a resistência do eletrodo de pH de quatro a nove, como descrito anteriormente.Adicione 9,3 gramas de pó M17 a 250 mililitros de água desmineralizada. Agitar lentamente a solução até que o pó se dissolva completamente. Em seguida, autoclave a solução a 121 graus Celsius por 15 minutos.Em seguida, adicione 50 mililitros do meio M17 esterilizado em um frasco esterilizado de 250 mililitros com uma barra de agitação magnética. Adicione 8 mililitros de solução de glicose molar 1 autoclaved ao meio. Em seguida, inocular a solução com 10 microliters da cultura L.lactis, anteriormente cultivada no mesmo meio de cultura.Coloque o frasco com o meio de cultura inoculada em uma placa de agitação magnética em um forno de incubação a 30 graus Celsius por 18 horas enquanto mexe. Monitore o pH durante a incubação. Coloque o eletrodo ErGO-PA-NA na cultura L.lactis e feche-o com um plugue de algodão.Em seguida, coloque a configuração em um termostato a 30 graus Celsius para cultivar L.lactis. Na sequência, aplique 100 milvolts no eletrodo e meça a corrente contra o tempo. Pegue 5 mililitros em diferentes pontos de tempo para medir offline a densidade óptica em 600 nanômetros, e o pH com um eletrodo de vidro convencional.Continue as medições até que a densidade óptica da cultura se torne constante, indicando que as bactérias não estão mais crescendo. O aparecimento de um forte pico de redução em torno de menos 1,0 volts ilustrou a redução do óxido de grafeno para ErGO. A intensidade do pico depende do número de camadas de óxido de grafeno no eletrodo.Quando o eletrodo ErGO-PA foi colocado em pH de quatro a nove soluções tampão, a corrente aumentou com o aumento do pH devido ao doping e despingamento de buracos durante o processo de desprotonação de prótonação. A resposta do eletrodo foi imediatamente estável quando a adição de hidróxido de sódio parou em um determinado pH. A condutividade do eletrodo não foi muito afetada pelo revestimento de nafion.Mas alguns ohms de diferença no valor de resistência ocorreu, e mudou o valor atual base do eletrodo ErGO-PA. Semelhante ao eletrodo ErGO-PA, a resistência do eletrodo ErGO-PA-NA mudou quando o pH da solução tampão mudou de quatro para nove. Uma vez iniciado o crescimento da L.lactis, a corrente do eletrodo ErGO-PA-NA diminuiu gradualmente, e depois acelerou durante a fase de crescimento exponencial, atingindo um valor estável no final do crescimento.O valor final da corrente é comparável ao valor atual do eletrodo ErGO-PA-NA testado na solução tampão. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de cobrir completamente os eletrodos de ouro com o óxido de grafeno. Essa tecnologia abriu caminho para pesquisadores da área de controle de processos, fabricar e usar pequenos eletrodos de pH para sistemas biológicos e químicos.Não se esqueça que trabalhar com ácido sulfúrico concentrado, permangênio de potássio e peróxido de hidrogênio pode ser extremamente perigoso. Este procedimento deve ser realizado em um capô de fumaça.

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Research

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