Name: Subaguda Microhemorrhages Cerebral induzida pela injeção de lipopolissacarídeo em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprenda a induzir microhemorragias cerebrais subagudas em ratos Sprague-Dawley por injeção de lipopolissacarídeo. Este método simples permite estudar a patogênese inflamatória e a integridade da barreira hematoencefálica.

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Agradecemos a professora Jian Feng Lei e colegas da Universidade de medicina de Capital para orientação durante o MRI. Agradecemos também Jing Zeng do departamento de Neurologia, Hospital de Yichang do povo segundo para apoio técnico.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) do Hospital Geral do exército de PLA e cuidado Animal.
1. materiais
<ol><li>Preparação da injeção de LPS<ol>
<li>Adicione 25 mL de água destilada a 25 mg de pó de LPS derivado de S. typhimurium a uma concentração final de 1 mg/mL. Loja a injeção em um tubo estéril a 4 ° C. Cuidado: LPS é tóxico.</li>
		<li>Prepare uma solução EB 2% no normal 0,9% de solução salina para manter a injeção EB na concentração do trabalho.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. os animais
<ol><li>Administrar LPS para ratos machos Sprague-Dawley (SD), com 10 semanas de idade (peso médio: 280 ± 20 g) por injeção intraperitoneal. Cuidado: Se ratos são comprados de outra organização, então a fase de adaptação não deve ser inferior a 7 dias.</li>
</ol>3. LPS injeções
<ol><li>Injetar LPS intraperitonealmente em cada rato na dose de 1 mg/kg e retornar os ratos de sua gaiola em casa. Nota: Não é necessária anestesia.</li>
	<li>Seis horas mais tarde, injete a mesma dose de injeção de LPS em ratos.</li>
	<li>Dezesseis horas depois injetar a mesma dose de LPS em ratos. Cuidado: Injetando ratos SD com LPS na dose de 1 mg/kg pode resultar em uma taxa de mortalidade de 5%. A taxa de mortalidade pode aumentar ainda mais em mais novos ou mais velhos ratos ou ratos fêmeas grávidos.</li>
	<li>Regressar os ratos das gaiolas após injeção de LPS e fornecer acesso ad libitum para comida e bebida. Nota: Ratos irão expor uma resposta inflamatória sistêmica distinta, e, portanto, é essencial que as gaiolas mantenham limpas durante todo o experimento. Ratos deve ser frequentemente (2x dia) monitoramento de peso, aparência geral e atitude após a primeira injeção de LPS. Se os ratos começam a exibir uma postura encurvada, relutância em se mover, perda de peso significativa (> 20%), porfirina coloração que eles ser humanamente sacrificados antes do dia 7 ponto de extremidade de estudo EB.</li>
</ol>4. coleta de amostra
<ol><li>Injeção de EB<ol>
<li>Sete dias após a primeira injeção, anestesia o rato por intraperitonealmente, de acordo com o protocolo IACUC aprovado.</li>
		<li>Espere 1 a 2 min até os ratos não mostrar respostas de reflexas corneais. Executar um 5 por 8 mm-punção profunda cardíaca em cada rato; o ponto perfurar deve ser de 5 mm para a margem esquerda do esterno no espaço intercostais 3ª e 4ª.</li>
		<li>Espere até a recuperação de sangue é observada e então injetar EB na dose de 0,2 mL/100 g de massa corporal para o ventrículo esquerdo do coração. Cuidado: EB injeção e punção cardíaca devem ser cuidadosamente realizadas. EB pode ser injetado em cavidade torácica ou pericárdio em vez do ventrículo esquerdo do coração.<ol>
<li>Chupar com um tubo vazio e substituir este volume com um tubo EB antes da injeção para ajudar a reduzir a taxa de falha (ex., injeção a caixa torácica por erro).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mantenha o rato em uma posição supina por 10 min. Nota: Se a amostra não é usada para detectar vazamento EB em imagiologia de imunofluorescência, então esta etapa pode ser omitida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observação bruta<ol>
<li>Execute perfusions cardíacas usando gelada 1 M salina tampão de fosfato (PBS) para limpar o interior da vasculatura cerebral e cérebro.<ol>
<li>Usando um bisturi, faça uma incisão abdominal através de todo o comprimento do diafragma.</li>
			<li>Corte através de apenas de costelas esquerda da linha média do tórax.</li>
			<li>Abra a cavidade torácica. Utilize braçadeiras para expor o coração e para facilitar a drenagem de sangue e outros fluidos.</li>
			<li>Segurando firmemente o coração com fórceps (o coração ainda deve estar batendo), diretamente de inserir uma agulha para a saliência do ventrículo esquerdo a alargá-la a aproximadamente 5 mm. fixar a agulha naquela posição, fixando-se perto do ponto de entrada. Cuidado: Não excessivamente se estendem a agulha, que pode perfurar a parede interior e comprometer a circulação de soluções.</li>
			<li>Libere a válvula para permitir que a solução de PBS gelada da fluxo (200-300 mL) a uma taxa lenta e constante em torno de 20 mL/min utilizando uma bomba de perfusão. Se os animais necessitam de fixação em vez de observação bruta, em seguida, use a mesma dose de solução salina gelada de 0,9%.</li>
			<li>Usando a tesoura afiada, fazer uma incisão no átrio, garantindo que a solução flui continuamente. Se o fluido não flui livremente ou está vindo de narinas ou na boca do animal, reposicione a agulha.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Tela para CMHs pela observação grosseira. Nota: Se a amostra não é usada no cálculo do número de CMHs pela observação bruta, então esta etapa pode ser omitida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fixação<ol>
<li>Execute perfusions cardíacas usando gelada solução salina 0,9% (200-300 mL) para limpar a vasculatura cerebral e cérebro.</li>
		<li>Execute perfusions cardíacas usando gelada paraformaldeído 4% para fixação.</li>
		<li>Decapitar o rato, isolar o cérebro e mergulhe o cérebro na solução de sacarose 20% pelo menos 6 h.</li>
		<li>Transformar a solução em 30% de sacarose e correção para outro 6h.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 10 seções de tecidos cerebrais mm de espessura, usando um criostato.</li>
</ol>5. ele mancha
Nota: Este procedimento é realizado usando um ele Kit de coloração.
<ol><li>Lave as lâminas em água destilada.</li>
	<li>Mancha na solução de hematoxilina de 8 min. Lave em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Diferencie em álcool ácido de 1% por 30 s. lavagem em água corrente por 1 min.</li>
	<li>Mancha na água de amônia de 0,2% (Anil) ou carbonato de lítio saturado solução por 30 s a 1 min. Lave em água corrente por 5 min.</li>
	<li>Enxaguar em 95% de álcool (10 mergulhos).</li>
	<li>Corante de contraste com solução de eosina por 30 s a 1 min.</li>
	<li>Desidrata-se através de 95% de álcool, duas mudanças de álcool absoluto, por 5 min cada.</li>
	<li>Clara em xilol por 30 s.</li>
	<li>Montagem utilizando método9 de Liu.</li>
	<li>Analise usando um microscópio de fluorescência brightfield. Nota: glóbulos vermelhos, lançado de vasos sanguíneos, que são os componentes do CMHs, aparecem em vermelho-laranja sob ele mancha.</li>
</ol>6. Perl azul da Prússia de coloração
Nota: Este procedimento é realizado usando um Kit de coloração de Perls.
<ol><li>Lave os slides com água destilada.</li>
	<li>Mancha na solução de reação com a mistura de partes iguais de ferrocianeto e ácido clorídrico por 10 min.</li>
	<li>Desidrata-se, limpar, montar e analisar os slides conforme descrito nas etapas 5.7 – 5.10.</li>
</ol>7. EB duplo-coloração
Nota: Este procedimento segue passo 4.1.3.
<ol><li>Lave os slides com PBS, três vezes por 5 min cada.</li>
	<li>Incube com 4', solução de 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) durante 15 minutos à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as lâminas com solução de PBS, três vezes por 5 min cada e montar lâminas com solução de PBS-glicerol.</li>
	<li>Analise imagens em um microscópio de fluorescência. Deposição de EB é indicada por fluorescência vermelha; núcleos são indicados por fluorescência azul.</li>
</ol>8. RESSONÂNCIA MAGNÉTICA-SWI
<ol><li>Realize MRI em um ímã 7-T equipado com um sistema de gradiente ativamente blindado (16 cm de diâmetro interno).</li>
	<li>Sete dias após o tratamento, anestesia os ratos, por inalação de máscara de isoflurano 1,5-2,0%, usando um sistema de anestesia de isoflurano.</li>
	<li>Aplica o vet pomada para os olhos do rato para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.</li>
	<li>Manter os ratos em posição prona e executar uma varredura de MRI-SWI.</li>
	<li>Obter digitalizações SWI ponderada utilizando uma sequência de fast-spin eco, usando os seguintes parâmetros: eco tempo (TE) 8 ms, repetição tempo (TR) 40 ms, ângulo da aleta = 12° campo de visão (FOV) 35 mm × 35 mm, matriz de aquisição 384 × 384, para adquirir fatias de 1 mm de espessura.</li>
	<li>Identificar CMHs no MRI-SWI segundo Greenberg et al . 11, que incluiu os seguintes critérios: (1) de diâmetro ≤ 10 mm e manchas (2) circular, isolado e sinal de baixa intensidade.</li>
	<li>No final do experimento, eutanásia os ratos usando o método de dióxido de carbono (um fluxo de 6 L/min) ou 30% do volume do recipiente de sobredosagem.</li>
</ol>

<ol><li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+inflammation-induced+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds.</a> J Neuroinflammation. 13 (1), 218(2016).</li>
<li>Vernooij, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+risk+factors+of+cerebral+microbleeds+the+Rotterdam+Scan+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prevalence and risk factors of cerebral microbleeds the Rotterdam Scan Study.</a> Neurology. 70 (14), 1208-1214 (2009).</li>
<li>Pettersen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbleed+topography%2C+leukoaraiosis%2C+and+cognition+in+probable+Alzheimer+disease+from+the+Sunnybrook+dementia+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microbleed topography, leukoaraiosis, and cognition in probable Alzheimer disease from the Sunnybrook dementia study.</a> Archives of Neurology. 65 (6), 790-795 (2008).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds+and+neuropsychiatric+symptoms+in+an+elderly+Asian+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%2C+Neurosurgery%2C+and+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds and neuropsychiatric symptoms in an elderly Asian cohort.</a> Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 88 (1), 7-11 (2017).</li>
<li>Mcauley, G., Schrag, M., Barnes, S., Obenaus, A., Dickson, A., Kirsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+iron+quantification+in+collagenase-induced+microbleeds+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo iron quantification in collagenase-induced microbleeds in rat brain.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 67 (3), 711-717 (2012).</li>
<li>Reuter, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+cerebral+microbleeds+in+the+APP23-transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloid+angiopathy-a+9.4+tesla+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Development of cerebral microbleeds in the APP23-transgenic mouse model of cerebral amyloid angiopathy-a 9.4 tesla MRI study.</a> Frontiers in Aging Neuroscience. 8 (8), 170(2016).</li>
<li>Scott, L. L., Downing, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neonatal+exposure+to+BMAA+in+a+rat+model+produces+neuropathology+consistent+with+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">A single neonatal exposure to BMAA in a rat model produces neuropathology consistent with neurodegenerative diseases.</a> Toxins. 10 (1), E22(2018).</li>
<li>Toth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+hypertension-induced+cerebral+microhemorrhages+in+mice%3A+role+of+resveratrol+treatment+in+vasoprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates hypertension-induced cerebral microhemorrhages in mice: role of resveratrol treatment in vasoprotection.</a> Aging Cell. 14 (3), 400-408 (2015).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+H%26E+and+Prussian+blue+staining+in+a+mouse+model+of+cerebral+microbleeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 62 (11), 767-773 (2014).</li>
<li>Zeng, J., Zhào, H., Liu, Z., Zhang, W., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+subacute+cerebral+microhemorrhages+with+involvement+of+Nitric+Oxide+Synthase+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stroke+and+Cerebrovascular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces subacute cerebral microhemorrhages with involvement of Nitric Oxide Synthase in rats.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 27 (7), 1905-1913 (2018).</li>
<li>Greenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+microbleeds%3A+A+guide+to+detection+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral microbleeds: A guide to detection and interpretation.</a> Lancet Neurology. 8 (2), 165-174 (2009).</li>
<li>Hoffmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Field+MRI+reveals+a+drastic+increase+of+hypoxia-induced+microhemorrhages+upon+tissue+reoxygenation+in+the+mouse+brain+with+strong+predominance+in+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-Field MRI reveals a drastic increase of hypoxia-induced microhemorrhages upon tissue reoxygenation in the mouse brain with strong predominance in the olfactory bulb.</a> Plos One. 11 (2), e0148441(2016).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phosphodiesterase+3A+modulation+on+murine+cerebral+microhemorrhages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of phosphodiesterase 3A modulation on murine cerebral microhemorrhages.</a> Journal of Neuroinflammation. 14 (1), 114(2017).</li>
<li>Sumbria, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+exacerbates+development+of+cerebral+microbleeds+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Aging exacerbates development of cerebral microbleeds in a mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 69(2018).</li>
<li>Mello, B. S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+in+behavior+and+brain+inflammatory+and+oxidative+alterations+in+mice+submitted+to+lipopolysaccharide-induced+inflammatory+model+of+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Sex influences in behavior and brain inflammatory and oxidative alterations in mice submitted to lipopolysaccharide-induced inflammatory model of depression.</a> Journal of Neuroimmunol. 320, 133-142 (2018).</li>
<li>Souza, D. F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+astroglial+markers+in+a+maternal+immune+activation+model+of+schizophrenia+in+Wistar+rats+are+dependent+on+sex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Changes in astroglial markers in a maternal immune activation model of schizophrenia in Wistar rats are dependent on sex.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (489), (2015).</li>
<li>Dutta, G., Zhang, P., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lipopolysaccharide+Parkinson%27s+disease+animal+model%3A+mechanistic+studies+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Lipopolysaccharide Parkinson's disease animal model: mechanistic studies and drug discovery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 22 (5), 453-464 (2008).</li>
<li>El-Sayed, N. S., Bayan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+role+of+resveratrol+targeting+estradiol+and+neprilysin+pathways+in+lipopolysaccharide+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Possible role of resveratrol targeting estradiol and neprilysin pathways in lipopolysaccharide model of Alzheimer disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 822 (822), 107-118 (2015).</li>
<li>Combrinck, M. I., Perry, V. H., Cunningham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+infection+evokes+exaggerated+sickness+behaviour+in+pre-clinical+murine+prion+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Peripheral infection evokes exaggerated sickness behaviour in pre-clinical murine prion disease.</a> Neuroscience. 112 (1), 7-11 (2002).</li>
<li>Pantoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+small+vessel+disease%3A+from+pathogenesis+and+clinical+characteristics+to+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cerebral small vessel disease: from pathogenesis and clinical characteristics to therapeutic challenges.</a> Lancet Neurology. 9 (7), 689-701 (2010).</li>
<li>Rosand, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+clustering+of+hemorrhages+in+probable+cerebral+amyloid+angiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Spatial clustering of hemorrhages in probable cerebral amyloid angiopathy.</a> Annals of Neurology. 58 (3), 459-462 (2005).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Kraft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypercholesterolemia+induced+cerebral+small+vessel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Hypercholesterolemia induced cerebral small vessel disease.</a> Plos One. 12 (8), e0182822(2017).</li>
<li>Schreiber, S., Bueche, C. Z., Garz, C., Baun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+brain+barrier+breakdown+as+the+starting+point+of+cerebral+small+vessel+disease%3F+-+New+insights+from+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Translational+Stroke+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood brain barrier breakdown as the starting point of cerebral small vessel disease? - New insights from a rat model.</a> Experimental & Translational Stroke Medicine. 5 (1), 4(2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Estudos sobre CMHs têm aumentado nos últimos anos. No entanto, o mecanismo de CMHs permanece obscuro, levando cientistas para a criação de modelos animais que simulam esta condição particular. Por exemplo, Hoffmann et al . desenvolveu um modelo de rato CMHs induzida por hipóxia que mostra que CMHs são causadas pela hipoxia e o rompimento de autoregulação cerebrovascular12. Reuter et al . 5 estabeleceu um modelo CMHs em ratos transgénicos-APP23, que mostrou...

Microhemorrhages cerebrais clássicas (CMHs) consulte perivascular pequenos depósitos de produtos de degradação do sangue tais como hemossiderina de células vermelhas do sangue no cérebro1. De acordo com o estudo de varredura de Rotterdam, CMHs podem ser encontrados em cerca de 17,8% das pessoas com idade entre 60-69 anos e 38,3% daqueles com 80 anos2. A prevalência do CMHs no idoso é relativamente alta, e uma correlação entre a acumulação de CMHs e disfunção cognitiva e neuropsiquiátricas tem sido estabelecida3,4. Vários modelos animais de CMHs recentemente têm sido relatados, incluindo modelos de roedores induzidos pelo tipo IV colagenase injeção estereotáxica5, APP transgênicos6, β-N-metilamino-L-alanina exposição7e hipertensão8, com CMHs induzidas por inflamação sistêmica como uma das escolhas mais bem aceitas. Fisher et al . 9 primeiro usado LPS derivados de Salmonella typhimurium para desenvolver um modelo de mouse CMHs agudo. Posteriormente, o mesmo grupo relatou o desenvolvimento de um modelo de mouse CMHs sub-aguda usando a mesma abordagem2.
LPS é considerado como uma injeção de estímulo inflamatório padronizado via intraperitoneal. Estudos anteriores confirmaram que injeção de LPS poderia causar neuroinflammation como refletido por grandes quantidades de micróglia e ativação de astrocyte no animal modelos2,10. Além disso, uma correlação positiva entre a ativação de neuroinflammation ativação e o número de CMHs tem sido estabelecida2,10. Baseado nestes estudos anteriores, recebemos para desenvolver um modelo do rato CMHs por injeção intraperitoneal de LPS.
Os avanços na deteção tecnologias resultaram em um aumento no número de investigações de pesquisa sobre CMHs. A mais amplamente reconhecida de métodos de detecção de CMHs incluem a detecção de células vermelhas do sangue pela hematoxilina e eosina (HE), coloração, deteção de ferro férrico por9, a coloração azul da Prússia deteção de Evans blue deposição (EB) por imunofluorescência imagem e ressonância magnética-susceptibilidade ponderada 7,0 Tesla da imagem latente (MRI-SWI)10. O presente estudo tem como objetivo desenvolver um método de triagem para CMHs.

<table><tbody><tr><td>LPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2630</td><td>para indução de inflamação</td></tr><tr><td>EB</td><td>Sigma-aldrich</td><td>E2129</td><td>para detecção de vazamento</td></tr><tr><td>EB DAPI solução de morte</td><td>Servicbio</td><td>G1012</td><td>contagem média para IF</td></tr><tr><td>Perl' s Coloração prussiana</td><td>Solarbio</td><td>G1424</td><td>Kit para coloração prussiana</td></tr><tr><td>Coloração HE</td><td>Kit Solarbio</td><td>G1120</td><td>para coloração HE hidrato de</td></tr><tr><td>cloral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47335U</td><td>Para</td></tr><tr><td>anestesia tampão fosfato solução salina (PBS)</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>um tipo de solução tampão comumente usada em</td></tr><tr><td>experimento solução</td> <td>salina a 0,9%Hainan DonglianChangfu Pharmaceutical Co., Ltd., China</td><td></td><td>solução para</td></tr><tr><td>paraformaldeído de</td> perfusão <td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>um tipo de solução comumente usada para fixação solução de</td></tr><tr><td>sacarose a 20%</td><td>Solarbio</td><td>G2461</td><td>um tipo de solução comumente usada para fixação Solução de</td></tr><tr><td>sacarose a 30%</td><td>Solarbio</td><td>G2460</td><td>um tipo de solução comumente usada para fixação</td></tr><tr><td>pomada veterinária</td><td>Solcoseryl eye gel, Bacel, Suíça</td><td></td><td>para proteção dos olhos de rato</td></tr></tbody></table>

subaguda microhemorrhages cerebral induzida pela injeção de lipopolissacarídeo em ratos

Sub-acute Cerebral Microhemorrhages Induced by Lipopolysaccharide Injection in Rats

Microhemorrhages cerebrais (CMHs) são comuns em pacientes idosos e estão correlacionados com vários distúrbios neuropsiquiátricos. A etiologia da CMHs é complexa e neuroinflammation frequentemente é observada como uma co-ocorrência. Aqui, descrevemos um sub-aguda CMHs modelo de rato induzido pela injeção de lipopolissacarídeo (LPS), bem como um método para a detecção de injeção CMHs. LPS sistêmica é relativamente simples, econômica e rentável. Uma grande vantagem da injeção de LPS é sua estabilidade para induzir a inflamação. CMHs causadas pela injeção de LPS podem ser detectadas pela observação bruta, hematoxilina e coloração eosina (HE), do Perl coloração prussiano, double-rotulagem de azul de Evans (EB) e tecnologia de (MRI-SWI) imagem de ressonância magnética-susceptibilidade ponderada. Finalmente, outros métodos de desenvolver modelos animais CMHs, incluindo suas vantagens ou desvantagens, também são discutidos neste relatório.

CMHs podem ser detectadas usando várias abordagens. Os métodos mais bem aceitados incluem o seguinte: (1) Observação bruta e avaliação da superfície CMHs (mostrado na Figura 1, painel superior); (2) ele mancha para a detecção de células vermelhas do sangue (mostrado na Figura 2A, painel superior) ou prussiana coloração detectando ferro férrico derivado da lise das células vermelhas do sangue (Figura 2A</stron...

Apresentamos um protocolo para induzir e detectar CMHs causadas pela injeção de LPS em ratos Sprague-Dawley, que pode ser utilizaram no futuro pesquisa investigações na patogênese do CMHs.

Subaguda Microhemorrhages Cerebral induzida pela injeção de lipopolissacarídeo em ratos

Cerebral microhemorrhages (CMHs) are common in aged patients and are correlated to various neuropsychiatric disorders. The etiology of CMHs is complex, ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da micromorragem cerebral, como a etiologia, distribuição e detecção de micromorragem cerebral e assim por diante. A principal vantagem desta técnica é que as injeções de LPS induzem a inflamação. Além disso, a injeção de LPS é bastante simples, econômica e econômica.Embora este método possa fornecer uma visão da indução da hemorragia cerebral, ele também pode ser aplicado a outros distúrbios cerebrais, como depressão, esquizofrenia, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e doença de prída. Administre LPS a uma dose de um miligrama por quilograma de peso corporal para ratos sprague dawley machos de 10 semanas de idade por injeção intraperitoneal, em seguida, retornar cada rato para a gaiola doméstica. Repita a injeção de LPS após seis horas e 16 horas.Observe que injetar ratos SD com LPS a uma dose de um miligrama por quilograma pode resultar em uma mortalidade de 5%. A mortalidade pode aumentar ainda mais em ratos mais jovens ou mais velhos ou ratos fêmeas grávidas. Devolva os ratos para suas gaiolas após a injeção de LPS, e forneça acesso a ad libitum a alimentos e bebidas.Sob anestesia terminal, realize uma punção cardíaca profunda de cinco a oito milímetros em cada rato. O ponto de punção deve ser de cinco milímetros para a margem esquerda do esterno no terceiro e quarto espaço intercostal. Segure a agulha no lugar e substitua o tubo vazio por um tubo contendo azul Evans.Espere até que a recuperação sanguínea seja observada, e então injete evans azul em uma dose de 0,2 mililitros por 100 gramas de peso corporal no ventrículo cardíaco esquerdo. Mantenha o rato em posição supina por 10 minutos se avaliar o vazamento azul de Evans através da barreira sanguínea/cerebral por imagens de imunofluorescência. Realize perfusões cardíacas usando 200 a 300 mililitros de solução salina de 0,9% para limpar a vasculatura cerebral e os cérebros.Mude para gelo 4% paraformaldeído para fixação. Então, depois de isolar o cérebro, mergulhe-o em 20% de sacarose na PBS por pelo menos seis horas ou até que o cérebro afunde no fundo do tubo. Mude a solução para 30% de sacarose e fixe-a por mais seis horas.Finalmente, prepare seções de tecido cerebral de 10 milímetros de espessura usando um criostat. Lave os slides com PBS três vezes por cinco minutos cada, depois incuba slides com solução de 4,6'diamidino-2-fenilômado ou DAPI por 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de lavar os slides em PBS como antes, monte os slides com solução PBS-gliceol.Capture imagens em um microscópio de fluorescência. A deposição do EB é indicada por fluorescência vermelha, núcleos são indicados por fluorescência azul. Comece a coloração de H&E lavando as lâminas em água destilada.Em seguida, mergulhe na solução de hematoxilina por oito minutos. Alternativamente, para a coloração azul perl prussiana, colorir em solução de reação com mistura de peças iguais de ferrociídeo e ácido clorídrico por 10 minutos. Após a coloração, lave na água da torneira por cinco minutos.Diferencie em 1% álcool ácido por 30 segundos. Depois de lavar em água da torneira por um minuto, manche em 0,2% água de amônia ou solução de carbonato de lítio saturado por 30 segundos a um minuto. Em seguida, lave na água da torneira por cinco minutos.Contra-mancha com solução de eosina por 30 segundos a um minuto. Desidratar através de 90%, depois 95% de álcool e álcool absoluto por 0,5 a dois minutos cada. Depois da desidratação, limpe em xileno por 30 segundos.Após a montagem, analise a coloração de H&E usando um microscópio de fluorescência de campo brilhante. Os glóbulos vermelhos liberados dos vasos sanguíneos, que são componentes dos CMHs, aparecem em laranja-vermelha sob a coloração de H&E. CmHs de superfície podem ser detectados por observação bruta, conforme indicado pelas setas vermelhas.A coloração azul de Evans revela fluorescência vermelha visível onde moléculas azuis de Evans vazaram de uma barreira hemoencefálica ferida. A coloração de H&E mostra glóbulos vermelhos encontrados fora dos capilares, e a coloração prussiana revela pontos de íons férricos derivados de lise de glóbulos vermelhos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que a dose de LPS para induzir micro-hemorragia cerebral é maior do que a usada na doença de Parkinson ou modelo de esquizofrenia.Portanto, o ambiente dos animais deve ser mantido limpo para reduzir a taxa de mortalidade. Após este procedimento, outros métodos como microscopia eletrônica, ressonância magnética e imagem imunofluorescente poderiam ser realizados para determinar o dano à estrutura externa da barreira hematoencefálica na micromorrização cerebral, distribuição de micro-hemorragias cerebrais no parenchyma cerebral in vivo, bem como ativação de células gliais.

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Neuroscience

Neurociência

Hemorragia subaracnóide aneurismática (HAS) é o sangramento que ocorre no espaço subaracnóide, quando uma ruptura de aneurisma. Enquanto a morbidade e mortalidade por este evento foi em um declínio devido a abordagens de tratamento melhores, o risco de vasoespasmo após hemorragia subaracnóide continua a ser o mesmo que era há alguns anos. A importância de estabelecer um modelo animal abrangente e reprodutível para identificar eventos de iniciação de vasoespasmo cerebral tem sido o foco de...

Um Modelo de Rato Baixa Mortalidade para Avaliar vasoespasmo cerebral adiada após hemorragia subaracnóide Experimental

Modelos animais clinicamente relevantes de hemorragia intracerebral (ICH) são necessários para ampliar nosso conhecimento sobre AVC hemorrágico e para analisar novas estratégias terapêuticas. Neste estudo, descrever e avaliar dois modelos ICH que implementam injeções unilaterais de tanto sangue autólogo todo ou colagenase bacteriana no gânglio basal (corpo estriado) de camundongos.

Hemorragia modelagem intracerebral em camundongos: Injeção de sangue autólogo ou colagenase bacteriana

Este vídeo demonstra o processo de indução da ruptura da barreira hematoencefálica (BHE) e micro-hemorragias cerebrais em um modelo de rato usando lipopolissacarídeo (LPS). Ele destaca a sequência de respostas imunes que levam ao aumento da permeabilidade da BHE e subsequente dano ao tecido cerebral.

Indução de micro-hemorragias cerebrais em modelo de rato usando lipopolissacarídeo

Este vídeo demonstra um ensaio para detectar micro-hemorragias cerebrais (CMHs) em um modelo de rato. CMHs são sangramentos cerebrais devido à ruptura da barreira hematoencefálica, identificada por glóbulos vermelhos vazados (RBCs). Em um modelo de rato, o tecido cerebral fixo é crioprotegido, seccionado e corado com hematoxilina-eosina para hemácias, permitindo a visualização microscópica de CMHs. As hemácias vazadas aparecem como vermelho-laranja ao microscópio.

Detecção de micro-hemorragias cerebrais em modelo de rato

Modelos pré-clínicos de hemorragia intracerebral são utilizados para imitar certos aspectos da doença clínica. Assim, mecanismos de lesão e potenciais estratégias terapêuticas podem ser explorados. Neste protocolo, dois modelos de hemorragia intracerebral são descritos, injeções intraestriatais (gânglios da base) de sangue autólogo ou colagenase.

Injection intraestriatal de sangue autólogo ou Clostridial colagenase como modelos murinos de hemorragia intracerebral

A encefalopatia da prematuridade engloba as anormalidades do sistema nervoso central associadas à lesão do parto prematuro. Este relatório descreve um modelo de rato clinicamente relevante de hipóxia-isquemia sistêmica transitória in utero e administração intra-amniótica de lipopolissacarídeo (LPS) que imita a corioamnionite e o impacto relacionado de estímulos infecciosos e subperfusão placentária no desenvolvimento do SNC.

Modelagem Encefalopatia da Prematuridade Usando pré-natal hipóxia-isquemia com Lipopolysaccharide intra-amniótica em Ratos

O protocolo aqui apresentado permite a reprodução de uma desmielinização de matéria cinzenta generalizada de ambos os hemisférios corticais em ratos agouti machos adultos. O método compreende a implantação intracerebral de um cateter, imunização subclínica contra glicoproteína de oligodendrocyte de mielina e injeção intracerebral de uma mistura de citocinas pró-inflamatórias através do cateter implantado.

Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias

Apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina em um rato através de dupla injeção de sangue autólogo.

Hemorragia pontina maciça por dupla injeção de sangue autólogo

A hemorragia subaracnóidea continua a carregar uma alta carga de mortalidade e morbidade no homem. Para facilitar novas pesquisas sobre a condição e sua fisiopatologia, um modelo pré-quiasmático de injeção única é apresentado.

Pré-quiasmática, injeção única de sangue autólogo para induzir hemorragia subaracnóidea experimental em modelo de rato

A hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade (PHHP) pode ser modelada em ratos neonatais combinando corioamnionite e hemorragia intraventricular. A combinação desses eventos pré-natais e pós-natais recapitula com precisão as características clínicas da PHHP, incluindo macrocefalia, ventriculomegalia e pressão intracraniana elevada, ao longo da vida.

Modelagem da hidrocefalia pós-hemorrágica da prematuridade em ratos

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Administração endotraqueal não invasiva de lipopolissacarídeo para induzir lesão pulmonar aguda em roedores

Aprenda a induzir microhemorragias cerebrais subagudas em ratos Sprague-Dawley por injeção de lipopolissacarídeo. Este método simples permite estudar a patogênese inflamatória e a integridade da barreira hematoencefálica.

Subaguda Microhemorrhages Cerebral induzida pela injeção de lipopolissacarídeo em ratos

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