Name: Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Impara a isolare e analizzare il metabolismo delle cellule leucemiche primarie dal midollo osseo. Questo metodo consente misurazioni in tempo reale per sviluppare approcci di medicina personalizzata contro la leucemia.

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Vorremmo ringraziare i centri di ematologia pediatrica Ceca. Questo lavoro è stato sostenuto dal Grant del Ministero della salute (NV15-28848A), dal Ministero della salute della Repubblica Ceca, University Hospital Motol, Praga, Repubblica Ceca 00064203 e dal Ministero della pubblica istruzione, gioventù e sport NPU I nr. LO1604.

Tutti i campioni sono stati ottenuti con il informed consent dei genitori o tutori dei bambini e l'approvazione del comitato etico dell'Università del Charles a Praga, Repubblica Ceca, lo studio no. NV15-28848A.
1. preparazione dei reagenti
<ol><li>Preparare 500 mL di PBS sciogliendo 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, ddH2O. regolare il pH a 7.4 con HCl. sterilizzare in autoclave.</li>
	<li>Preparare 100 mL di terreno RPMI: medium RPMI-1640 con L-alanil-glutammina completato con 10% siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL).</li>
	<li>Preparare 50 mL di 0.1 M NaHCO3 in acqua distillata. Aggiustare il pH a 8.1, filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a 4 ° C. Nota: Per due piastre di analizzatore di flusso 8 pozzetti extracellulare, preparare 250 μL di 0.1 M NaHCO3 pH 8.1.</li>
	<li>Preparare 1 mL di 2 M D-glucosio in acqua distillata. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 100 μL di 1 mM Oligomycin A in etanolo. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 250 μL di 1 M 2-deoxy-D-glucosio (2DG) in DMEM Minimal (medio dell'Aquila di Dulbecco per volta). Riscaldare a 37 ° C e regolare il pH a 7,4 (effettuare misurazioni di pH a 37 ° C). Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 100 μL di 1mm FCCP (Carbonil cianuro-p-trifluorometossifenil idrazone) in DMSO. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 100 μL di 1mm Rotenone in etanolo. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Preparare 100 μL di 1mg/mL Antimycin A in etanolo. Filtro sterilizzare (0.22 μm) e conservare a-20 ° C.</li>
	<li>Appena prima dell'uso, preparare 10 mL di mezzo di prova di stress di glicolisi. Caldo DMEM minimo a 37 ° C in un bagno d'acqua e regolare il pH a 7,4 (effettuare misurazioni di pH a 37 ° C).</li>
	<li>Prima dell'uso, preparare 10 mL di mezzo di prova di stress di cella Mito con BSA. Supplemento minimo DMEM con 2 mM L-Glutammina, 10 mM D-glucosio, 1 mM HEPES (pH 7.4), piruvato di 1 mM e 0,1% BSA (albumina di siero bovino). Riscaldare a 37 ° C in un bagno d'acqua e regolare il pH a 7,4 (effettuare misurazioni di pH a 37 ° C).</li>
	<li>Prima dell'uso, preparare 10 mL di mezzo di test di stress cellulare Mito senza BSA. Supplemento minimo DMEM con 2 mM L-Glutammina, 10 mM D-glucosio, 1 mM HEPES (pH 7,4) e piruvato di 1 mM. Caldo di mezzo di prova di stress cellulare Mito senza BSA a 37 ° C in un bagno d'acqua e regolare il pH a 7,4 (effettuare misurazioni di pH a 37 ° C). Nota: BSA viene aggiunto al mezzo di test di stress cellulare Mito perché le cellule rispondono meglio a FCCP quando il mezzo è completato con BSA (circostanze differenti sono stati provati). Mezzo di test di stress cellulare Mito senza BSA viene utilizzato per il caricamento le porte come il produttore non è consigliabile utilizzare BSA nel mezzo.</li>
</ol>2. isolamento delle cellule mononucleari dal midollo osseo
Nota: Idealmente, misurazione della condizione metabolica delle cellule di leucemia primaria dovrebbe iniziare subito dopo l'isolamento di raccolta e delle cellule del midollo osseo. Tuttavia, dati rilevanti potrebbero essere ottenuti anche da cellule isolate dopo trasporto da altri Ematologia centri nella Repubblica Ceca. Eseguire tutti i passaggi secondari in un cappuccio sterili per coltura.
<ol><li>Scaldare a PBS ed il mezzo di gradienti di densità a temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluire il campione di midollo osseo del paziente di leucemia con PBS, in un rapporto di 1:1. Assicurarsi che il campione contenga almeno l'80% di blasti leucemici.</li>
	<li>Determinare la percentuale di blasti da citometria a flusso utilizzando marcatori di CD specifici per la caratterizzazione di immunophenotype di tipi delle cellule. Dopo la separazione di gradienti di densità, è possibile rilevare eventi positivi di acido nucleico con un colorante nucleare al fine di stabilire il conteggio complessivo delle cellule.</li>
	<li>Quindi, determinare le cellule di leucemia utilizzando marcatori di CD specifici per ogni tipo di leucemia: B-ALL (CD19, CD45), LAL-T (CD3, CD4, CD8, CD5, CD7, CD99) e AML (CD45, CD33 e specifici marcatori mieloidi)24. Dividere il numero delle cellule di leucemia positive per gli indicatori specifici di CD di tutte le cellule nucleari per determinare la percentuale delle cellule di scoppio di leucemia. Nota: Il midollo osseo deve essere raccolto in provette con anticoagulanti.</li>
	<li>Con attenzione strato 6 mL del campione diluito del midollo osseo oltre 6 mL del mezzo gradiente di densità in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 400 x g per 35 min a 4 ° C in un rotore basculante senza il freno. Nota: Il più grande volume del campione potrebbe essere diviso in più aliquote o provetta conica da 50 mL può essere utilizzato con la maggiore quantità di mezzo di gradienti di densità.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire con cautela lo strato di interfase che consiste delle cellule mononucleari (Figura 1) per un nuovo tubo conico da 50 mL con 5 mL di PBS. Centrifugare a 400 × g per 10 min a 4 ° C in un rotore basculante. Nota: Trasferire tutti gli strati di cellule mononucleari in una provetta conica di singolo 50 mL con 5 mL di PBS.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di PBS sterile. Contare le celle utilizzando un emocitometro. Nota: Il numero di cellule di leucemia in un mL di midollo osseo aspirato differisce significativamente tra i pazienti25.</li>
</ol>3. durante la notte coltivazione delle cellule mononucleari
Nota: Eseguire tutti i passaggi secondari in un cappuccio sterili per coltura.
<ol><li>Preparare due T75 beute con 20 mL di RPMI. A ciascuna beuta, aggiungere 30 x 106 isolato cellule mononucleari. Incubare le cellule con il pallone in piedi per 16 – 24 h a 5% CO2 e 37 ° C.</li>
</ol>4. preparazione delle piastre rivestite con adesivo cellulare
<ol><li>Cappotto due piastre di analizzatore di flusso 8 pozzetti extracellulare. Nota: Eseguire il rivestimento in un cappuccio sterili per coltura.</li>
	<li>Aggiungere 2,2 μL di adesivo cellulare (densità: 2,54 mg/ml) a 250 μL di 0.1 M NaHCO3, pH 8.1 e pipetta immediatamente 12.5 μL della soluzione in ogni pozzetto. Nota: Soluzioni stock adesive delle cellule può differire nella loro densità, regolare il volume aggiunto a NaHCO3 di conseguenza.</li>
	<li>Lasciate che le piastre sedersi nella cappa per circa 20 min, poi aspirare l'adesivo cellulare e lavare ogni ben due volte utilizzando 200 μL di acqua sterile. Lasciate riposare nella cappa con il coperchio aperto fino a quando i pozzi sono asciutti.</li>
	<li>Utilizzare le piastre subito o salvare fino a 1 settimana a 4 ° C con il cerchio avvolto in film di paraffina per evitare la condensa. Assicurarsi che le piastre vengono riscaldate fino a temperatura ambiente (per circa 20 min) nella cappa prima della semina delle cellule.</li>
</ol>5. idratazione della cartuccia sensore
Nota: Idratare due cartucce di analizzatore di flusso 8 pozzetti extracellulare.
<ol><li>Separare la piastra di utilità e la cartuccia sensore. Capovolgere la cartuccia sensore sul banco di laboratorio.</li>
	<li>Riempire ogni bene della piastra utilità con 200 μL calibratore. Riempire ogni fossato intorno alla parte esterna dei pozzi con 400 μL di calibratore.</li>
	<li>Restituire la cartuccia sensore alla piastra di utilità che contiene ora il calibratore.</li>
	<li>Posizionare la cartuccia in un non-CO, umidificata2, incubatore 37 ° C durante la notte.</li>
	<li>Accendere l'analizzatore di flusso extracellulare e lasciarlo calda a 37 ° C durante la notte.</li>
</ol>6. cellule in piastre rivestite con adesivo cellulari di semina
Nota: Per test di stress di glicolisi, utilizzare mezzo di prova di stress di glicolisi. Per test di stress cellulare Mito, utilizzare mezzo di prova di stress cellulare Mito con BSA.
<ol><li>Cellule di seme per il test di stress di glicolisi e il test di stress cellulare Mito in piatti separati. Per ogni test, è possibile utilizzare celle da una boccetta con cultura durante la notte.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno appropriato e contarli.</li>
	<li>Aggiungere 4 x 106 di cellule vive al volume finale di 400 μL (uso medio appropriato).</li>
	<li>Piastra 50 μL della sospensione delle cellule nei pozzetti B-G. Garantire 500.000 cellule sono seminate in un pozzetto. Nota: È fondamentale per seme esattamente 500.000 cellule per pozzetto come viene eseguita alcuna normalizzazione di altre. In questo modo, i risultati da diversi pazienti possono essere confrontati. Il numero ottimale di ripetizioni è sei, come è descritto qui. Utilizzando meno repliche non è raccomandato poiché le cellule primarie potrebbe comportarsi a volte erroneamente.</li>
	<li>Aggiungere 180 μL del mezzo appropriato nei pozzetti A e H (questi pozzi servirà come una correzione del fondo).</li>
	<li>Centrifugare la piastra a 400 x g per 5 min a temperatura ambiente con freno impostato su 1.</li>
	<li>Aggiungere 130 μL di mezzo appropriato a pozzetti B-G in due piastre di analizzatore di flusso 8 pozzetti extracellulare lentamente e con attenzione. Confermare visivamente che le cellule siano rispettate stabilmente il fondo dei pozzetti di visualizzazione al microscopio.</li>
	<li>Posizionare la piastra in un non-CO, umidificata2, incubatore a 37 ° C per 30 min.</li>
</ol>7. caricamento della cartuccia sensore
<ol><li>Per il test di stress di glicolisi, preparare 250 μL ciascuno di 100 millimetri di glucosio, 20 μM Oligomycin A e 1 M 2-DG, nel mezzo di prova di stress di glicolisi.</li>
	<li>Per il test di stress cellulare Mito preparare 250 μL ciascuno di 20 μM Oligomycin un, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP e una miscela di 10 μM Rotenone e 10 μg/ml Antimycin A, tutti in mezzo, test di stress cellulare Mito senza BSA. Nota: Iniettare due concentrazioni di FCCP in un dosaggio è raccomandato poiché non c'è materiale abbastanza pazienti per la titolazione di FCCP. Tuttavia, le concentrazioni devono essere determinate dal ricercatore.</li>
	<li>Caricare i composti nelle porte appropriato iniettore della cartuccia come segue (tabella 1):</li>
</ol>8. configurazione del programma
<ol><li>Per il test di stress di glicolisi, impostare il programma come descritto nella tabella 2.</li>
	<li>Per il test di stress cellulare Mito, impostare il programma come descritto nella tabella 3.</li>
	<li>Avviare il programma. Sostituire la piastra di calibratore con la piastra di dosaggio (quando richiesto).</li>
</ol>9. valutazione e interpretazione dei risultati
<ol><li>Nei risultati del test di stress di glicolisi, sottrarre il valore più basso di ECAR dopo iniezione 2-DG da tutti gli altri valori ECAR. Nota: Questo valore più basso rappresenta l'acidificazione non glicolitico. Di solito, il valore più basso è da 4 misura dith .</li>
	<li>Calcolare l'acidificazione basale, glicolisi, massima glicolisi e glicolitico riserva parametri dalla funzione glicolitici (Figura 2A). Dopo aver sottratto il valore più basso di ECAR, calcolare l'acidificazione basale come mezzo di ECAR dalle prime tre misurazioni (omettere il primo valore ECAR se si differenzia notevolmente dalle altre due), calcolare la glicolisi come mezzo di ECAR da tre misura punti dopo l'iniezione di glucosio e calcolare la massima glicolisi come una media di ECAR dalla misura tre punti dopo Oligomycin un'iniezione. Calcolare Glycolytic riserva come glicolisi massima meno glicolisi. Nota: In alternativa, per il calcolo di massima glicolisi, utilizzare il valore più alto di ECAR dai tre punti misurati.</li>
	<li>Nei risultati del test di stress cellulare Mito, sottrarre il valore di OCR più basso dopo l'iniezione di Rotenone/Antimycin A da tutti gli altri valori di OCR.</li>
	<li>Calcolare la respirazione basale, produzione di ATP, massima respirazione e parametri di capacità di riserva dalla funzione mitocondriale (Figura 2B). Dopo aver sottratto il più basso valore di OCR, calcolare la respirazione basale come mezzo di OCR dalle prime tre misurazioni. Nota: Massima respirazione è il più alto valore di OCR dopo iniezione FCCP.</li>
	<li>Per il calcolo di produzione di ATP, sottrarre la media dei tre punti di misurazione OCR dopo l'iniezione Oligomycin A da respirazione basale. Calcolare la capacità di riserva come la massima respirazione meno la respirazione basale. Nota: Sempre calcolare la massima respirazione dal più alto valore di OCR, indipendentemente dalla concentrazione FCCP usata.</li>
</ol>

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il protocollo sopra descritto consente la misurazione dell'attività metabolica valutati dai valori OCR ed ECAR primario blasti leucemici derivate da pazienti con leucemia linfoblastica acuta (tutta) o leucemia mieloide acuta (AML). Il vantaggio di misura utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare è che consente il rilevamento del profilo metabolico in tempo reale in cellule vive. Essenzialmente, ogni passo nel protocollo fornito può essere regolata a seconda del tipo di cella che si intende studiare. Qui, discu...

Il profilo metabolico è una delle caratteristiche principali delle cellule e bioenergetica alterato sono ormai considerati uno dei tratti distintivi di cancro1,2,3. Inoltre, cambiamenti nel setup metabolico potrebbero essere utilizzati nel trattamento di cancro targeting per vie di trasduzione del segnale o macchinario enzimatico di cancro cellule4,5,6. Conoscendo la predisposizione metabolica delle cellule tumorali è così un vantaggio e può contribuire a migliorare la terapia corrente.
Ci sono un sacco di metodi già consolidati che può valutare l'attività metabolica delle cellule in coltura. Per quanto riguarda la glicolisi, l'assorbimento del glucosio può essere misurata mediante la marcatura radioattiva, con 2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose) o livelli di lattato extracellulare enzimaticamente misurato7,8. Velocità di ossidazione dell'acido grasso è un altro parametro metabolico misurato dal palmitato isotopicamente etichettato9,10. Tasso di consumo di ossigeno è un metodo ampiamente utilizzato per determinare l'attività mitocondriale in cellule11,12, insieme con la membrana mitocondriale potenziale valutazione13,14, ATP/ADP (adenosina 5 '-trifosfato di adenosina 5 '-difosfato) rapporto misura15 o totale intracellulare ATP misura16. Conosciuta per regolare i processi metabolici di vie di segnalazione potrebbero essere determinata da quantificazioni di proteina e possono migliorare la comprensione delle misure metaboliche17,18,19.
Tuttavia, tutti questi metodi misurano solo uno o, nella migliore delle ipotesi, alcuni parametri metabolici in uno campione contemporaneamente. Misura simultanea del tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) importante, può essere ottenuta per l'analisi di flusso extracellulare da, ad esempio, Seahorse XFp Analyzer. OCR è un indicatore della respirazione mitocondriale ed ECAR è principalmente il risultato della glicolisi (non possiamo ignorare CO2 produzione possibilmente elevare ECAR delle cellule con attività elevata fosforilazione ossidativa)20. Finora, i vari tipi di cellule sono stati studiati utilizzando questi analizzatori21,22,23.
Qui descriviamo il protocollo per l'analisi di flusso extracellulare di primarie blasti (cellule di leucemia derivate dal palco ematopoietica immaturo) da pazienti affetti da leucemia. Al meglio della nostra conoscenza, un protocollo specifico per esplosioni primarie non è ancora disponibile.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Integratore</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino Biosiero</td><td></td><td>FB-1001/100</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100x)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+) Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351-5MG</td><td></td></tr><tr><td>2-Deossi-D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375-1G</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920-10MG</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A da Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium, 100 mL</td><td>Agilent Technologies</td><td>103193-100</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di L-glutammina, 200 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione HEPES, 1 M, pH 7,0-7,6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-25G</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Gradiente di densità medio</td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XFp FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning&trade; Adesivo per cellule e tessuti Cell-Tak</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>CB40240</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di cavallucci marini XFp</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7802A</td><td></td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XFp Minipiastra per colture cellulari</td><td>Agilent Technologies</td><td>103025-100</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

Il requisito metabolico delle cellule tumorali possa influenzare negativamente la sopravvivenza e l'efficacia del trattamento. Al giorno d'oggi, targeting farmaceutici delle vie metaboliche è testato in molti tipi di tumori. Così, la caratterizzazione dell'installazione metabolica delle cellule di cancro è inevitabile al fine di mirare la via corretta per migliorare il risultato complessivo dei pazienti. Purtroppo, nella maggior parte dei cancri, le cellule maligne sono abbastanza difficili da ottenere in numeri più alti e la biopsia del tessuto è richiesta. La leucemia è un'eccezione, dove un numero sufficiente di cellule leucemiche possa essere isolato dal midollo osseo. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule leucemiche dal midollo osseo di leucemia pazienti e l'analisi successiva del loro stato metabolico mediante Analizzatore di flusso extracellulare. Le cellule leucemiche sono isolate dal gradiente di densità, che non pregiudica la loro sopravvivenza. Il prossimo passo di coltivazione li aiuta a rigenerare, così lo stato metabolico misurato è lo stato delle cellule in condizioni ottimali. Questo protocollo permette di ottenere risultati costanti e ben standardizzati, che potrebbero essere utilizzati per la terapia personalizzata.

La figura 3 Mostra le curve dopo glicolisi stress test e misurazioni di test di stress cellulare Mito di blasti leucemici dal BCP-ALL (B-cellula precursore leucemia linfoblastica acuta) e pazienti LMA (leucemia mieloide acuta). Il calcolo dei parametri metabolici da queste misure è anche indicato. 500.000 cellule per pozzetto sono state seminate e tutte le misurazioni sono state fatte in hexaplicates.
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Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento delle cellule leucemiche dal midollo osseo di leucemia pazienti e l'analisi del loro stato metabolico. Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria potrebbe contribuire a caratterizzare meglio la domanda di cellule primarie e potrebbe portare alla medicina più personalizzata.

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave riguardanti la configurazione del percorso metabolico nelle cellule di leucemia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la misurazione del metabolismo delle cellule primarie della leucemia in tempo reale nelle cellule vive. Iniziare diluire un campione di midollo osseo ottenuto da un paziente con leucemia in PBS con un rapporto uno a uno.Con attenzione, strato sei millilitri del campione diluito di midollo osseo oltre sei millilitri di mezzo gradiente di densità appena preparato in un tubo conico da 15 millilitri e separare le cellule per centrifugazione gradiente densità. Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire con cura lo strato di interfaccia delle cellule mononucleari in un nuovo tubo conico da 50 millilitri contenente cinque millilitri di PBS per un lavaggio centrifugato. Quindi, rimostrare il pellet di cellule mononucleari in due millilitri di PBS sterile per il conteggio.Diluire le cellule a una concentrazione di tre volte 10 fino alle sette cellule per millilitro. E aggiungere un millilitro di cellule a ciascuno dei due contenitori T75 contenenti 20 millilitri di mezzo RPMI per un'incubazione

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Ricerca sul cancro

Questo protocollo fornisce un approccio biochimico per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) delle cellule leucemiche primarie con saggio del flusso extracellulare. La valutazione del profilo metabolico di queste cellule aiuta a caratterizzare le loro richieste, portando a una terapia personalizzata.

Saggio del flusso extracellulare: un metodo per misurare il profilo metabolico delle cellule

Chinasi recettore tirosina sono ectopica espresso in molti tumori e sono stati identificati come bersagli terapeutici nella leucemia acuta. Questo manoscritto descrive una strategia efficace per la valutazione pre-clinica degli inibitori della tirosin-chinasi per il trattamento della leucemia acuta.

Valutazione pre-clinica della tirosina chinasi inibitori per il trattamento di leucemia acuta

Il presente rapporto riassume un protocollo che può essere utilizzato per modellare l'influenza della nicchia del microambiente del midollo osseo sulle cellule leucemiche con particolare attenzione all'arricchimento della sottopopolazione più chemioresistente.

Modellazione chemioterapia leucemia resistente<em&gt; In Vitro</em

I neutrofili sono il tipo più abbondante di globuli bianchi. L'isolamento dei neutrofili dal sangue umano mediante il metodo di separazione del gradiente di densità e la differenziazione delle cellule promielocitiche umane (HL60) lungo la via granulocitaria sono descritti qui; testare il loro ruolo sulla sensibilità delle cellule di linfoma agli agenti anti-linfoma.

Neutrofili Isolamento e analisi per determinare il loro ruolo nel linfoma a cellule sensibilità agli agenti terapeutici

Il protocollo qui descritto rappresenta un metodo semplice e riproducibile che impiega la cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa (RP-HPLC) per misurare il metabolismo delle purine su cellule di leucemia linfatica cronica (LLC) coltivate in diverse condizioni.

HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

Rilevazione della malattia residua minima o misurabile (MRD) è un biomarcatore prognostico importante per raffinazione di valutazione del rischio e la previsione di ricaduta in leucemia mieloide acuta (AML). Queste linee guida complete e consigli con le migliori pratiche di coerente e accurata individuazione e rilevazione del MRD, può essere di aiuto nel prendere le decisioni efficace trattamento di AML.

Protocollo completo del campione e del midollo osseo di processo per misurare la malattia residua misurabile e cellule staminali leucemiche nella leucemia mieloide acuta

Descriviamo un protocollo per rilevare l'espressione simultanea di marcatori di cellule staminali leucemia sulle cellule di leucemia mieloide acuta primaria tramite flusso cytometry. Vi mostriamo come quantificare tre popolazioni di cellule progenitrici e una popolazione di LSC putativa con crescente grado di maturazione. Abbiamo confermato la presenza di queste popolazioni in corrispondente paziente-derivato-xenotrapianti.

Il flusso Cytometry per stimare cellule staminali leucemia nella leucemia mieloide acuta primaria e negli xenotrapianti paziente-derivato, alla diagnosi ed al Follow Up

Descriviamo un metodo per l'utilizzo di citometria a flusso multiparametrico per rilevare le specie di ossigeno reattivo mitocondriale (ROS) in cellule staminali e progenitrici (HSPC) e cellule leucemiche da un modello murino di leucemia mieloide acuta (AML) MLL-AF9.

Flusso Analisi citometrica delle specie di ossigeno reattivo mitocondriale nelle cellule staminali e semigeniche Murine Hematopoietic e MLL-AF9 Driven Leucemia

Qui viene presentato un protocollo dettagliato per isolare e caratterizzare le popolazioni microambientali del midollo osseo da modelli murini di sindromi mielodisplastiche e leucemia mieloide acuta. Questa tecnica identifica i cambiamenti nella nicchia del midollo osseo non ematopoietico, comprese le cellule stromali endoteliali e mesenchimali, con progressione della malattia.

Identificazione delle popolazioni microambientali del midollo osseo nella sindrome mielodisplastica e nella leucemia mieloide acuta

Questo protocollo delinea una procedura per indurre la differenziazione delle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane derivate dal midollo osseo del paziente e dalle cellule mononucleari del sangue periferico. Il test utilizza un mezzo di coltura semisolida che supporta l'impegno della linea eritroide e mieloide e incorpora metriche standardizzate per la classificazione delle colonie riproducibili per la caratterizzazione preclinica dei farmaci.

Test unitario formativo di colonie adattato per cellule mononucleari derivate dal paziente nel midollo osseo e nel sangue periferico

Impara a isolare e analizzare il metabolismo delle cellule leucemiche primarie dal midollo osseo. Questo metodo consente misurazioni in tempo reale per sviluppare approcci di medicina personalizzata contro la leucemia.

Valutazione del profilo metabolico delle cellule di leucemia primaria

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