Name: Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprenda modelos de lesão em peixe-zebra adulto para estudar regeneração óssea com prednisolona. Este método combina amputação, fratura e lesão craniana com exposição sistêmica a imunossupressores.

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Este estudo foi suportado por uma concessão do centro de regenerativa terapias Dresden ("Zebrafish como um modelo para desvendar os mecanismos da perda óssea induzida por glicocorticoide") e, adicionalmente, por uma concessão da Deutsche Forschungsgemeinschaft (Transregio 67, projeto 387653785) para FK. Estamos muito gratos a Jan Kaslin e Avinash Chekuru por sua orientação e assistência na realização de trepanação do Calvárias e fraturas nos raios da barbatana ósseas. Experimentos foram projetados, executados e analisados por KG e FK. FK escreveu o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer a Katrin Lambert, Nicole Cudak e outros membros dos laboratórios Knopf e marca para assistência técnica e discussão. Nossos agradecimentos também vai Marika Fischer e Jitka Michling para cuidados excelentes peixes e Henriette Knopf e Josh Currie para revisão do manuscrito.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Landesdirektion Dresden (permitir números: AZ 24D-9168.11-1/2008-1, 24-9168.11-1/2011-52 AZ, AZ 24-9168.11-1/2013-5, 24-9168.11-1/2013-14 AZ, AZ DD24.1-5131/354/87).
1. preparação de materiais e soluções
Nota: Prednisolona, como outros glicocorticoides, leva à imunossupressão. Assim, as precauções devem ser tomadas para prevenir a infecção em animais tratados durante o experimento. Para esse efeito, mercadorias de vidro de autoclave e 'peixe água' (ou seja, a água que é usada para traseira zebrafish adulto) antes de iniciar o experimento.
<ol><li>Calcule o número de zebrafish para ser usado no experimento. Não se esqueça de incluir os indivíduos que servem como controles.</li>
	<li>Provetas de vidro autoclave a 600 mL que são cobertas com folha de alumínio com fita de autoclave. Zebrafish será tratado individualmente, assim 1 copo copo é exigido por zebrafish.</li>
	<li>Calcule a quantidade de peixes de água necessária para o experimento. 300 mL são necessários por pessoa e dia. Levar em consideração o comprimento da experiência (por exemplo, 1 semana/7 dias).</li>
	<li>Encha os frascos de vidro com água de peixe, feche-os e autoclave as garrafas com fita de autoclave. Idealmente, use garrafas de 2 L, mas outros frascos de 1 L ou 5 L podem ser usados também. Nota: Se as experiências são longas (por exemplo, 4 semanas/28 dias) e a quantidade de garrafas de vidro é limitada, certifique-se de preparar garrafas para um mínimo de vários dias de cada vez e repita o processo (1.3 para 1.4) durante todo o experimento.</li>
	<li>Prepare uma solução stock de prednisolona de prednisolona 100mm estéril filtrada em dimetilsulfóxido (DMSO). Congele o estoque em 1 mL ou alíquotas de tubo 2 mL microcentrifuge. Cuidado: Sempre desgaste protetor roupa quando trabalhando com prednisolona (luvas, óculos de segurança, jaleco).</li>
	<li>No primeiro dia do experimento, prepare soluções de incubação com prednisolona e DMSO, respectivamente. Para este fim, descongele a quantidade necessária de solução-mãe de prednisolona 100mm e adicionar prednisolona a água esterilizada peixe em uma concentração final de 50 µM.<ol>
<li>Para os tratamentos de controle, adicione o volume correspondente de DMSO a água esterilizada peixe. Por exemplo, para produzir água de peixe contendo 2L prednisolona, adicione 1 mL de estoque de prednisolona 100 mM para 2 L de água de peixes. Em outra garrafa de 2 L de água do peixe, adicione 1ml DMSO, correspondentemente.</li>
		<li>Trabalhar em local apropriado que é designado para realizar tratamentos com drogas, idealmente em um quarto a 27 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. geração de lesões em barbatanas de Zebrafish
Nota: Para ferir o osso no zebrafish barbatanas, realizar a ressecção da nadadeira (amputação, geralmente na barbatana caudal) ou fratura raios individual de barbatana ósseas (modelo de fratura). Para este fim anestesiar zebrafish adulto primeiro.
<ol><li>Amputação<ol>
<li>Para anestesiar zebrafish adulto, prepare-se um diâmetro de 100 mm placa de Petri contendo 0,02% MS-222 (Metanossulfonato de-3-aminobenzoato de etilo) em água de peixe (a água não precisa ser esterilizada).<ol>
<li>Transferir um zebrafish cada vez para o prato de Petri contendo MS-222 por meio de uma rede de pesca e incube-lo até que ele encontra-se em seu lado sem movimento e não responder ao toque. Teste o último tocando a nadadeira anal com fórceps rombudo.</li>
			<li>Espere até o nível 4 de anestesia é alcançado o que é o nível apropriado para ressecção de barbatana12. Nesta fase, a taxa de movimento odontódios é diminuída, tônus muscular é perdido e o peixe não se move em cima do toque12.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Leve fórceps rombudo e transferir o zebrafish anestesiado com cuidado a tampa invertidos a 100 mm placa de Petri. Coloque o zebrafish na parte lateral. Certifique-se do zebrafish sempre mentem na mesma orientação, por exemplo, no seu lado direito do corpo. Com um bisturi ou uma lâmina de barbear, ressecar 50% da nadadeira (figura 1A, 2A). Nota: A velocidade de regeneração de barbatana zebrafish depende da quantidade de tecido ressecado barbatana, ou seja, o tecido mais de barbatana é ressecado, quanto mais rápido a barbatana regenera13. Assim, para minimizar as variações na regeneração de barbatana certifique-se de sempre ressecar a barbatana do mesmo nível no zebrafish todos.</li>
		<li>Transferi o zebrafish ferido para um copo de vidro esterilizado contendo 300 mL de prednisolona ou DMSO contendo água esterilizada peixe. Cobrir o copo de vidro com papel de alumínio para evitar a fuga do zebrafish.</li>
		<li>Repita as etapas 2.1.2 para 2.1.3 até que seja atingido o número necessário de zebrafish para o experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fratura de barbatana<ol>
<li>Prepare uma agarose-revestido 100 mm placa de Petri aquecendo uma solução de agarose 2% em água de peixe ou E3 (embriões 3, 50mm de cloreto de sódio, cloreto de potássio de 0,17 mM, 0,33 mM de cloreto de cálcio, sulfato de magnésio 0,33 mM). Com cuidado, despeje aproximadamente 10 a 15 mL da solução de Petri. O fundo do prato deve ser completamente coberto. Deixe o agarose solidificar.</li>
		<li>Anestesiar o zebrafish conforme descrito na seção 2.1.</li>
		<li>Leve a fórceps rombudo e transferir o zebrafish anestesiado com cuidado para a agarose-revestido 100 mm placa de Petri. Coloque o zebrafish na parte lateral. Sob o microscópio de dissecação, espalhe a barbatana caudal completamente para ser capaz de identificar os raios da barbatana ósseas distintas e fin ray segmentos. Certifique-se do zebrafish sempre mentem na mesma orientação, por exemplo, no seu lado direito do corpo.</li>
		<li>Com uma agulha de injeção (0,3 x 13 mm) apresente uma fratura no centro de um segmento de ray barbatana ósseas (figura 1B). Para fazer isso, a agulha é colocada ligeiramente o segmento até que uma rachadura apareça (seta na Figura 2B). Enquanto uma pressão suave leva à fratura de apenas um dos hemirays opostos dois mais fortes pressão levará à fratura de ambos os segmentos hemiray.<ol>
<li>Não introduza muitas fraturas em barbatanas, pois isto prejudicará grandemente a estabilidade da nadadeira. Como sugestão, aplica fraturas apenas em 3 a 5 raios de barbatana.</li>
			<li>Sempre produzir fraturas em segmentos correspondentes através de raios diferentes barbatana e zebrafish, por exemplo em raios da barbatana dorsal 3, 7 (ou 8) e ventral fin ray 3. O nível proximal-distal da fratura é ideal em 3 segmentos proximais dos raios da barbatana bifurcação ponto 11.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transferi o zebrafish ferido para um copo de vidro esterilizado contendo 300 mL de prednisolona ou DMSO contendo água esterilizada peixe. Cobrir o copo de vidro com papel de alumínio para evitar a fuga do zebrafish.</li>
		<li>Repita os passos 2.2.2 para 2.2.5 até que seja atingido o número necessário de zebrafish para o experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. geração de lesões crânio raspagem (trepanação)
Nota: A Calvárias no zebrafish são homólogas aos ossos raspagem em mamíferos. Assim, estes ossos exoskeletal14 representam um tecido de especial interesse quando estudar a patogênese da GIO. Para ferir o crânio, trepanação é executada por um furação do frontale so e/ou sistema operacional parietale (Figura 1, C 2) com a ajuda de um microdrill11.
<ol><li>Anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1.</li>
	<li>Segure o zebrafish anestesiado na posição vertical com a pinça, para que os ossos de raspagem são bem visíveis sob um microscópio de dissecação da acima (Figura 1).</li>
	<li>Localize o microdrill rotativa no centro do osso frontal (sistema operacional frontale) e tocar o osso. O buraco produzido é do tamanho da rebarba do microdrill (500 µm, Figura 2, Figura 3B). Nota: Certifique-se de não mover o microdrill lateralmente ao produzir a lesão. Também pare imediatamente quando a resistência do osso de repente cai. Não faça qualquer um mais, caso contrário, o cérebro será danificado 15.</li>
	<li>Transferi o zebrafish lesionado para uma gaiola cheia de água de peixe até que ele se recupere totalmente da anestesia. Vê-lo com cuidado.</li>
	<li>Transferi o zebrafish lesionado para uma água de peixes além de prednisolona ou copo de vidro contendo DMSO.</li>
</ol>4. tratamento de Zebrafish durante a incubação
Nota: Durante a aplicação de prednisolona/DMSO, o medicamento contendo peixes água precisa ser mudada diariamente, e zebrafish precisam de ser alimentados regularmente.
<ol><li>Mudanças de água<ol>
<li>Para trocar a água de peixes, descongelar o estoque de prednisolona 100mm e preparar a quantidade necessária de 50 prednisolona µM em peixes autoclavados água fresca todos os dias do período de tratamento. Prepare o DMSO contendo água do peixe para o controle do zebrafish conformemente.</li>
		<li>Tomar um copo de vidro contendo um único zebrafish alojado em sua solução de incubação e transferir a solução, incluindo o zebrafish em um recipiente apropriado, por exemplo, uma gaiola de habitação temporal. Nota: Sempre usar recipientes separados de intercalar para prednisolona e DMSO trataram zebrafish, respectivamente, para certificar-se de DMSO controle zebrafish não ficam expostas a prednisolona e vice-versa.</li>
		<li>Encha o copo de vidro com droga fresca contendo água de peixe (300 mL).</li>
		<li>Transferi o zebrafish do recipiente provisório para o copo de vidro contendo solução de incubação fresco usando uma rede de pesca. Colocar de volta o papel alumínio para evitar a fuga do zebrafish.</li>
		<li>Se o tempo da experiência superior a 2 semanas, troca os copos de vidro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alimentação<ol>
<li>Não alimente zebrafish durante tratamentos curtos (para até 2 dias). Durante experimentos mais, alimente zebrafish. Tome especial cuidado para evitar a poluição da solução de incubação. Assim, alimentação com Artemia SSP. em vez de com comida floco e somente em cada segundo dia. Nota: Artemia são regularmente usados para alimentar o jovem zebrafish e deve estar disponível na unidade haltering zebrafish.<ol>
<li>Cerca de 2 h antes da água do peixe é trocada, alimentar o zebrafish com Artemia ssp seus copos de vidro. Para fazer isso, use uma pipeta plástica e avanço de 0,5 a 1 mL de solução de Artemia eclodida por copo de vidro.</li>
			<li>Esperar por 2h e trocar a solução de incubação com drogas fresca contendo água de peixes, de acordo com a seção 4.1.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. as análises de amostras
Nota: Após a incubação de zebrafish ferido em prednisolona e DMSO contendo água de peixe, respectivamente, ou realizar análises de mineralização/calcificação do osso (5.1 para 5.3) ou realizar imagens ao vivo de zebrafish sob o microscópio de dissecação (5.4) 10,11,16. Uso de imagens ao vivo para determinar o comprimento regenere barbatana e para detectar diferenças na expressão do gene repórter no zebrafish transgênico.
<ol><li>
Fixação de tecidos de interesse
	<ol>
<li>Para a fixação das aletas e/ou crânios preparar paraformaldeído 4% (PFA) em PBS e congelar a-20 ° C para armazenamento. Utilizar recentemente preparadas 4% PFA em PBS ou descongele a quantidade necessária antes da utilização. Como alternativa, 2% PFA em PBS pode ser usado. Cuidado: PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado sob uma coifa. Utilizar vestuário de protecção.</li>
		<li>Para a fixação das barbatanas, preparar um pequeno prato de Petri (por exemplo, 30 mm) com frio 4% PFA em PBS e certifique-se de que o fundo do prato é totalmente coberto. Para a fixação de crânios, preparar um pequeno frasco de vidro com tampa ou um tubo com frio 4% PFA em PBS. Cuidado: Punho PFA contendo soluções somente sob a coifa como é tóxico. Utilizar vestuário de protecção.</li>
		<li>Colheita no tecido de interesse.<ol>
<li>A colheita se regenerando tecido barbatana ou barbatanas com fraturas anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1 ou eutanásia o zebrafish de acordo com a secção 5.1.5.</li>
			<li>Transferi o zebrafish anestesiado para a tampa de uma caixa de Petri. Usando um bisturi ou lâmina de barbear, colha a regenerar de barbatana. Certifique-se de incluir tecido do tronco em regeneração barbatanas para facilitar a manipulação do tecido colhido.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Corrigi as barbatanas flat no PFA contendo placa de Petri a 4 ° C durante a noite. Fixação plana evita ondulando acima do tecido barbatana durante a fixação.<ol>
<li>Para corrigir plana, pegue o tecido da aleta com uma pinça bem na borda dorsal ou ventral do coto e mergulhá-lo na solução de fixação. Agarre a borda oposta do coto com uma segunda pinça fina e pressione ligeiramente o tecido para o fundo do prato.</li>
			<li>Segure por 10 a 20 s antes de liberar. O tecido de barbatana não deve enrolar mais. Se isso acontecer, repita.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eutanásia em zebrafish para colher tecido crânio lesionado. Preparar um diâmetro de 100 mm placa de Petri contendo 0,1% MS-222, em água de peixe. Transferi um zebrafish cada vez para o prato de Petri contendo MS-222 por meio de uma rede de pesca. Quando é atingido o nível 6 de anestesia (colapso medular) espera pelo menos 10 min para garantir a morte do espécime12.</li>
		<li>Usar um bisturi corta fora a cabeça mais um pouco tecido do porta-malas do resto do corpo. Mergulhe o tecido colhido na solução preparada PFA 4% na jarra de vidro ou tubo plástico. Correção para 24 h a 4 ° C, com balanço suave.</li>
		<li>Para armazenar as amostras a longo prazo após a fixação, lave-os com PBS (3 x 20 min RT) e metanol-deleite em uma série crescente de metanol (1 x 30%, 1 x 50%, 1 x 70%, 2 x 100% metanol em PBS por 20 min cada).<ol>
<li>Armazená-los em metanol 100% a-20 ° C. Caso contrário, diretamente proceda com osso manchar ou outras análises após a lavagem com PBS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Técnicas de coloração de osso eu (coloração de vermelho de alizarina) Nota: Esta coloração é realizada de acordo com van Eeden et al . 199617 e Walker & Kimmel 200718 com modificações.<ol>
<li>Para realizar a coloração de vermelho de alizarina sobre adultas barbatanas ou crânios, colheita e reparar o tecido, conforme descrito nas seções 5.1.</li>
		<li>Se as amostras foram armazenadas em metanol a-20 ° C, reidratar amostras, fazendo uma série de metanol inversa (70%, 50% e 30% em PBS, cada 1 x 20 min) e lavar duas vezes 20 min com PBS. Lave as amostras por 5 min mínimo com água desionizada.</li>
		<li>Para fazer a coloração de vermelho de alizarina em crânios, tratar as amostras com tripsina 50 mg/mL em 30% saturado Na2B4O7 , à temperatura ambiente durante a noite. Amostras de rocha durante este tempo. Amostras de enxágue em 30% Na2B4O7 solução saturada. Lave as amostras com água desionizada, 2 vezes por 5 min cada. Esta etapa não é executada pelo tecido de barbatana.</li>
		<li>Adicionar solução de vermelho de alizarina (parte b: 0,5% vermelho de alizarina S pó, 10% de glicerol em água desionizada) e as amostras de rock durante a incubação a RT. Check para coloração após 1, 2, 4 h ou durante a noite.</li>
		<li>Para limpar as amostras tratá-los com uma série de glicerol: hidróxido de potássio 1% decrescente (3:1 durante a noite, 1:1 durante a noite, a noite de 1:3).</li>
		<li>Armazenar as amostras em solução de hidróxido de potássio 0,1% 1:1:80 % de glicerol e montá-los com 80% de glicerol para a imagem latente. Nota: Para combinado Alcian blue/alizarina vermelha manchando amostras de deleite com Alcian azul coloração solução (parte a: 0.02% final Alcian azul, 50 mM MgCl2, 70% de etanol) após reidratação (seção 5.2.2) por 2 h em RT. Treat aletas com uma série de etanol decrescente em 50 mM MgCl2 (70%, 50%, 30%, cada 1 x 15 min) e lave-os durante um período mínimo de 1 h (3 x 20 min) em água desionizada. Proceda com vermelho de alizarina, coloração (seção 5.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Técnicas de coloração II (calceína coloração) do osso Nota: Para detectar a deposição de cálcio na barbatana fraturas e lesões de crânio, peixes vivos são incubados em calceína contendo a solução.<ol>
<li>Prepare a quantidade necessária de calceína 0,2% em água desionizada (pH 7,5). Certifique-se que o pH é neutro. Use 1 M de NaOH para ajustar o pH.</li>
		<li>Incube até 3 zebrafish simultaneamente em 100 mL de solução de calceína por 20 min em um copo de vidro coberto com papel alumínio.</li>
		<li>Transferi o zebrafish para um copo com água de peixe. Deixá-los nadar brevemente antes de transferi-los para um novo copo com água de peixe. Deixá-los nadar neste copo de novo por 20 min lavar. Tire fotos (ver secção 5.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Viver a imagem latente de zebrafish
	<ol>
<li>Use essa abordagem para adquirir imagens de regenerar o tecido ósseo, tais como na barbatana ou crânio durante todo o experimento sem sacrificar o zebrafish. Anestesiar o zebrafish de acordo com a seção 2.1.</li>
		<li>Para adquirir imagens de barbatana regenera, transferi o zebrafish anestesiado para um prato de Petri revestida de agarose (veja a seção 2.2.1 e figura 1B).</li>
		<li>Para adquirir imagens de regenerar ossos do crânio, endireite o zebrafish em uma esponja (Figura 1) ou coloque em um prato de agarose-revestido que foi preparado para segurar o porta-malas do zebrafish.</li>
		<li>Adquira imagens na ampliação desejada e resolução usando uma configuração de stereomicroscopic.</li>
		<li>Retorne o zebrafish para um recipiente com fresco ou drogas que contenham água de peixe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Oppedal, D., Goldsmith, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+screen+to+identify+novel+inhibitors+of+fin+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A chemical screen to identify novel inhibitors of fin regeneration in zebrafish.</a> Zebrafish. 7 (1), 53-60 (2010).</li>
<li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).</li>
<li>Spoorendonk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+and+Cyp26b1+are+critical+regulators+of+osteogenesis+in+the+axial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton.</a> Development. 135 (22), 3765-3774 (2008).</li>
<li>Gioia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperone+activity+of+4PBA+ameliorates+the+skeletal+phenotype+of+Chihuahua%2C+a+zebrafish+model+for+dominant+osteogenesis+imperfecta%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">The chaperone activity of 4PBA ameliorates the skeletal phenotype of Chihuahua, a zebrafish model for dominant osteogenesis imperfecta.</a> Human Molecular Genetics. 26 (15), 2897-2911 (2017).</li>
<li>Fiedler, I. A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severely+impaired+bone+material+quality+in+Chihuahua+zebrafish+resembles+classical+dominant+human+osteogenesis+imperfecta%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Severely impaired bone material quality in Chihuahua zebrafish resembles classical dominant human osteogenesis imperfecta.</a> Journal of Bone and Mineral Research. , (2018).</li>
<li>Fisher, S., Jagadeeswaran, P., Halpern, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiographic+analysis+of+zebrafish+skeletal+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiographic analysis of zebrafish skeletal defects.</a> Developmental Biology. 264 (1), 64-76 (2003).</li>
<li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+deformity+in+aged+zebrafish+is+accompanied+by+degenerative+changes+to+their+vertebrae+that+resemble+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spinal deformity in aged zebrafish is accompanied by degenerative changes to their vertebrae that resemble osteoarthritis.</a> PLoS One. 8 (9), e75787(2013).</li>
<li>Mitchell, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+osteoarthritis+genetics+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish.</a> Osteoarthritis Cartilage. 21 (2), 269-278 (2013).</li>
<li>Fleming, A., Sato, M., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+in+vivo+screening+for+bone+anabolic+compounds+with+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">High-throughput in vivo screening for bone anabolic compounds with zebrafish.</a> Journal of Biomolecular Screening. 10 (8), 823-831 (2005).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Zebrafish provaram ser úteis em pesquisa esquelética em muitos aspectos. Selecionado mutantes imitam aspectos das doenças humanas, tais como osteogênese imperfeita ou osteoartrite23,24,25,26,27, e as larvas, bem como escalas estão sendo usadas para Identifica compostos anabólicos de osso na molécula pequenas telas7,<sup class...

Zebrafish representam um poderoso modelo animal para estudar a doença e desenvolvimento de vertebrados. Isto é devido ao fato de que eles são pequenos animais que se reproduzem muito bem e que o seu genoma é totalmente sequenciado e passível de manipulação1. Outras vantagens incluem a opção de executar a imagem ao vivo contínua em diferentes fases, incluindo no vivo por imagens do zebrafish adulto2e a capacidade de executar telas de drogas de alto throughput em zebrafish larvas3. Além disso, o zebrafish possuem uma alta capacidade regenerativa em uma variedade de órgãos e tecidos, incluindo o osso e, portanto, servir como um sistema útil para estudar a doença do esqueleto e reparar4,5.
Osteoporose induzida por glicocorticoide (GIO) é uma doença que resulta do tratamento a longo prazo com glicocorticoides, por exemplo, no curso de tratamento de doenças auto-imunes, tais como de asma ou artrite reumatoide. GIO desenvolve-se em cerca de 30% dos pacientes tratados com glicocorticoides e representa uma grande saúde questão6; Portanto, é importante investigar o impacto da imunossupressão no tecido ósseo em grande detalhe. Nos últimos anos desenvolveram-se uma variedade de modelos de zebrafish, lidando com a patogênese da GIO. Perda óssea mediada por glicocorticoide tem sido induzida no zebrafish as larvas, por exemplo, que levou à identificação de compostos antídoto, aumentando a massa óssea em uma droga tela7. Além disso, efeitos inibitórios óssea induzida por glicocorticoides têm sido imitados no zebrafish escalas tanto in vitro e in vivode8,9. Estes ensaios são muito convincentes abordagens, especialmente quando se trata de identificação de novos medicamentos imunossupressores e osso de anabólico. No entanto, eles apenas parcialmente levam em conta o endoesqueleto e não tem sido realizados num contexto regenerativo. Assim, eles não permitem a investigação dos efeitos mediados por glicocorticoide durante rápidas modos de formação do osso adulto, regenerativa.
Aqui, apresentamos um protocolo que permite aos pesquisadores estudar os efeitos mediada por glicocorticoide em ossos de zebrafish adultos submetidos a regeneração. Modelos de lesão incluem amputação parcial de zebrafish barbatana caudal, trepanação do crânio, bem como a criação de fraturas de raio de barbatana (figura 1A-1-C) e são combinados com glicocorticoides exposição através de incubação (Figura 1E ). Recentemente usamos uma parte do presente protocolo para descrever as consequências da exposição a prednisolona, um dos medicamentos comumente prescritos corticosteroides, em adultos do zebrafish regenerando fin e crânio osso10. No zebrafish, administração de prednisolona leva à proliferação osteoblástica diminuída, diferenciação osteoblástica incompleta e rápida indução da apoptose na linhagem monócitos/macrófagos10. Neste protocolo, também descrevemos como fraturas podem ser introduzidas na única barbatana ósseas ray segmentos11, como esta abordagem pode ser útil quando estudando efeitos mediados por glicocorticoide no osso ocorrendo durante o reparo de fratura. Os métodos apresentados aqui ajudarão a mais endereço subjacente mecanismos de ação do glicocorticoide em rápida regeneração óssea e também podem ser empregados em outras configurações de administração de drogas sistêmicas no contexto da regeneração de tecidos do zebrafish.

<table><tbody><tr><td>Prednisolona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6004</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Etil-3-aminobenzoato metanossulfonato (MS-222)</td><td>Pinça Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>sem corte</td><td>Aesculap</td><td>BD027R</td><td></td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Dumont</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Agulha</td><td>de injeção Braun 5518059</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>(0,3 mm x 13 mm)</td><td>BD Beckton Dickinson</td><td>30400</td><td></td></tr><tr><td>Micro broca</td><td>Cell Point Scientific</td><td>67-1000</td><td>distribuída e.g. por Harvard Apparatus</td></tr><tr><td>Fresas de aço (0,5 &micro; m de diâmetro)</td><td>Ferramentas de Fine Science</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>Artemia ssp.</td><td>Sanders</td><td>425GR</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur (plástico, Pastette)</td><td>Alpha Labs</td><td>LW4111</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin red S pó</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Alcian blue 8 GX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5268</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7409</td><td></td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Leica</td><td>MZ16 FA</td><td>com câmera QIMAGING RETIGA-SRV</td></tr><tr><td>Estereomicroscópio</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>com câmera Olympus DP71 ou DP80</td></tr></tbody></table>

modelos de lesão adulto zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish são capazes de regenerar vários órgãos, incluindo os apêndices (aletas) após amputação. Isso envolve a regeneração do osso, que regrows dentro de aproximadamente duas semanas após a lesão. Além disso, zebrafish são capazes de curar ossos rapidamente após a trepanação do crânio e reparar fraturas que podem ser facilmente introduzidas em raios de barbatana ósseas zebrafish. Estes ensaios de lesões representam paradigmas experimentais viáveis para testar o efeito de drogas administradas em rapidamente formando o osso. Aqui, descrevemos o uso destes modelos 3 lesões e seu uso combinado com tratamento glicocorticoide sistêmico, que exerce efeitos inibitórios e imunossupressoras de osso. Nós fornecemos um fluxo de trabalho sobre como se preparar para tratamento imunossupressor no zebrafish adulto, ilustram como realizar amputação de barbatanas, trepanação de raspagem ossos e fraturas de barbatana e descrever como o uso de glicocorticoides afeta ambos osso formando osteoblastos e células da linhagem de monócitos/macrófagos como parte da imunidade inata no tecido ósseo.

O protocolo apresentado aqui tem sido usado repetidamente para induzir a formação de osso rápida durante a regeneração do zebrafish fin e crânio10,11,16. Em combinação com o método apresentado da administração de prednisolona, estudos sobre os efeitos do prednisolona durante a regeneração óssea podem ser perseguidos. Por exemplo, estudos sobre a formação óssea e mineralização na regenerar podem s...

Aqui, descrevemos 3 modelos de lesão de zebrafish adultos e seu uso combinado com tratamento de drogas imunossupressoras. Nós fornecemos orientação nas imagens de regenerar tecidos e na detecção de mineralização óssea nele.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da intervenção terapêutica imunossupressor para estudar os efeitos adversos de drogas na regeneração tecidual, em particular, nos ossos. A principal vantagem desta técnica é que combina modelos passados de regeneração óssea de Zebrafish com exposição sistêmica de drogas pela imersão do zebrafish ferido na água de peixe suplementada. Antes de iniciar o procedimento, autoclave uma folha de alumínio coberta 600 mililitros por zebrafish e um número apropriado de garrafas de vidro de água de peixe para o experimento e preparar a droga imunossupressor em soluções de controle experimental de interesse.Para uma lesão de amputação, use fórceps contundentes para colocar cuidadosamente um zebrafish anestesiado em seu lado lateral na tampa inversa de uma placa de Petri de 100 milímetros e use um bisturi para ressecar 50% da barbatana. Em seguida, coloque o peixe em um béquer autoclaved contendo 300 mililitros de água de peixe suplementado com agente experimental apropriado e cubra o béquer com papel alumínio para evitar a fuga de zebrafish. Para induzir uma lesão de fratura na barbatana, coloque um zebrafish anestesiado em seu lado lateral em uma placa de Petri revestida de 100 milímetros sob um microscópio dissecando e empurre uma agulha de injeção ligeiramente em um segmento de raio-barbatana óssea até que uma rachadura apareça.É importante introduzir não muitas fraturas na barbatana, pois isso pode prejudicar muito a estabilidade. Em seguida, transfira o peixe para um béquer autoclaved contendo 300 mililitros de água de peixe complementado com o agente experimental apropriado. Para gerar uma lesão no crânio calvarial, segure um zebrafish anestesiado na posição vertical para que os ossos do calvário sejam facilmente visualizados sob um microscópio de dissecção.Coloque uma micro broca rotativa equipada com uma broca de 500 micrômetros sobre o centro do osso frontal e toque suavemente no osso para produzir um orifício do tamanho da micro broca. É fundamental não mover a broca lateralmente durante a produção da lesão e parar imediatamente assim que a resistência do tecido cair. Caso contrário, o cérebro será danificado.Em seguida, coloque o peixe em um béquer autoclaved contendo 300 mililitros de água de peixe complementada com o agente experimental apropriado. Troque a água nos béquers diariamente transferindo o zebrafish e a água dos peixes para um recipiente temporário apropriado e reabastecendo o béquer com água de peixe suplementada com drogas frescas. Em seguida, use uma rede de peixes para devolver o Zebrafish ao seu béquer.Para tratamentos com duração de até dois dias no total, não alimente o Zebrafish. Durante experimentos mais longos, alimente o Zebrafish com 0,5 a um mililitro de Artemia SSP eclodida a cada dois dias. Para análise de lesões na barbatana, colhe a multa e use fórceps finos para agarrar a barbatana em uma borda do toco.Use um segundo par de fórceps para pegar a borda oposta do toco e pressione ligeiramente o tecido na parte inferior do prato que contém pfa frio de 4% por 10 a 20 segundos. Repita o achatamento da barbatana conforme necessário. A barbatana deve agora ficar plana sem enrolar.Para armazenamento de amostras de longo prazo após a fixação, lave o tecido com três lavagens pbs de 20 minutos e uma série ascendente de metanol. As amostras podem então ser armazenadas em 100% de metanol a menos 20 graus Celsius. Para a coloração alizarina vermelha, o metanol rehidrata armazenado amostras em uma série de metanol descendente seguido de duas lavagens de 20 minutos em PBS e uma lavagem de cinco minutos em água deionizada.Após a última lavagem, adicione a solução Alizarin Red ao tecido amostral e incubar a amostra à temperatura ambiente com balanço para o período de coloração adequado. Para limpar as amostras, trate o tecido com a diminuição da série de glicerol de hidróxido de potássio de 1%. Em seguida, armazene as amostras em uma solução de hidróxido de potássio de 0,1% a 80% glicerol e monte os tecidos com 80% de glicerol para imaginar.Para a coloração de Calcein, incubar até três zebrafish simultaneamente em 100 milímetros de solução calcein por 20 minutos em um béquer de vidro coberto com papel alumínio. No final da incubação, transfira o Zebrafish para um recipiente de água de peixe e deixe os peixes nadarem brevemente antes de transferi-los para um novo recipiente de água de peixe. Após 20 minutos no segundo béquer para adquirir imagens ao vivo de fin regenera, coloque um zebrafish anestesiado em uma placa de Petri revestida de agarose e imagem a barbatana por microscopia estéreo.Para adquirir imagens dos ossos regeneradores do crânio, coloque o zebrafish em pé em uma esponja e imagem do crânio por microscopia de fluorescência. O tratamento com Prednisolona, semelhante a outros glicocorticoides, leva a uma inibição geral da regeneração de barbatanas, incluindo a formação óssea detectada pela mancha vermelha de Alizarin de tecido de barbatana caudal fixa. Da mesma forma, a droga tem efeito retardante no fechamento da lesão do crânio calvarial.Devido à imunossupressão, números reduzidos de macrófagos também podem ser detectados por imunohistoquímica em seções de tecido congelado, como evidenciado pelo uso de manchas de anticorpos anti-mCherry e anti-GFP e mpeg-1 mCherry transgênicos cruzados com Osterix NGFP Zebrafish em amostras de tecido craniano zebrafish de animais tratados com Prednisolona. Ao tentar esses procedimentos, é importante minimizar a variabilidade na velocidade de regeneração óssea realizando os ensaios de lesão de forma altamente reprodutível. Também é crucial para a casa única zebrafish em béquers autoclaved contendo água de peixe autoclaved, a fim de evitar infecção microbiana.Este protocolo ajudará a abordar ainda mais os mecanismos subjacentes da ação glicocorticoide. Por exemplo, no contexto da osteoporose induzida por glicocorticoide e também pode ser adaptada para o uso de outras drogas e outros ossos de zebrafish.

adult-zebrafish-injury-models-to-study-effects-prednisolone

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Para lançar luz sobre os mecanismos celulares e moleculares da neurogênese e regeneração do peixe-zebra adulto, desenvolvemos um protocolo para cirurgia invasiva causando lesões mecânicas no telencéfalo adulto do peixe-zebra e subsequente monitoramento de alterações no hemisfério esfaqueado por imuno-histoquímica ou hibridização in situ.

Stab ferida ferimento do peixe-zebra adulto Telencéfalo: Um método para investigar Vertebrados Cérebro Neurogênese e Regeneração

Aqui apresentamos um método confiável para estudar a regeneração renal adulta induzindo lesão renal aguda por injeção de gentamicina. Mostramos que a lesão depende da dosagem de gentamicina e da temperatura ambiente usando hibridização in situ para rotular lhx1a+ em desenvolvimento de novos néfrons.

A regeneração renal em Zebrafish Adulto por lesão induzida pela gentamicina

Aqui, apresentamos um protocolo para transplante de células do músculo esquelético do peixe-zebra e rabdomiossarcoma embrionário (ERMS) em peixe-zebra mutante homozigoto rag2E450fs imune adulto. Este protocolo permite a análise eficiente da regeneração e transformação maligna das células musculares.

Normais e malignas Transplante de Células Muscle em imunológico comprometido Adulto Zebrafish

Este protocolo descreve os procedimentos para induzir lesão renal aguda (AKI) em zebrafish adulto usando cisplatina como um agente nefrotóxico. Detalhamos as etapas para avaliar a reprodutibilidade da técnica e duas técnicas para analisar inflamação e morte celular no tecido renal, citometria de fluxo e TUNEL, respectivamente.

Modelo de lesão renal aguda induzida por cisplatina em zebrafish adulto

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Modificamos o modelo de queda de peso de Marmarou para o zebrafish adulto para examinar uma amplitude de patologias após lesão cerebral traumática por força bruta (TCE) e os mecanismos subjacentes à regeneração neuronal subsequente. Este modelo de TBI de força bruta é escalável, induz um TCE leve, moderado ou grave, e recapitula a heterogeneidade da lesão observada no TBI humano.

Um modelo escalável para estudar os efeitos da lesão por força bruta em zebrafish adulto

Um modelo de lesão cerebral mecânica em peixes-zebra adultos é descrito para investigar os mecanismos moleculares que regulam sua alta capacidade regenerativa. O método explica para criar uma lesão por facada no tecto óptico de várias espécies de pequenos peixes para avaliar as respostas regenerativas usando imunomarcação fluorescente.

Modelo de Lesão por Arma Branca do Adulto Óptico Utilizando Zebrafish e Medaka para Análise Comparativa da Capacidade Regenerativa

Este protocolo descreve a coleta e visualização de escamas elasmoides de zebrafish durante a regeneração in vivo . Além disso, é apresentado o cultivo ex vivo dessas cochonilhas por até 7 dias após a colheita.

Regeneração de Escamas de Zebrafish em Toto e Cultura Ex Vivo de Escamas

Este protocolo descreve um modelo de criolesão para induzir danos profundos de vários miômeros caudais em zebrafish adultos. Este método fornece uma nova abordagem para o estudo da regeneração muscular esquelética após perda severa de tecido em vertebrados não mamíferos.

Modelo de criolesão para o estudo da regeneração muscular esquelética do pedúnculo caudal em zebrafish adulto

Este protocolo oferece um método para estudar a dinâmica celular usando uma técnica simples de cultura in vitro . Ele oferece uma oportunidade para pesquisadores e educadores de peixes-zebra estudarem processos celulares, como aqueles relacionados à homeostase óssea e biologia celular básica, visualizando núcleos fluorescentes e células apoptóticas dentro das escamas.

Técnica de cultivo in vitro para estudo da dinâmica celular em escamas de peixe-zebra

Este protocolo descreve uma abordagem de ablação a laser de dois fótons realizada em larvas de peixe-zebra, que serve como modelo para estudar a regeneração óssea e os efeitos da resposta imune à ablação.

Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento

Aprenda modelos de lesão em peixe-zebra adulto para estudar regeneração óssea com prednisolona. Este método combina amputação, fratura e lesão craniana com exposição sistêmica a imunossupressores.

Modelos de lesão adulto Zebrafish para estudar os efeitos de prednisolona na regeneração de tecido ósseo

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