Reverter a transcrição Loop-mediada por amplificação isotérmica (RT-lâmpada) ensaio para vírus Zika e Housekeeping Genes em amostras de Mosquito, soro e urina

Este método pode determinar rapidamente se as amostras contêm zika vírus. Isso é útil para mulheres grávidas, casais que tentam engravidar ou vigilância de populações locais de mosquitos que estão em risco de infecção pelo Zika. A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, fácil, não requer equipamentos caros, e pode ser feita sem uma etapa de isolamento de RNA.

As implicações dessa técnica se estendem para o diagnóstico da infecção pelo Zika, pois a infecção durante a gravidez está ligada ao aborto, natimorto e outros defeitos congênitos e neurológicos graves. Embora este método possa fornecer informações sobre o Zika, ele também pode ser aplicado a outras doenças infecciosas, como dengue, chikungunya ou vírus do Nilo Ocidental usando primers específicos do vírus. Para começar, reconstitua cada primer RT-LAMP em água de grau molecular para uma concentração final de 100 micromolar.

Brevemente vórtice a solução primer para garantir que a solução seja homogênea. Centrifugar por cerca de cinco segundos em velocidade máxima para coletar a solução primer. Em seguida, prepare um mix de primer RT-LAMP de 10x, conforme descrito na tabela dois do protocolo da tecnologia.

Vórtice brevemente para garantir a homogeneidade. E centrífuga brevemente em velocidade máxima para evitar qualquer perda. Armazene os primers a menos 20 graus Celsius, entre os usos, evitando quaisquer ciclos de congelamento.

Para amostras de urina humana, use urina fresca, urina congelada ou urina em conservantes. Descongele todas as amostras congeladas no gelo antes de usar. As amostras de soro humano devem ser frescas ou congeladas, enquanto as linhas de células infectadas pelo ZIKV devem conter mídias condicionadas ou lises celulares.

Finalmente, para mosquitos Aedes aegypti, use carcaças inteiras, frescas ou congeladas. Descongele qualquer carcaça de mosquito congelado no gelo. Coloque um mosquito individual em 100 microliters de PBS.

Usando uma ponta de pipeta P10, esmague o mosquito 10 vezes e homogeneize-o para criar um mosquito cru. Centrifufique brevemente o lise bruto para pelotar qualquer detrito e use o sobrenatante para análise rt-lamp a jusante. Para começar, prepare uma reação de mistura mestre RT-LAMP no gelo para cada primer definido a ser usado, como esboço por tabela três no protocolo da tecnologia.

Vórtice cada amostra para garantir que ele esteja bem misturado. Em seguida, gire-os brevemente para baixo para evitar perda de volume. Para cada reação, a pipeta 23.0 microliters do mestre RT-LAMP se mistura em um tubo PCR de 200 microliteres.

Em seguida, adicione dois microliters de amostra para trazer o volume total para 25,0 microliters. Use água de grau molecular para o controle negativo, e certifique-se de incluir um controle positivo. Opcionalmente, inclua uma reação de controle de especificidade de um arbovirose relacionado, como o vírus da dengue, conforme descrito no protocolo da tecnologia.

Usando um bloco de calor, banho de água ou um termociclador, aqueça as amostras a 61 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, aumente o calor para 80 graus Celsius por 10 minutos para desativar a polimerase. Realize a análise RT-LAMP em um espaço fechado separado.

Diluir o corante de ácido nucleico fluorescente de um a dez em tampão TAE. Adicione dois micorliters da solução de corante ácido nucleico fluorescente a 12 micorliters da reação RT-LAMP. Avalie as reações RT-LAMP visualmente procurando a presença de uma mudança de cor.

Opcionalmente use uma câmera para tirar fotos de reações RT-LAMP em um fundo branco. Em seguida, coloque as amostras sob uma luz UV de 302 nanômetros para confirmar a presença de produtos RT-LAMP por fluorescência. Use uma câmera para tirar uma foto do resultado.

Para começar a realizar a eletroforese despeje gel de 2%agarose em 1x tampão TAE com uma mancha de ácido nucleico para visualização. Adicione cinco microliters de uma escada de DNA na primeira pista para comparar os pesos moleculares. Para cada reação RT-LAMP, misture 13 microliters de mistura de reação RT-LAMP com dois microliters de corante de carregamento de DNA.

Carregue esta mistura de 15 microliter. Execute o gel a 90 volts por 90 minutos ou até que as bandas estejam separadas. Uma imagem com 302 nanômetros de luz UV.

Quando terminar, descarte reações RT-LAMP em sacos selados duplos. Neste estudo, são utilizados três métodos diferentes para analisar as reações RT-LAMP. Ao usar corante ácido nucleico fluorescente, as reações positivas tornam-se de cor verde-amarela, enquanto as reações negativas aparecem laranja.

Este corante também resulta em um sinal fluorescente quando as amostras são animadas pela luz UV. Por fim, as reações RT-LAMP podem ser esgotadas em um gel de agarose. Reações positivas rt-LAMP terão um padrão de banda, enquanto reações negativas não terão faixas de DNA.

Estes métodos são usados para demonstrar a especificidade da reação ZIKV RT-LAMP. Apenas o controle molecular ZIKV tem uma reação RT-LAMP positiva. Além disso, enquanto zikv é detectado tanto na urina quanto no soro de um paciente com infecção zikv conhecida, ele não é visto no paciente de controle assintomático sem infecção por ZIKV.

As amostras são então testadas para rRNA humano 18S. Apenas as amostras colhidas dos pacientes são consideradas positivas para rRNA 18S. As amostras de mosquitos podem ser testadas da mesma forma para ZIKV ou para o controle de qualidade RT-LAMP AEDAE.

Apenas o controle molecular positivo para ZIKV e o mosquito infectado com ZIKV são vistos como positivos para ZIKV. No entanto, todos os mosquitos são positivos para AEDAE por RT-LAMP. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de 30 minutos se for executada corretamente.

É importante lembrar que as reações RT-LAMP são propensas a reações falsas positivas. As etapas de prevenção incluem o uso de um glicoscil de DNA uracil termolabile em reações, usando um fluxo de trabalho lateral, realizando análises em um espaço separado e reduzindo o tempo de tempo que os tubos pós-amplificação estão abertos. Após este procedimento, outros métodos como qpcr podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais, como quantas cópias o vírus, ou outros alvos, estão presentes na amostra.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o RT-LAMP para detectar o vírus Zika e direcionar controles na urina humana e soro, bem como mosquitos. Não se esqueça que trabalhar com zika vírus e mancha de ácido nucleico pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento. Dada a associação da infecção pelo zika vírus com anormalidades congênitas, as mulheres que estão grávidas, tentando engravidar ou parceiras dessas mulheres, devem minimizar significativamente sua exposição laboratorial ao vírus Zika.