Geração de culturas de tecido de pulmão humano de 3D (3D-CTIs) para modelagem de doença
12 de fevereiro de 2019
Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação de fatias de cheias de agarose humano pulmão de precisão de corte de tecido ressecado de pacientes que são adequados para a geração de culturas de tecido de pulmão 3D para doenças de pulmão humano modelo em estudos biológicos e biomédicos.
Este método permite a investigação do tecido humano vivo em sua estrutura 3D natural e composição para a tradução dos principais achados laboratoriais em terapias potenciais. Esta técnica permite especificamente a geração de culturas teciduais a partir de tecido pulmonar cirurgicamente ressectado ou explanado para a visualização de amostras de tecido pulmonar de pacientes falecidos individuais. O tecido pulmonar livre de doenças pode ser usado como culturas teciduais 3D para modelar doenças pulmonares ex vivo permitindo a análise de mecanismos precoces em uma alta resolução espacial.
Comece colocando a amostra pulmonar resseccionada em 15 mililitros de meio de cultivo em um prato de cultura estéril de 15 centímetros e bandeja de metal estéril coberta de papel de tecido, e encha uma seringa de 30 mililitros com 42 graus Celsius de baixo ponto de fusão. Remova o obturador de um cateter venoso periférico e conecte o cateter à seringa de 30 mililitros. Identifique um brônquio de 0,5 a 3 milímetros de diâmetro no tecido ventilativo em uma seção intacta do tecido, e insira suavemente a cânula em brônquios o mais longe possível.
Use fórceps para comprimir a parede de brônquio ao redor da cânula, idealmente fixando qualquer artéria pulmonar adjacente ao mesmo tempo, para selar os brônquios ao redor da cânula e usar um grampo cirúrgico para ocluir quaisquer outras vias aéreas adicionais, para evitar o vazamento de agarose. Em seguida, use os fórceps para levantar o tecido pulmonar do prato de cultura, e use a seringa para entregar manualmente a agarose através da cânula, não mais rápido que 0,3 mililitros por segundo. Quando o tecido pulmonar estiver completamente preenchido sem inflar demais o tecido, remova imediatamente a cânula e aperte o brônquio.
Submergir o tecido em meio de cultura a quatro graus Celsius por 30 minutos para facilitar a solidificação da ágarose, e repetir o procedimento de enchimento de agarose para quaisquer aberturas adicionais de brônquio. Em seguida, armazene as seções de tecido pulmonar recheadas em quatro graus Celsius médio até cortar. Para cortar o pulmão de precisão, identifique as regiões solidamente cheias de agarose dentro do tecido pulmonar, que não entram em colapso quando suavemente pressionadas com pinças contra o fundo do prato de cultura celular.
Extite um bloco de 1 a 1,5 centímetro cúbico de região solidamente preenchida com um lado ainda coberto de pleura, e use cola cianoacrilato para anexar o lado plural de cada bloco de tecido ao suporte de vibratome. Corte todo o caminho através do bloco de tecido longo, até que apenas dois a três milômetros de tecido são deixados sem corte. Utilização de fórceps para transferir cada seção de 500 micrômetros para um poço de uma placa de doze poços contendo meio de cultivo, como são obtidos.
Quando todo o tecido tiver sido seccionado, transfira as amostras de cada poço em pratos individuais de cultura de dez centímetros e posicione um perfurador de biópsia de quatro milímetros ortogonalmente para a superfície superior da fatia pulmonar cortada com precisão. Em seguida, movendo o perfurador em rotações no sentido horário e anti-horário, obtenha socos teciduais da amostra pulmonar. Colocando cada soco em meio de cultura celular fresca em poços individuais de uma placa de 96 poços à medida que são obtidos.
Quando todos os socos teciduais tiverem sido obtidos, coloque a placa na incubadora de cultura celular por até cinco dias. A imunolacção da fibronectina nos núcleos celulares usando a Imunofluorescência em culturas humanas de tecido pulmonar 3D permite a imagem da estrutura alveolar preservada ex vivo. O tratamento dos golpes de corte de precisão humana com um coquetel de citocina profibrotic por 48 horas resulta em alterações semelhantes à fibrose nas culturas de tecido 3D do pulmão humano, incluindo a indução significativa dos componentes da matriz extracelular relevante da fibrose, colágeno Tipo Um e genes de fibronectina.
Além disso, os níveis proteicos da vimentina marcador mesenquimal são regulados em três dos quatro pacientes após o tratamento de socos da cultura do tecido pulmonar 3D. Após esse procedimento, outros métodos como a análise de RNA por PCR quantitativo em tempo real, ou análise de proteínas por mancha ocidental, podem ser realizados para avaliar a expressão genética e proteica, respectivamente, dentro do tecido. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da pneumologia experimental, para explantar a biologia pulmonar, bem como para realizar estudos toxicológicos e farmacológicos em amostras de tecido humano.
Lembre-se que o tecido humano vivo é potencialmente infeccioso e que medidas de precaução, como o uso de equipamentos de proteção individual e armazenamento adequado de tecidos, transporte e manuseio de resíduos, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para o preparo de fatias pulmonares humanas cortadas com precisão preenchidas com agarose, obtidas a partir de tecido de pacientes ressecados. Essas fatias são adequadas para gerar culturas de tecido pulmonar tridimensionais destinadas a modelar doenças pulmonares humanas em estudos biológicos e biomédicos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Pesquisa biomédica
- Modelagem de doenças pulmonares
- Técnicas de cultivo de tecidos 3D
Contexto
- Tecido pulmonar humano pode ser usado para estudar doenças em uma estrutura tridimensional natural.
- Este método permite a visualização de amostras pulmonares individuais de pacientes.
- Ele possibilita a análise de patomecanismos iniciais com alta resolução espaciotemporal.
- Medidas preventivas são necessárias devido à natureza infecciosa de tecido humano vivo.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para a criação de culturas tridimensionais de tecido pulmonar.
- Facilitar o estudo de doenças pulmonares ex vivo.
- Permitir a análise da expressão gênica e proteica em tecido pulmonar humano.
Métodos Utilizados
- Preparação de amostras de tecido pulmonar utilizando agarose de ponto de fusão baixa.
- Corte preciso de seções pulmonares contendo agarose.
- Técnicas de imunomarcação para visualização da estrutura tecidual.
- Análise da expressão gênica e proteica utilizando PCR e western blotting.
Resultados Principais
- Indução de alterações semelhantes à fibrose em culturas de tecido pulmonar após tratamento com citocinas.
- Superexpressão dos genes de colágeno Tipo Um e fibronectina.
- Aumento nos níveis proteicos do marcador mesenquimal vimentina em amostras tratadas.
- Potencial para pesquisas futuras em pneumologia e farmacologia experimentais.
Conclusões
- Esta técnica aprimora a compreensão da biologia pulmonar.
- Oferece uma plataforma para estudos toxicológicos e farmacológicos.
- Pesquisas futuras podem se basear neste método para um melhor modelamento de doenças.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Culturas de tecido pulmonar humano tridimensionais derivadas de fatias pulmonares cortadas com precisão fornecem um modelo ex vivo fisiologicamente relevante para o estudo de mecanismos de doenças e respostas a fármacos na arquitetura tecidual humana nativa. Essa abordagem apoia a validação de alvos e a redução de riscos mecanicistas ao permitir a avaliação direta dos efeitos de compostos em amostras pulmonares doentes ou peritumorais provenientes de pacientes individuais. O modelo aumenta a confiança preditiva na avaliação pré-clínica ao preservar a diversidade celular, a composição da matriz extracelular e as propriedades biomecânicas essenciais para a relevância translacional.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas em tecido pulmonar humano intacto, com preservação da estrutura tridimensional e diversidade de tipos celulares.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao medir alterações induzidas por fármacos em biomarcadores relacionados à fibrose, como colágeno tipo I e fibronectina.
- Valor Científico: Facilita a elucidação de vias por meio da análise espaço-temporal dos primeiros mecanismos patológicos em tecido humano relevante para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor científico: Gera fragmentos padronizados e reprodutíveis de tecido adequados para triagem de compostos em placas de múltiplos poços.
- Valor operacional: Permite leituras quantitativas por imunofluorescência, qPCR e western blotting para análises de resposta à dose e curso temporal.
- Valor científico: Aumenta o rendimento de tecido a partir de amostras limitadas de pacientes por meio de punção de biópsia, melhorando a escalabilidade do ensaio e a capacidade de replicação.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela processos fibróticos específicos do ser humano em níveis subcelulares, utilizando alterações induzidas por citocinas que simulam fibrose em fatias pulmonares cortadas com precisão.
- Valor Operacional: Oferece um sistema relevante para a doença, útil para avaliar o engajamento de alvos e o mecanismo de ação em tecido humano antes de estudos in vivo.
- Valor Científico: Apoia o alinhamento de biomarcadores translacionais ao permitir a correlação entre respostas moleculares e resultados funcionais em nível tecidual.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação inicial da hipótese do alvo até a identificação de compostos líderes e a validação pré-clínica, permitindo refinamento iterativo com base nas respostas de tecidos humanos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao permitir a visualização da estrutura alveolar e das respostas celulares em explantes pulmonares humanos intactos.
- Triagem: Fornece fragmentos de tecido prontos para ensaio, com tamanho e viabilidade consistentes, para triagem de bibliotecas de compostos em formatos de 96 poços.
- Análises: Permite leituras multiplexadas, incluindo expressão gênica (qPCR), níveis de proteínas (western blot) e imagem estrutural (imunofluorescência), para comparar condições de tratamento.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas e trabalhos pré-clínicos ao manter a complexidade do tecido humano e permitir análises de resposta estratificada por paciente.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para modelagem de doenças pulmonares que pode ser aplicada em múltiplos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir lacunas de tradução entre espécies mediante o uso direto de tecido pulmonar humano.
- Valor Operacional: Padroniza o preparo do tecido por meio da inclusão em agarose e corte de precisão, melhorando a reprodutibilidade entre usuários e locais.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avanço ou interrupção do desenvolvimento ao fornecer sinais precoces de eficácia e toxicidade baseados em tecido humano.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em efeitos mecanicistas em amostras humanas de pulmão doente ou peritumorais.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência no manuseio de tecidos humanos, técnica estéril e seccionamento com vibrátomo.
- Depende do acesso a tecido pulmonar ressecado cirurgicamente e agarose de ponto de fusão baixo para preservação estrutural.
- Necessita condições padronizadas de cultura e controles de contaminação devido ao potencial infeccioso do tecido humano viável.
- Envolve a otimização do tamanho do punch da biópsia e da técnica de rotação para garantir uniformidade das amostras entre réplicas.
- Limitado pela janela de viabilidade do tecido, exigindo processamento oportuno e início da cultura após a ressecção.
