Name: Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Aprenda a analisar vias de sinalização em células mieloides usando sistemas humanos e murinos. Este método utiliza preparações de células primárias e compostos de referência validados para elucidar mecanismos de sinalização imunológica.

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Agradecemos a Elsevier para sua autorização (matrícula 4334770630127) reproduzir aqui Figura 2A de Unterreiner et al . (2017).

Experimentos foram conduzidos de acordo com as diretrizes e normas do Comitê de ética pesquisa humana da Novartis.
1. preparação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de casacos Buffy humanas
Nota: Recebemos a buffy casacos de voluntários saudáveis, um dia após a coleta, em sacos de 50 mL. Foram fornecidas sob consentimento informado e coletadas através do Interregionale Blutspende Schweizeriches Rotes Kreuz. Lidamos com eles usando o procedimento abaixo, à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário.
<ol><li>Prepare um par limpo e estéril de tesoura e um copo de 1 L com um saco de plástico (sob um fluxo de lâmina).</li>
	<li>Transferir o buffy coat para o copo e com cuidado, abra-o com a tesoura.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta de 25 mL, adicionar 100 mL de ácido tampão fosfato salina tampão/etilenodiaminotetracético (EDTA/PBS: pH de 1X PBS 7,4 contendo não CaCl2 e não MgCl2, suplementado com 2 mM pH EDTA 8.0). Nota: Usando a mesma pipeta e depois lentamente pipetagem a solução acima e para baixo, dispense 25 mL do revestimento buffy diluído em 6 tubos de centrifuga conico de pré-preenchido com 15 mL de gradiente de densidade baseados em polissacarídeo de 50 mL.</li>
	<li>Centrífuga 20 min a 800 x g com aceleração moderada (fixado em 4 de 9) e sem freio para permitir a separação de células com base em suas densidades. Nota: Após a centrifugação, três camadas serão visíveis; uma pelota contendo hemácias e granulócitos, uma camada superior feita de plasma e no meio de um anel branco contendo células mononucleares de sangue periférico (PBMC).</li>
	<li>Colha o anel PBMC usando uma pipeta de 10 mL e transferência para novos tubos de 50 mL. Nota: Dois ou três tubos de 50 mL são normalmente exigidos por demão buffy. Nesta fase, alguns plasma provável contamina os PBMCs coletados, que devem ter nenhum impacto sobre as etapas subsequentes de enriquecimento.</li>
	<li>Superior a 50 mL cada tubo utilizando PBS/EDTA e proceder a três lavagens sucessivas com diminuindo o tempo de centrifugação e velocidade (15 min 520 x g, 10 min a 330 x g, 8 min a 150 x g). Nota: A cada passo, o sobrenadante é coado em um recipiente de resíduos líquido e o centrifugado é resuspended em 50 mL de PBS/EDTA (Pelotas podem ser colocados em pool após a primeira lavagem).</li>
	<li>Após a lavagem final, resuspenda o pellet em 25 mL de um tampão de Lise gelada (consulte a Tabela de materiais) para lisar os glóbulos vermelhos por pressão osmótica.</li>
	<li>Incubar até que a solução torna-se claro (≤ 5 min à temperatura ambiente).</li>
	<li>Pare a reação adicionando 25 mL de tampão de separação (PBS 1 x pH 7,4 contendo não CaCl2 e não MgCl2, suplementado com 2% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS) e 1 mM EDTA pH 8.0).</li>
	<li>Lave mais uma vez a 150 x g por 8 min. Nota: Nesta fase PBMCs podem ser usados como uma população em massa (consulte a etapa 3: tratamentos PBMCs e monócitos e condições estimulatórios) ou transformadas para enriquecimento de monócitos (consulte a etapa 2: preparação de monócitos de PBMC), ou congelado para baixo para uso subsequente (consulte a etapa 5: Monócitos e PBMCs procedimentos de congelamento/descongelamento).</li>
</ol>2. preparação de monócitos de PBMC
<ol><li>Ressuspender os PBMCs obtidos no passo 1.10 no buffer de separação e contá-las para alcançar 5 x 107células/mL.</li>
	<li>Transferi a suspensão de células para um tubo de centrifuga conico de 14 mL com tampa.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de anticorpo de enriquecimento monócito cocktail por mL de suspensão de células, vórtice e incube 10 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de grânulos de enriquecimento monócito de células por mL. Nota: Os grânulos devem ser completamente vortexed para garantir a homogeneidade da suspensão.</li>
	<li>Depois de adicionar as contas, em breve levar a suspensão de célula e incubar 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Lave a parte superior do tubo com buffer de separação até que o tubo está cheio até 10 mL.</li>
	<li>Misture lentamente a solução pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Coloca o tubo sem tampa em um ímã de separação.</li>
	<li>Incube durante 2,5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Despeje lentamente em um tubo de centrifuga conico de 15 mL.</li>
	<li>Nesta fase, use os monócitos diretamente (consulte a etapa 3: tratamentos PBMCs e monócitos e condições estimulatórios) ou diferenciá-los em euangelinhos Monocyte-derivado Dendritic Cells (iMoDCs) (consulte a etapa 4), ou congelá-los para baixo para uso subsequente (Veja passo 5).</li>
</ol>3. PBMCs e tratamentos de monócitos e estimulatórios condições
<ol><li>Contar as células e diluí-los em meio de cultura (meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 10% FBS 1 mM piruvato de sódio + 100 U/mL Estreptomicina de penicilina (Pen/Strep) + β-Mercaptoetanol de 5 µM), até 1,25 x 104 células/poço.</li>
	<li>Distribua 30 µ l de suspensão de células por poço de uma placa de 384.</li>
	<li>Adicionar 15 µ l de 4 x soluções concentradas de composto e pre-incubar durante 1 h a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Adicionar lipopolissacarídeo (LPS) a uma concentração final de 10 ng/mL, ou empobrecido ZnPPIX (DZ) a uma concentração final de 100 µ g/mL ou manter-se em simples meio.</li>
	<li>Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Leve 10 µ l do sobrenadante para medir níveis de TNF-a secretada (consulte a etapa 7: medições de citocinas e viabilidade).</li>
</ol>4. monócitos diferenciação em iMoDCs e estimulatórios condições
<ol><li>Contagem de monócitos (enriquecidos no passo 2) e centrifugar a suspensão de eritrócitos a 520 x g por 5 min.</li>
	<li>Pipetar fora o sobrenadante e adicionar o meio de cultura (RPMI + 10% FBS para obter uma suspensão de célula final de 0,4 x 106 células/mL.</li>
	<li>Adicione 80 ng/mL recombinante humano IL-4 + 100 ng/mL GM-CSF.</li>
	<li>Dispense a 5 mL de suspensão de células por poço em uma placa de 6.</li>
	<li>Incube durante 7 dias a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>No dia 7, colha células pipetando suavemente para evitar a sua ativação.</li>
	<li>Centrifugar a 520 x g por 5 min.</li>
	<li>Aspirado de vácuo e ressuspender em 50 mL de meio de cultura sem fatores de crescimento.</li>
	<li>Centrifugar a 520 x g por 5 min e ressuspender a 1 x 106 células/mL em meio de cultura.</li>
	<li>Dispense 100 µ l de suspensão de células (105 células) por bem de uma placa de fundo chato de 96 poços.</li>
	<li>Pre-incubate por 1 h a 37 ° C, após a adição de 50 µ l de 4 x concentrado compostas soluções, preparadas como descrito no passo 8: preparação de compostos.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de estímulos (4 x concentrado), preparado como descrito no passo 9.</li>
	<li>Incubar 24 horas a 37 ° C.</li>
	<li>Misture cada poço e transferência de células e o sobrenadante (SN) em uma placa de V-fundo de 96 poços.</li>
	<li>Spin para baixo a 475 x g por 5 min.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para um novo prato fundo plano 96 poços, selar e congelar a-20 ° C até utilização posterior.</li>
</ol>5. monócitos e procedimentos de congelamento/descongelamento PBMCs
<ol><li>
Congelamento
	<ol>
<li>Spin para baixo PBMC ou monócitos preparações da pilha a 520 x g por 5 min.</li>
		<li>Vácuo, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em congelamento médio a 1 x 107 células/mL.</li>
		<li>Diluir 1 mL de suspensão de células em cryotubes, transferir os tubos para um dispositivo de resfriamento específico (veja a tabela dos materiais) e coloque-a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Descongelamento
	<ol>
<li>Descongelar o criotubo e rapidamente transferir seu conteúdo para um tubo de centrifuga conico de 15 mL contendo 9 mL de meio de cultura.</li>
		<li>Centrifugar a 520 x g por 5 min.</li>
		<li>Aspirador de aspirado de sobrenadante e ressuspender células em 5 mL de meio de cultura. Células estão agora prontas para mais processamento experimental.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Mouse baço células preparação e tratamento
Nota: Realizamos sacrifícios de animais, de acordo com as diretrizes e normas da organização de bem-estar Animal Novartis. Estudos foram aprovados pelo Comitê de ética da autoridade governamental regional (Kantonales Veterinäramt der Stadt Basel). Sacrificamos animais por excesso de exposição de isoflurano, com todos os esforços para minimizar o sofrimento.
<ol><li>Colheita do baço e dissociar o tecido usando um tubo equipado com um dispositivo de moedor de tecido mecânico e preenchido com 5 mL de meio RPMI frio.</li>
	<li>Use o programa de baço da máquina dissociação para moer os órgãos.</li>
	<li>Filtre as células através de um filtro de célula de nylon 100mm.</li>
	<li>Transferi a suspensão em tubos de 50 mL e centrifugar a 4 ° C por 10 min a 320 x g.</li>
	<li>Vácuo, aspirar o sobrenadante, Ressuspender as células em 3 mL de tampão de Lise gelada e incube por ≤ 2 min no gelo.</li>
	<li>Pare lise adicionando 7 mL de meio RPMI.</li>
	<li>Filtrar novamente através de um filtro de célula de nylon µm 100.</li>
	<li>Spin para baixo a suspensão de células a 330 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
	<li>Aspirador de aspirado de sobrenadante e ressuspender as células em 11 x 106 células/mL em meio completo (RPMI suplementado com 10% FBS, 100 U/mL caneta/etapa e β-Mercaptoetanol de 5 µM).</li>
	<li>Placa 1 x 106 células/poço (90 µ l) em uma placa de 96 poços (fundo plano).</li>
	<li>Adicionar 5 µ l de 20 x concentrado composta solução previamente diluída em meio RPMI conforme descrito no passo 8.3: diluição Serial para células de baço murino.</li>
	<li>Incube durante 30 min a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Adicione 5 µ l de 20 x concentrado DZ (concentração final de 30 µ g/mL) ou 20 x concentrado LPS + IFN-g (TLR-4) (concentração final de 1 µM LPS e 10 ng/mL IFN-g).</li>
	<li>Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
	<li>Centrifugar a 330 x g por 10 min.</li>
	<li>Sobrenadantes em novas placas de transferência, selar e congelar a-20 ° C até utilização posterior.</li>
</ol>7. citocinas e medições de viabilidade
<ol><li>
Medição humana de TNF-a por HTRF (homogênea tempo resolvido fluorescência) Nota: O protocolo seguido as recomendações do fornecedor, brevemente resumidas a seguir.<ol>
<li>Misturar 1 volume de reagente reconstituído (anti-TNF-por-cryptate e anti-TNF-a-XL665) com 19 volumes de tampão de reconstituição (50mm tampão fosfato pH 7,0, 0,8 M de fluoreto de potássio (KF), 0,2% albumina de soro bovino (BSA)).</li>
		<li>Misture as duas soluções ready-to-use anticorpo 1:1 antes de dispensar os reagentes.</li>
		<li>Dispense 10 µ l de sobrenadantes de passo 3.6 em chapas de 384-poço brancos.</li>
		<li>Dispense 10 µ l da mistura anticorpo.</li>
		<li>Cubra o prato com um aferidor e incubar a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Leia a placa em um leitor de microplacas (50 – 200 flash).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medição de IL-23 humana por HTRF (homogênea tempo resolvido fluorescência) Nota: O protocolo seguido as recomendações do fornecedor, brevemente resumidas a seguir.<ol>
<li>Misture um volume de reagente reconstituído (anti-IL-23-cryptate-anticorpo e anti-IL-23 D2-anticorpo) com 19 volumes de tampão de deteção #3.</li>
		<li>Misture as duas soluções ready-to-use anticorpo 1:1 antes de dispensar os reagentes.</li>
		<li>Dispense 10 µ l de sobrenadantes de passo 3.6 em chapas de 384-poço brancos.</li>
		<li>Dispense 10 µ l da mistura anticorpo.</li>
		<li>Cubra o prato com um aferidor e incubar a 4 ° C durante a noite.</li>
		<li>Leia a placa em um leitor de microplacas (flash de 50 – 200 nm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Humano IL-6, IL-8, IL-1 β e medições de TNF-α por eletroquimioluminescência Nota: Todas as amostras foram diluídas em 1/150 em diluente 2 (primeira diluição: 10 µ l em 150 µ l e, em seguida, 20 µ l de 180 µ l). O protocolo seguido as recomendações do fornecedor:<ol>
<li>Dilua as amostras e padrão em diluente 2.</li>
		<li>Proceda à diluição da norma em diluente 2 usando uma diluição de série dobra de 1/4.</li>
		<li>Placas de lavar três vezes com tampão de lavagem.</li>
		<li>Dispense a 50 µ l de norma por alvéolo ou amostras.</li>
		<li>Incube durante 2 h à temperatura ambiente sob agitação.</li>
		<li>Lavar a placa quatro vezes com PBS + 0,05% polissorbato 20.</li>
		<li>Adicione 25 µ l de anticorpo de detecção (60 µ l de cada anticorpo para final 3 mL) no diluente de 3.</li>
		<li>Incube durante 2 h à temperatura ambiente sob agitação.</li>
		<li>Lavar a placa quatro vezes com PBS + 0,05% polissorbato 20.</li>
		<li>Evitando bolhas, adicionar 150 µ l por alvéolo do buffer de leitura (buffer de Tris contendo tripropilamina, diluídas 2x em ddH20) como um reagente co para a geração de luz em imunoensaios eletroquimioluminescência.</li>
		<li>Leia a placa (sem atraso) em um leitor de placa multiplex.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mouse TNF-a medição por ELISA seguindo o protocolo do fornecedor
	<ol>
<li>Dilua o sobrenadante 1:1 em diluente de ensaio (pronto para usar tampão proteicos).<ol>
<li>Prepare reagentes, amostras e diluições padrão conforme descrito no kit. Adicione 50 μL de diluente de ensaio para cada poço.</li>
			<li>Adicione 50 μL de amostra por alvéolo, controle ou padrão.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Misture suavemente tocando a moldura da placa por 1 min.</li>
		<li>Cubra com a fita adesiva fornecida e incubar durante 2 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspire cada bem e lave com 400 μL/poço (repetir este passo cinco vezes no total).</li>
		<li>Após a lavagem final, remova qualquer restantes tampão de lavagem por aspiração.</li>
		<li>Inverter a placa e borre contra toalhas de papel limpo.</li>
		<li>Adicione 100 μL de conjugado de rato TNF-α em cada poço. Cobrir com uma nova tira adesiva.</li>
		<li>Incube durante 2 h à temperatura ambiente.</li>
		<li>Repita a aspiração/lavagem como na etapa 7.4.4.</li>
		<li>Adicionar 100 μL de solução de substrato a cada poço e incube por 30 minutos em temperatura ambiente protegido da luz.</li>
		<li>Adicione 100 μL de solução de ácido clorídrico diluído (solução de paragem) a cada poço. Bata levemente a placa para assegurar uma mistura completa.</li>
		<li>Medir a densidade óptica a 450 nm (com o comprimento de onda de correção fixado em 560 nm) usando um leitor de microplacas (para ser feito dentro de 30 min).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Viabilidade celular
	<ol>
<li>Depois de remover sobrenadantes de preparações PBMC ou monócitos, avalie a viabilidade celular usando um pronto para usar a solução de resazurina (indicador de oxidação-redução) adicionada diretamente à suspensão de células para a concentração final de 10%.</li>
		<li>Incube durante 1 a 2 h a 37 ° C, 5% de CO2.</li>
		<li>Lê a fluorescência em 590 nm (excitação 540 nm), utilizando um leitor de microplacas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. preparação de compostos
<ol><li>
Diluição serial para iMoDCs
	<ol>
<li>Diluir a solução estoque MIT-827 (10mm em dimetilsulfóxido (DMSO) em média para chegar a 8 µM de uma só vez (4 x concentrada).</li>
		<li>Realize uma diluição serial da seis-etapa 1:5, usando médio + 0,08% DMSO. Use o mesmo meio de + 0,08% solução de DMSO para a condição do veículo (não composto).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dose única de teste para iMoDCs
	<ol>
<li>Dilua as soluções estoque MIT-827, AFN700 e Cpd11 em meio para chegar a 4 µM de uma só vez (4 x concentrada).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluição serial para células de baço murino
	<ol>
<li>Dilua uma solução de MIT-827 de 10 µM (obtido de uma solução stock de 10mm, seguindo uma diluição vá em média) de 0,01 µM, com uma concentração final de DMSO de 0,1%.</li>
		<li>Para as etapas de diluição, tome 2 µ l de cada diluição, adicione 38 µ l RPMI e pipetar 5 µ l para o poço. Nota: Todos os tratamentos são realizados em triplicado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. estímulos preparação
<ol><li>
ZnPPIX empobrecido (DZ)
	<ol>
<li>Adicionar 2 mL de água livre de endotoxinas estéril a 10 mg de DZ.</li>
		<li>Vórtice para homogeneizar a solução-mãe, vórtice também prévia de cada utilização.</li>
		<li>Alíquotas alíquotas de solução e loja a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trealose-6,6-dibehenate (TDB)
	<ol>
<li>Adicione 100 µ l de DMSO TDB, calor de 60 ° C em um banho de água durante 15-30 s de 1 mg.</li>
		<li>Vórtice e imediatamente adicionar 900 µ l de PBS estéril, vórtice novamente.</li>
		<li>Aquecer durante 10 a 15 min a 60 ° C e homogeneizar por prévio num Vortex de cada utilização.</li>
		<li>Manter a solução a 4 ° C.</li>
		<li>Realize diluições em série e dose única preparação quanto o composto do MIT-827. Nota: Porque TDB precisa ser preparado em DMSO, uma concentração de DMSO final 1% está presente durante a estimulação da célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Thoma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+profiling+of+a+selective+and+efficacious+syk+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery and profiling of a selective and efficacious syk inhibitor.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (4), 1950-1963 (2015).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste trabalho, usamos configurações simples experimentais para estudar a sinalização percursos em humanos e inata pilhas do rato e interrogar sua dependência na função proteolítica MALT1. Expansão no anterior trabalho11, nosso estudo mostrou que MALT1 paracaspase atividade controla tipo C lectin como receptor induzida produção de citocinas, incluindo TNF-α. Em contraste, o TLR 4-induzida por TNF-α foi independente de MALT1 em ambas as espécies. Coletivamente, estes dados corroboram a contribuição...

A atividade de paracaspase de MALT1 (proteína associada a Mucosa tecido linfoide linfoma translocação 1) foi revelada em 20081,2. Desde então, vários estudos têm relatado sua contribuição fundamental para respostas de receptor do antígeno em linfócitos. Modelos genéticos no mouse, bem como dados de farmacologia suportam um papel-chave em células T, de auto-imunidade dependente de células T e células B linfoma configurações3,4. Em linfócitos, MALT1 paracaspase ativação ocorre após a montagem de um CARD11-BCL10-MALT1 complexo5, que é acionado por sinalização proximal do antigénio-receptor a jusante do receptor de células T ou B. Também há ampla evidência de que um complexo CARD9-BCL10-MALT1 semelhante é importante para a propagação de sinais a jusante dos receptores do tipo lectina tipo C (CLLR), por exemplo,, Dectin-1, Dectin-2 e MINCLE em mieloide células6,7. Dectin-1 tem sido particularmente bem estudado, pois esta via é fundamental para a defesa do hospedeiro contra infecções fúngicas8,9. Implicação de MALT1 em vias de receptores do tipo Toll (TLR), no entanto, manteve-se controversa10. Evidências recentes em células mieloides humanas descartaram um papel direto para a atividade de paracaspase MALT1 na regulação do TNF-produção a jusante de TLR-411.
No presente trabalho, costumávamos várias configurações experimentais e condições estimulatórios em humanos e pilhas myeloid rato sonda inatas vias de sinalização, baseando-se na ferramenta farmacológica específica inibidores e medição da produção de citocinas.

<table><tbody><tr><td>100 &micro; m filtro de células de nylon</td><td>Sigma</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>14 mL Tubo Falcon</td><td>BD Falcon</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo Falcon</td><td></td><td>Falcon 352090</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo Falcon</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 poços</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo plano de 96 poços, com tampa de baixa evaporação</td><td>Costar</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>96 poços de placa de fundo em V</td><td>Costar</td><td>734-1798</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de amônio - NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Diluente de ensaio RD1-W ELISA</td><td>R& D</td><td>895038</td><td>Diluente</td></tr> de ensaio <tr><td>Microplaca de cultura de células, 384 poços,</td><td>preto Greiner</td><td>781986</td><td></td></tr><tr><td>Depleted Zymosan</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-dzn</td><td>agora: tlrl-zyd</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Sigma</td><td></td><td>D2650</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>EDTA-Na2</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético di-hidratado</td></tr><tr><td>ELISA muTNF-&alfa;</td><td>R& D</td><td>SMTA00</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C tubos</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS dissociador</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Novartis-Soro</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>bovino fetal inativado por calor</td><td>Gibco</td><td>10082</td><td>FBS</td></tr><tr><td>HTRF para IL-23</td><td>CisBio</td><td>62HIL23PEG</td><td></td></tr><tr><td>HTRF para TNF-&alfa;</td><td>Tampão de reconstituição CisBio</td><td>62TNFPEC</td><td></td></tr><tr><td>HTRF Tampão de fosfato</td><td>CisBio</td><td>62RB3RDE</td><td>50mM, pH 7,0, 0,8M KF, 0,2% BSA</td></tr><tr><td>IFN-&gama;</td><td>R& D</td><td>L4516</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Novartis-Isoflurano</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Abbott</td><td>Forene</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L4391</td><td>LPS usado em amostras humanas</td></tr><tr><td>Lipopolissacarídeos</td><td>Sigma</td><td>L4516</td><td>LPS usado em amostras murinas</td></tr><tr><td>Tampão de lise</td><td>feito por si mesmo</td> <td>155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 1 mM EDTA, pH 7,4</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca</td><td>Magnet Stemcell</td><td>18001</td><td></td></tr>, kit de enriquecimento de monócitos <tr><td>Greiner</td><td>784075</td><td></td><td>branco de 384</td></tr><tr><td>poços</td><td>Stemcell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Mr. Frosty Cryo 1&deg; C Recipiente de congelamento</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td>dispositivo de resfriamento (contendo Propanol-2)</td></tr> <tr><td>PBS 1x pH 7,4 [-] CaCl2 [-] MgCl2</td><td>Gibco</td><td>10010</td> Penicilina / estreptomicina <td>salina tamponada com fosfato</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Pen / Strep</td></tr><tr><td>Bicarbonato de potássio - KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P9144</td><td></td></tr><tr><td>PrestoBlue</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td>Solução de resazurina para avaliação de viabilidade</td></tr><tr><td>Propanol-2</td><td>Merck</td><td>1.09634</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de leitura</td><td>MesoScale Discovery</td><td>R92TC-3</td><td>Tampão à base de Tris contendo tripropilamina</td></tr><tr><td>Meio de congelamento de cultura de células de recuperação</td><td>Gibco</td><td>12648-010</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) com Glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870</td><td>+ 10% FBS para iMoDCs + 10% FBS + 1 mM de piruvato de sódio + 100 U/mL de caneta/estreptococo + 5 &micro; M &beta;-mercaptoetanol para PBMCs e monócitos humanos + 10% FBS + Pen/Strep + 5 &micro; M &beta;-mercaptoetanol para esplenócitos murinos</td></tr><tr><td>Tampão de separação</td><td>Self-made-PBS</td><td></td> <td>pH 7,4 + 2% FBS + 1 mM EDTA pH 8,0</td></tr><tr><td>Piruvato de sódio</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Trealose-6,6-dibehenato</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-tdb</td><td>TDB</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td>Polissorbato 20</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>15675</td><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td></tr><tr><td>Selante Viewseal</td><td>Greiner BioOne</td><td>676070</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Painel Proinflamatório 1 Kit Humano</td><td>MesoScale Discovery</td><td>K15049D</td><td>ensaio multiplex eletroquimioluminescente (IL-1&beta;, TNF-&alfa;, IL-6, IL-8)</td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr></tbody></table>

mieloide inata sinalização via regulamento por malt1 paracaspase atividade

Myeloid Innate Signaling Pathway Regulation by MALT1 Paracaspase Activity

Além de sua função nas células linfoides, que foi abordada por numerosos estudos, o paracaspase MALT1 também desempenha um papel importante nas células inatas a jusante dos receptores de reconhecimento padrão. Mais bem estudados são os membros da família de receptores de lectina tipo C-tipo Dectin-1 e Dectin-2 que induzem um dependente SYK - e CARD9-sinalização em cascata, levando a ativação do NF-κB, em uma maneira MALT1-dependente. Por outro lado, receptores do tipo Toll (TLR), como o TLR-4, propaga a ativação de NF-κB, mas sinal através de uma cascata de MYD88/IRAK-dependente. No entanto, se MALT1 possam contribuir para a sinalização de TLR-4 manteve-se pouco clara. Evidências recentes com MIT-827, um inibidor potente e seletivo da MALT1 paracaspase atividade, indicam que o TNF-produção a jusante de TLR-4 em células mieloides humanas é independente de MALT1, ao contrário do TNF-produção a jusante de Dectin-1, que é MALT1 dependente. Aqui, abordámos o envolvimento seletivo de MALT1 em reconhecimento de padrões, sentindo-se ainda mais, usando uma variedade de humanos e rato celular, produtos de higiene e estimulação de Dectin-1, MINCLE ou TLR-4 vias. Nós também forneceu insights adicionais explorando citocinas TNF-e comparando MIT-827 para um inibidor SYK (Cpd11) e um inibidor IKK (AFN700). Coletivamente, os dados fornecidos ainda mais evidência para a dependência de MALT1 dos receptores de lectina tipo C-tipo — sinalização em contrapartida para sinalização de TLR.

Em células mieloides, MALT1 transmitem sinais de ativação a jusante dos vários receptores do tipo lectina tipo C, tais como Dectin-1, Dectin-2 e MINCLE6. Essas vias dependem de receptores de (bainha) ITAM contendo motivo (por exemplo,, Dectin-1) ou receptores de co ITAM contendo motivo (por exemplo,, FcRγ, Dectin-2 e MINCLE) que recrutar e ativar a quinase SYK (Figura 1). Isto leva à ativação de uma proteína quinase C...

MALT1 regula a imunidade inata, mas como isso ocorre permanece indefinida. Usamos o inibidor seletivo de paracaspase MALT1 MIT-827 para desvendar a contribuição da MALT1 para sinalização inata, a jusante dos receptores Toll-like ou tipo C do tipo lectina, demonstrando que MALT1 regula a produção de citocinas mieloides e a jusante dos receptores do tipo lectina do tipo C, seletivamente.

Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade

Besides its function in lymphoid cells, which has been addressed by numerous studies, the paracaspase MALT1 also plays an important role in innate cells ...

Assim, o objetivo do método em nosso manuscrito é fornecer análise comparativa de vias de sinalização em células mielóides usando sistemas humanos e de camundongos. Ele ajuda a definir qual caminho de sinalização está envolvido a jusante de receptores de reconhecimento de padrão selecionados. Portanto, este método é simples de implementar.Conta com preparações celulares primárias e compostos de referência validados, o que é essencial para a elucidação de mecanismos de sinalização. Demonstrando o procedimento serão Ratiba Touil e Adeline Unterreiner, respectivamente cientista e pesquisador associado em nosso grupo. Em um capô de fluxo laminar, um par de tesouras estéreis, um béquer de um litro e um saco plástico.Coloque o casaco de polimento previamente obtido no béquer e use a tesoura para abri-la cuidadosamente. Utilizando uma pipeta de 25 mm adicione 100 ml de PBS suplementado com 2 mililitros de EDTA. Misture lentamente pipetting para cima e para baixo.E então transfira 25 ml do casaco de buffy diluído em seis tubos de centrífuga cônica de 50 ml que foram pré-preenchidos com 15 ml de gradiente de densidade à base de polissacarídeo. Centrifugar os tubos por 20 minutos a 800 g com aceleração moderada sem a ruptura para permitir a separação das células com base em suas densidades. Após a centrifugação três camadas serão visíveis, uma pelota contendo glóbulos vermelhos e granulócitos, uma camada superior feita de plasma, e um anel branco contendo adegas mononucleares de sangue periféricos.Use uma pipeta de 10 ml para colher os anéis PBMC e transferi-los para um novo tubo de 50 ml. Cubra com PBS e EDTA. Realize três lavagens sucessivas com diminuição do tempo de centrifugação e velocidade, conforme descrito no protocolo de texto.Após a lavagem final, resuspenque a pelota em 25 ml de tampão de lise gelada para lise os glóbulos vermelhos por pressão osmótica. Incubar a solução à temperatura ambiente até ficar clara. Em seguida, adicione 25 ml de tampão de separação para parar a reação.Centrifugar a 150 g por oito minutos para lavar a solução. Despeje o supernatante e resuspense a pelota com tampão de separação. Depois de contar as células, dilui-as em meio de cultura até 12.500 células por poço.Distribua 30 ml desta suspensão celular em cada poço de uma placa de 384 poços. Em seguida, adicione 15 microliters de quatro vezes soluções compostas concentradas a cada poço e pré-insinuque a placa a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Se desejar, adicione LPS à concentração final de 1 ng por ml ou zymosan esgotado a uma concentração final de 100 mcg por ml.Em seguida, incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, pegue 10 microliters do supernante para medir os níveis alfa TNF secretos. Para iniciar a diluição seriada, diluir a solução de estoque MLT-827 com média para atingir uma concentração de 8 micromolar de uma só vez.Realize uma diluição serial de seis etapas 1:5 utilizando meio com DMSO de 0,08%. Para se preparar para testes de dose única, diluir o MLT-827, AFN700 e composto 11 soluções de estoque com média para atingir uma concentração de 4 micromolar de uma só vez. Primeiro, adicione 2 ml de água endotoxina estéril a 10 mg de Zymosan esgotado.Vórtice esta solução de estoque para homogeneizá-lo. Aliquot a solução e, em seguida, armazene as alíquotas a 20 graus Celsius. Neste estudo, pbmcs humanos e células de baço de rato são estimulados com zymosan esgotado, um agonista Dectin-1, ou lipopolysaccarídeo, um agonista TL4.A liberação alfa NTNF no supernante é medida após 20 horas. Tanto no ser humano quanto no mouse, o composto MLT-827 bloqueia seletivamente a produção alfa TNF impulsionada pela via Dectin-1, mas não pela via TLR4. Em monócitos estimulados com LPS, a produção de TNF alfa é quase completamente revogada pelo AFN700, mas não é sensível ao Cpd11, que é consistente com a dependência da via TLR4 na atividade NF-kappa B e sua independência na atividade sic.Em contraste, a produção alfa TNF impulsionada por Dectin-1 e MODCs mostra sensibilidade a MLT-827, AFN700 e Cpd11. Isso fornece mais evidências para o envolvimento de uma cascata de sinalização SIC CBM na via Dectin-1. A produção de BETA IL-1, IL-6 e IL-23 também é sensível aos três inibidores, indicando mecanismos regulatórios semelhantes ao TNF alfa.No entanto, o efeito limitado visto na produção do IL-8 sugere que esta citocina tem um mecanismo regulatório distinto. Elevar as concentrações de Trehalose-dibehenate acima de 50 mcg por ml leva à produção de TNF alfa, IL-6 e BETA-1, que dependiam da atividade paracaspase MALT1 de acordo com o efeito de bloqueio do MLT-827. Resultados semelhantes foram vistos ao desafiar os MODCs com concentrações crescentes de Zymosan esgotado para estimular o Dectin-1.Este método possibilitou mostrar que o paracaspase MALT1 regula seletivamente a sinalização do receptor tipo C lectina. É essencial usar compostos de referência bem caracterizados. Preste atenção ao procedimento para a diluição das soluções de estoque.Isso é fundamental para composto com solubilidade limitada.

myeloid-innate-signaling-pathway-regulation-malt1-paracaspase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O ensaio sialidase é uma abordagem simples técnica que irá elucidar mecanismo molecular romance (s) de sensores de TLR de infecções microbianas e envolvimento em doenças inflamatórias ao nível do receptor na superfície celular de macrófagos ao vivo.

Detecção de Atividade Neu1 sialidase em Regulação Toll-like receptor de ativação

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Monitoramento de Atividades de caspase-3 Clivadas e apoptose das células oligodendrogliais Imortalizado usando Live-célula Imaging and Cleaveable Fluorogênico-dye seguintes substratos de potássio induzida por despolarização da membrana

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Nós relatamos métodos para a caracterização da ruptura de membrana de plasma MLKL-mediada em necroptosis incluindo imagem de microscopia de viver-pilha convencional e confocal, varredura microscopia eletrônica e vinculação de lipídios NMR-baseado.

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Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

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O presente protocolo descreve dois métodos para medir a atividade da caspase através de um substrato fluorogênico usando citometria de fluxo ou um espectrofluorômetro.

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Aprenda a analisar vias de sinalização em células mieloides usando sistemas humanos e murinos. Este método utiliza preparações de células primárias e compostos de referência validados para elucidar mecanismos de sinalização imunológica.

Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade

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