Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas
10 de dezembro de 2018
Aqui descrevemos um protocolo para expressar proteínas em protoplastas usando o método de transformação mediada por PEG. O método fornece fácil expressão de proteínas de interesse e investigação eficiente de localização da proteína e o processo de importação para as várias condições experimentais in vivo.
Esse mistério pode ajudar a responder algumas perguntas no campo da biologia celular, como a entrada de proteínas em cloroplastos. A principal vantagem dessa tecnologia é que a entrada de proteínas em cloroplastos pode ser estudada em condições en vivo. Demonstrando o procedimento serão Junho Lee e Hyangju Kang, dois post outs do meu laboratório.
Para começar, colhiu tecidos de folhas intactas de plantas de duas semanas de idade de uma a duas placas B5. Use uma faca cirúrgica para colher as folhas e colocá-las em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de solução enzimácica. Coloque o tubo horizontalmente em um agitador rotativo e incubar com agitação suave a 22 graus Celsius no escuro por oito a 12 horas até que apenas petioles e hastes permaneçam na solução.
Após completar a incubação, filtre a solução enzimática contendo protoplastos liberados através de uma malha de tamanho de poros de 140 micrômetros em uma placa de Petri fresca. Em seguida, coloque cuidadosamente a solução em cima de 15 mililitros de solução de 21% de sacarose em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o tubo em um rotor de balde balançando a 98 gs por 10 minutos com as configurações de aceleração e desaceleração mais baixas.
Depois disso, use pipeta patura para remover cuidadosamente os protoplastos da camada superior contendo solução enzimeta e da interface entre a solução de enzimas e a solução de sacarose. Transfira esta solução para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 30 mililitros de solução W5 e inverta o tubo para misturar. Centrifugar o tubo a 51 gs por seis minutos.
Use uma pipeta para descartar este supernatante cuidadosamente sem perturbar os protoplastos na pelota. Adicione 25 mililitros de solução W5 e suspenda suavemente os protoplastos. Para estabilização, incubar em uma geladeira de quatro Celsius por um mínimo de uma hora.
Após a incubação de quatro graus Celsius, pelota os protoplastos completamente, centrifugando-os a 46 gs por dois minutos. Remova cuidadosamente o supernante completamente e adicione a solução MANG à pelota de protoplasto para alcançar cinco vezes dez a seis por mililitro. Use uma pipeta para adicionar 10 microgramas do DNA plasmá-lo e 300 microliters de solução de protoplasto a um tubo redondo de fundo redondo de 13 mililitros fresco.
Misture girando suavemente os tubos à mão e, em seguida, adicione imediatamente 300 microliters de solução recém-preparada de 40% PEG. Misture completamente inclinando o tubo quase horizontalmente e girando-o suavemente várias vezes à mão. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, adicione um mililitro da solução W5 e misture completamente girando suavemente o tubo manualmente como anteriormente. Incubar a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente. Repita mais duas vezes com a adição de primeiro 1,5 mililitro e depois dois mililitros de W5 e após a adição final e mistura, incubar por 30 minutos.
Centrifugar o tubo a 46 gs por quatro minutos e, em seguida, descartar o supernatante. Adicione dois mililitros de solução W5 à pelota e misture suavemente, mas completamente, da mesma forma que anteriormente. Incubar a 22 graus Celsius em uma câmara escura por 18 horas.
Para analisar a importação de proteínas utilizando microscopia florescence, use uma pipeta com ponta aparada para colocar 10 microlitros da solução de protoplasto em um escorregador de vidro. Use um deslizamento de tampa para cobrir cuidadosamente a solução para evitar danificar os protoplastos. Coloque o slide no palco de um microscópio de fluorescência com um filtro de admissão de excitação que é definido para observar proteína fluorescente verde e autofluorescência de clorofila.
Use uma câmera de dispositivo de casal de carga resfriada para capturar imagens e processá-las usando um software de edição de imagens para produzir imagens pseudocoloridas. Para extração total de proteínas e imunoblotting, remova um mililitro da solução protoplasta e misture o restante de um mililitro. Transfira esta solução de protoplasto para um tubo de centrífuga e centrífuga a 46 gs por quatro minutos.
Remova o supernatante após completar a centrifugação e adicione 80 microliters de tampão de desnaturação. Vórtice vigorosamente por cinco segundos. Adicione cinco tampão de amostra XDS, misture bem e ferva por 10 minutos para desnaturar.
Proceda com a página STS padrão e imunoblotting com anticorpo anti-GFP. RbcS e TGFT, uma construção de fusão codificando os 79 resíduos finais de aminoácidos terminais de RBCS contendo o peptídeo de trânsito fundido ao GFP, foram usados para estudar a importação de proteínas em cloroplastos por microscopia de floresnce e imunoblotação. Quando examinados pela microscopia florescence, sinais fluorescentes verdes da proteína alvo fundiram-se com os sinais fluorescentes vermelhos da autoflorescência da clorofila indicando importação de proteínas em cloroplastos.
Após isolar a proteína total, duas bandas proteicas são observadas no imunobloto, mostrando que uma proteína foi devidamente importada em cloroplastos. A faixa superior corresponde ao precursor de comprimento completo e à faixa inferior à forma processada após importação em cloroplastos. A quantidade da forma processada da proteína aumentou de forma dependente do tempo, sugerindo que a proteína é importada em cloroplastos.
Nesse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia celular explorarem a proteína cansativa ou a colheita de fios de membrana em Arabidopsis.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método de transformação mediada por PEG para expressar proteínas em protoplastos, permitindo o estudo da localização de proteínas e processos de importação in vivo. O protocolo é demonstrado por Junho Lee e Hyangju Kang, fornecendo insights sobre a entrada de proteínas em cloroplastos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Biologia Vegetal
- Expressão de Proteínas
Fundo
- Entender a localização de proteínas é crucial na biologia celular.
- Os cloroplastos desempenham um papel significativo no metabolismo das plantas.
- Estudar processos de importação de proteínas pode aumentar nosso conhecimento das funções celulares.
- A transformação mediada por PEG é uma técnica amplamente utilizada para protoplastos.
Propósito do Estudo
- Fornecer um protocolo para expressão de proteínas em protoplastos.
- Investigar a localização de proteínas sob condições in vivo.
- Facilitar a pesquisa sobre processos de importação de proteínas em cloroplastos.
Métodos Utilizados
- Colheita de tecidos foliares intactos de plantas com duas semanas de idade.
- Uso de uma faca cirúrgica para preparar amostras de folhas.
- Incubação de tecidos foliares em uma solução enzimática para isolamento de protoplastos.
- Emprego da transformação mediada por PEG para expressão de proteínas.
Principais Resultados
- Expressão bem-sucedida de proteínas em protoplastos.
- Investigação eficiente da localização de proteínas.
- Demonstração do protocolo por pesquisadores treinados.
- Insights sobre o processo de importação de proteínas em cloroplastos.
Conclusões
- O método de transformação mediada por PEG é eficaz para expressão de proteínas.
- Esta abordagem permite o estudo da dinâmica de proteínas in vivo.
- Pesquisas adicionais podem expandir as implicações da importação de proteínas em cloroplastos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding protein import mechanisms into chloroplasts provides foundational insights for target validation in plant-based bioproduction systems. This protoplast-based assay enables mechanistic de-risking of nuclear-encoded protein trafficking pathways, supporting predictive confidence in chloroplast engineering for therapeutic protein expression. The method offers a disease-relevant system for evaluating targeting signal functionality and import efficiency under near-physiological conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates chloroplast targeting signal functionality and import kinetics for nuclear-encoded proteins.
- Operational Value: Enables rapid assessment of protein localization using fluorescence microscopy and immunoblotting readouts.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of transit peptide efficacy and import machinery engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative immunoblot data showing precursor-to-processed protein conversion over time.
- Operational Value: Provides a reproducible protoplast isolation and transfection workflow using PEG-mediated transformation.
- Assay Readiness: Delivers dual-readout capability (fluorescence and immunoblot) for import validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage targeting signal analysis to preclinical evaluation of chloroplast-expressed biologics.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed protein accumulation results from proper import versus cytosolic aggregation.
- Predictive Confidence: Time-dependent increase in processed protein band correlates with functional import progression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where target validation precedes lead identification, particularly for chloroplast-directed expression systems. It supports screening campaigns by providing import-competent biological systems ready for effector protein testing. Analytics derived from the assay include fluorescence co-localization metrics and immunoblot-based quantification of import efficiency.
- Discovery Biology: Tests whether candidate proteins achieve proper subcellular localization via endogenous import pathways.
- Screening: Delivers standardized protoplast preparations suitable for high-content localization screening.
- Analytics: Enables quantification of import kinetics through precursor/product band ratios in immunoblots.
- Translational Research: Informs construct design for chloroplast expression vectors by validating transit peptide functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating multiple targeting signals across protein therapeutics candidates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein targeting hypotheses through direct visualization of import.
- Operational Value: Delivers a standardized, scalable protoplast isolation protocol with defined centrifugation and resuspension steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for chloroplast expression constructs by confirming import competence.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targeting sequences based on empirical import data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant protoplast isolation, PEG-mediated transfection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on enzymatic tissue digestion equipment, sucrose gradient centrifugation, and PEG solution preparation.
- Necessitates standardization of protoplast density (5×10⁶/mL) and DNA input (10 µg) for reproducible expression.
- Involves adaptation considerations when extending to non-Arabidopsis species or alternative chloroplast transformation systems.
- Practical limitations include protoplast viability window post-isolation and sensitivity to osmotic stress during PEG incubation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Protoplast Isolation
2:19
Protoplast Transformation using Polyethylene Glycol
3:53
Analysis of the Protein Import into Chloroplasts
5:10
Results: Fluorescence Microscopy and Immunoblotting to Analyze the Import of Proteins into Chloroplasts
6:07
Conclusion
