Name: プロトプ ラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学ぶPEG法によるプロトプラスト変換を用いた葉緑体へのタンパク質輸送のin vivo解析法。GFP標識と蛍光顕微鏡で局在を可視化し、植物細胞生物学の研究に応用できます。

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この仕事は農業科学技術開発プロジェクト号共同研究プログラムの支援で実施されました。PJ010953012018)、農村開発行政と科学省と ICT (第 2016R1E1A1A02922014)、によって資金を供給国立研究財団 (韓国) グラント韓国。

1. シロイヌナズナ植物の成長
<ol><li>1 L Gamborg B5 を準備 (B5) 媒体 B5 培地の 3.2 g を追加することによってビタミン、糖 20 g、0.5 g を脱イオン水の約 800 mL 2-(N-morpholino) エタン スルホン酸 (MES) の水酸化カリウム (KOH) と 5.7 を pH 調整など。追加より脱イオン水は 1 l. 追加 8 グラム、phytoagar、121 ° C で 15 分間オートクレーブに総量をもたらす</li>
	<li>55 ° C まで冷却し、クリーン ベンチでシャーレ (直径 9 cm、高さ 1.5 cm) に B5 培地の 20-25 mL を注ぐに許可します。2-3 日間板を乾燥、クリーンなラップでそれらをパック、使用するまで冷蔵庫に保管してください。</li>
	<li>シロイヌナズナを用いた滅菌 70% (v/v) エタノール 2-3 分間継続的に揺れによる遠心分離機管 (電子管) での 1 ml 種子上澄みを除去、1% (v/v) 次亜塩素酸ナトリウム溶液の 1 mL を追加し、2-3 分間継続的に振る準備 100-シャーレ 150 種。<ol>
<li>培養上清を削除し、1 mL の蒸留水と種子を洗浄します。4 x この手順を繰り返します。種子の発芽を同期する 3 日間の 4 ° C で滅菌の種子を置きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マイクロ ピペットを使用して B5 版に 100-150 種をまくし、サージカル テープでプレートをシールします。</li>
	<li>2 週間 100 µmol·m-2·s-1光強度があり、70% の相対湿度、温度 20 ° C で 16/8 h/明暗サイクルの成長部屋の植物を育てます。</li>
</ol>2. プラスミッドの準備
注: 変換の高純度プラスミッドが使用する必要があります。市販のプラスミド精製キットの使用をお勧めします。
<ol><li>プラスミッドの浄化 (赤血球-nt:GFP) DNA 分離キットを使用しています。DNA を集中するには、1.5 mL チューブのエタノール沈殿を行うし、蒸留水を 100 μ L の DNA ペレットを溶解します。260 分光光度計を使用してプラスミッドの濃度を決定する nm。最終的な集中にプラスミドを希釈 〜 2 μ g/μ L。 使用するまで-20 ° C でプラスミッドを維持。</li>
</ol>3. プロトプ ラストの単離
<ol><li>以下のソリューションを準備します。<ol>
<li>0.25% (w/v) macerozyme, 1.0% (w/v) セルラーゼ, 400 mM 8 mM 塩化カルシウム (CaCl2), 0.1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA)、D-マンニトールを含む酵素液を準備し、5 mM MES。島の 5.6 に pH を調整します。<ol>
<li>0.45 μ m 孔径のセルロース アセテート フィルター ユニットを使用して酵素液をフィルター処理します。50 mL の円錐管に-20 ° C で酵素液の分注 25 mL常温 (RT) 酵素液を解凍し、使用前によく混ぜます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>21% (w/v) ショ糖液 100 mL の脱イオン水のオートクレーブにショ糖の 21 g を溶解することによりソリューションを準備します。</li>
		<li>1.5 mM MES、5 mM グルコース 5 mM 塩化カリウム (KCl) 125 mM CaCl2154 mM 塩化ナトリウム (NaCl) の格納する W5 ソリューションを準備します。5.6 コとオートクレーブ ソリューションに pH を調整します。</li>
		<li>400 mM 15 mM 塩化マグネシウム (MgCl2)、D-マンニトールを格納する MaMg ソリューションを準備し、5 mM MES。5.6 コとオートクレーブ ソリューションに pH を調整します。</li>
		<li>止め釘の解決する 1 M D-マンニトールと 1 M 硝酸カルシウム貯蔵液を準備します。オートクレーブこれらのソリューション。</li>
	</ol>
</li>
	<li>収穫から 2 週間古い植物からそのまま葉組織 ~ メスと場所を使用して 1-2 B5 板収穫された葉の 50 mL のコニカル チューブ含む酵素溶液 25 mL。暗闇の中で穏やかな攪拌とシェーカーに水平に酵素ソリューションと葉組織を含む円錐管を配置します。葉組織の完全消化のための 8-12 時間かかります。</li>
	<li>孵化後 8-12 時間で 140 μ m 孔径メッシュを通して新鮮なペトリ皿に (葉組織からのプロトプ ラストを含む) 酵素液を注ぐ。慎重に 21% (w/v) ショ糖溶液 15 mL 上にプロトプ ラストを含む酵素液を層し、スイング バケツの回転子を最も低い加速度と減速度設定と 10 分のための 98 × g で遠心分離機します。</li>
	<li>パスツール ピペットを使用して、慎重にプロトプ ラスト最上位層 (酵素液) から間および転送インターフェイスで酵素液とショ糖液 W5 溶液 30 mL を含む 50 mL の円錐管に。6 分 51 x g でこのチューブを遠心します。この段階でプロトプ ラストは円錐管の下部にペレットになります。</li>
	<li>プロトプ ラストのペレットを乱すことがなく慎重にピペットを使用して上澄みを廃棄します。W5 溶液 25 mL を追加し、そっとプロトプ ラストを再懸濁します。安定化のため、少なくとも 1 時間のための 4 ° C 冷蔵庫でプロトプ ラスト ソリューションを孵化させなさい。</li>
</ol>4 ポリエチレング リコールを用いたプロトプ ラスト変換
<ol><li>準備 40 %50 mL の円錐管にペグの 8000 の 4 g、1 M のマンニトール溶液 4 mL、1 M Ca (3)2, 1 mL、1.8 mL の蒸留水を追加することによってソリューションをペグし、よく混ぜます。ペグを 40 %20-30 米位の電子レンジで加熱することによって溶かす常温冷却のための止め釘の解決。 注: 40% たてたびに止め釘の解決を準備する必要があります。プロトプ ラストは、完全に冷蔵庫で 4 ° C の孵化の間にペレットない場合、2 分 46 x g で材料を遠心します。</li>
	<li>上清を慎重に完全に削除し、MaMg ソリューションを屈する 5 x 106/mL の濃度原形質体の餌に追加します。 注: プロトプ ラストの数は、顕微鏡下で見る検定によって決定できます。</li>
	<li>場所 10 μ g のプラスミド DNA 各空 13 mL 丸底チューブとプロトプ ラスト ソリューション ピペットを使用しての 300 μ L を追加します。 注: ピペット チップの最後は切断する必要があります。プロトプ ラストをサンプリングするたびにプロトプ ラスト含有溶液はピペッティング プロトプ ラストの同じ数を各管に追加する前に再停止する必要があります。</li>
	<li>軽くチューブを回転させることによりプロトプ ラストでプラスミド DNA を混合し、すぐに 40% の 300 μ L を追加ピペットを使用して止め釘の解決。チューブを回転させることにより完全になく優しくをミックスし、部屋の温度で 30 分間インキュベートチューブをほぼ水平方向に傾き、数回回します。</li>
	<li>W5 溶液 1 mL を加え、同様の方法で手でチューブを回転させることにより優しくが完全を混ぜます。室温で 10 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>2 回以上で 1.5 mL と W5 溶液 2 mL それぞれこの手順を繰り返します。W5 ソリューションの最終的な付加の後で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>4 分破棄上清 46 x g で遠心し、W5 溶液 2 mL を追加します。優しく、完全に混ぜます。暗い区域の 22 ° C で孵化させなさい。</li>
</ol>5. 葉緑体への蛋白質輸送の解析
注: 後のプロトプ ラスト培養時間範囲は 8 から 24 h の PEG-仲介された変形。
<ol><li>
蛍光顕微鏡
	<ol>
<li>プロトプ ラストを損傷を避けるため coverslip でトリミングされたヒントと慎重にピペットを使用してスライド グラス上でプロトプ ラスト ソリューションの場所 10 μ L をカバーします。</li>
		<li>緑色蛍光タンパク質 (GFP) とクロロフィルの自家蛍光を観察するため励起/蛍光フィルターを搭載した蛍光顕微鏡のステージ上のスライドの場所を設定します。</li>
		<li>冷却電荷結合素子 (CCD) カメラと処理画像を擬似カラー画像を生成する画像編集ソフトウェアを使用してイメージをキャプチャします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
総蛋白質の抽出および免疫ブロット
	<ol>
<li>2.5% (w/v) ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) や 2% (v/v) 2-メルカプトエタノールを含む変性バッファーを準備します。 注: 輸送ペプチド抗 GFP 抗体を用いたイムノブロット分析を介して処理の程度を測定することにより葉緑体への蛋白質輸送を定量化することができます。</li>
		<li>遠心分離機管と 46 x g で 4 分間遠心にプロトプ ラストを転送します。</li>
		<li>上澄みを除去し、変性バッファーの 80 μ L を追加します。積極的に渦 5 s、SDS サンプルバッファー (250 mM Tris Cl (pH 6.8)、0.5 M DTT、10% (w/v) SDS、0.05% (w/v) ブロモフェノール ブルー、50% (v/v) グリセロール) × 5 を追加。よく混合し、10 分煮る。</li>
		<li>この蛋白質のサンプルを標準の SDS-PAGE および抗 GFP 抗体と免疫ブロット対象します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Jarvis, P., Lopez-Juez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+and+homeostasis+of+chloroplasts+and+other+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).</li>
<li>Neuhaus, H. E., Emes, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15012188">Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids.</a> Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).</li>
<li>Rolland, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biosynthetic+capacities+of+the+plastids+and+integration+between+cytoplasmic+and+chloroplast+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">The biosynthetic capacities of the plastids and integration between cytoplasmic and chloroplast processes.</a> Annual Review of Genetics. 46, 233-264 (2012).</li>
<li>Jarvis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+nucleus-encoded+proteins+to+chloroplasts+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Targeting of nucleus-encoded proteins to chloroplasts in plants.</a> New Phytologist. 179 (2), 257-285 (2008).</li>
<li>Li, H. M., Chiu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Transport+into+Chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein Transport into Chloroplasts.</a> Annual Review of Plant Biology. 61, 157-180 (2010).</li>
<li>Keegstra, K., Cline, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+import+and+routing+systems+of+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein import and routing systems of chloroplasts.</a> Plant Cell. 11 (4), 557-570 (1999).</li>
<li>Gasser, S. M., Daum, G., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Import+of+proteins+into+mitochondria.+Energy-dependent+uptake+of+precursors+by+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Import of proteins into mitochondria. Energy-dependent uptake of precursors by isolated mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 257 (21), 13034-13041 (1982).</li>
<li>Smeekens, S., Bauerle, C., Hageman, J., Keegstra, K., Weisbeek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transit+peptide+in+the+routing+of+precursors+toward+different+chloroplast+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the transit peptide in the routing of precursors toward different chloroplast compartments.</a> Cell. 46 (3), 365-375 (1986).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+nuclear-encoded+plastid+transit+peptides+contain+multiple+sequence+subgroups+with+distinctive+chloroplast-targeting+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple sequence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence motifs.</a> Plant Cell. 20 (6), 1603-1622 (2008).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+targeting+of+the+Arabidopsis+F1-ATPase+gamma-subunit+via+multiple+compensatory+and+synergistic+presequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial targeting of the Arabidopsis F1-ATPase gamma-subunit via multiple compensatory and synergistic presequence motifs.</a> Plant Cell. 24 (12), 5037-5057 (2012).</li>
<li>Jin, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+dynamin-like+protein%2C+ADL6%2C+is+involved+in+trafficking+from+the+trans-Golgi+network+to+the+central+vacuole+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A new dynamin-like protein, ADL6, is involved in trafficking from the trans-Golgi network to the central vacuole in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 13 (7), 1511-1526 (2001).</li>
<li>Lee, K. H., Kim, D. H., Lee, S. W., Kim, Z. H., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+import+experiments+in+protoplasts+reveal+the+importance+of+the+overall+context+but+not+specific+amino+acid+residues+of+the+transit+peptide+during+import+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo import experiments in protoplasts reveal the importance of the overall context but not specific amino acid residues of the transit peptide during import into chloroplasts.</a> Molecules and Cells. 14 (3), 388-397 (2002).</li>
<li>Lee, D. W., Lee, S., Oh, Y. J., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sequence+motifs+in+the+rubisco+small+subunit+transit+peptide+independently+contribute+to+Toc159-dependent+import+of+proteins+into+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiple sequence motifs in the rubisco small subunit transit peptide independently contribute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.</a> Plant Physiology. 151 (1), 129-141 (2009).</li>
<li>Lee, D. W., Woo, S., Geem, K. R., Hwang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+motifs+in+transit+peptides+act+as+independent+functional+units+and+can+be+transferred+to+new+sequence+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sequence motifs in transit peptides act as independent functional units and can be transferred to new sequence contexts.</a> Plant Physiology. 169 (1), 471-484 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+the+hydrophobicity+and+a+positively+charged+region+flanking+the+C-terminal+region+of+the+transmembrane+domain+of+signal-anchored+proteins+play+critical+roles+in+determining+their+targeting+specificity+to+the+endoplasmic+reticulum+or+endosymbiotic+organelles+in+Arabidopsis+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Both the hydrophobicity and a positively charged region flanking the C-terminal region of the transmembrane domain of signal-anchored proteins play critical roles in determining their targeting specificity to the endoplasmic reticulum or endosymbiotic organelles in Arabidopsis cells.</a> Plant Cell. 23 (4), 1588-1607 (2011).</li>
<li>Cleary, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+plant+mitochondria+import+chloroplast+precursor+proteins+in+vitro+with+the+same+efficiency+as+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolated plant mitochondria import chloroplast precursor proteins in vitro with the same efficiency as chloroplasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (7), 5562-5569 (2002).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

プロトプ ラストの葉緑体への蛋白質輸送を研究するシロイヌナズナの使用のための詳しいプロトコルを提供しました。このメソッドは、強力なタンパク質インポート プロセスを調査するため。このシンプルで汎用性の高いテクニック、予定された貨物タンパク質が葉緑体にターゲットを調べるのに役立ちます。このメソッドを使用すると、プロトプ ラストから非常に早く完全に成熟した葉に至るまで多くの異なる生育段階での植物から得ることができるシロイヌナズナ11,12の葉組織から用意しています。ただし、成長する植物のプロトプ ラストの調製に使用するとき注意が必要があります。健康な植物から調製したプロトプ ラストは、ペグ-仲介された変形に関与する多くのステップを耐えることができます 1 つは、非常に健全な植物を使用ください。別の重要な予防策は、新鮮なソリューションを使用することです。ソリューションの濃度のわずかな変化は、彼らは壊れやすく、浸透圧に非常に敏感であるので大きく、プロトプ ラストを損傷することが。
<p ...

葉緑体は植物の最も重要な器官のひとつです。1光合成を行う葉緑体の主な機能の 1 つです。葉緑体は、脂肪酸、アミノ酸、ヌクレオチドおよび多数の二次代謝産物1,2の生産のための他の多くの生化学的反応をまた運ぶ。これらの反応のすべてについて、葉緑体は多数の異なる種類のタンパク質を必要とします。しかし、葉緑体ゲノムにはだけおよそ 100 遺伝子3,4が含まれています。したがって、葉緑体は細胞質からのタンパク質の大部分をインポートする必要があります。実際には、ほとんどの葉緑体タンパク質翻訳4,5,6後に細胞質からインポートすることが示されました。植物細胞の葉緑体細胞質から蛋白質にインポートする特定のメカニズムが必要です。しかし、これらのタンパク質インポート メカニズムが過去数十年間検討されてきたがまだ完全にかわからないそれら分子レベルで。ここでは、プロトプ ラストを準備し、外因プロトプ ラストの遺伝子を表現するため詳細な方法を提供します。このメソッドは、詳細に葉緑体への蛋白質輸送の分子機構を解明するための貴重な可能性があります。
タンパク質インポートは、さまざまなアプローチを使用して学ぶことができます。これらのメソッドの 1 つの in vitroタンパク質インポート システム7,8の使用が含まれます。生体外で、このアプローチを使用して-翻訳された蛋白質の前駆物質は体外純化クロロプ ラストと孵化させる、タンパク質インポートは西部のしみの分析に続いて SDS-PAGE によって分析されます。このアプローチの利点は、葉緑体へのタンパク質インポートの各手順の詳細に学ぶことができますです。したがって、このメソッドは、広く使用されてタンパク質インポート分子機械のコンポーネントを定義し、輸送ペプチド シーケンス情報を解剖します。最近では、葉組織からのプロトプ ラストの使用を含む別のアプローチを開発し、葉緑体9,10への蛋白質輸送を研究する広く使用となっています。このアプローチの利点は、プロトプ ラスト培養システムよりもそのまま細胞に近い細胞環境を提供することです。したがって、プロトプ ラスト システムでは、関連するゾル性細胞質のイベントとターゲット信号の特異性を決定する方法など、このプロセスの多くの追加の側面に対処することが出来ます。ここでは、プロトプ ラストの葉緑体への蛋白質輸送を研究に使用するための詳細なプロトコルを提案する.

<table><tbody><tr><td>GAMBORG B5 MEDIUM INCLUDING VITAMINS</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0210.0050</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809.5000</td><td></td></tr><tr><td>MES MONOHYDRATE</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503.0250</td><td></td></tr><tr><td>寒天、粉末</td><td>JUNSEI</td><td>24440S1201</td><td></td></tr><tr><td>Micropore Surgical tape</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td></td></tr><tr><td>Surgical bladeステンレス No.10</td><td>フェザー</td><td>利用不可</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 50ml</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>マセロチーム R-10</td><td>ヤクルト製薬</td><td>入手できない</td><td></td></tr><tr><td>セルラーゼ オノヅカ R-10</td><td>ヤクルト製薬</td><td>利用できない</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン、ウシ(BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>SIGMA</td><td>M1902-1KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム、二水和物</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>0219463505-5KG</td><td></td></tr><tr><td>ツイスター</td><td>ビジョン サイエンティフィック</td><td>VS-96TW</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 用スクリーン カップ</td><td>SIGMA</td><td>S1145</td><td></td></tr><tr><td>CD-1 用スクリーン</td><td>SIGMA</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>SPL LIFE SCIENCES</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>ヒルゲンベルク</td><td>3150102</td><td></td></tr><tr><td>研究室用遠心分離機/ベンチトップ</td><td>ビジョン SCIENTIFIC</td><td>VS-5500N</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>JUNSEI</td><td>19015S0350</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>SIGMA</td><td>P3911-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース、無水バイオ</td><td>ベーシック</td><td>GB0219</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化カリウム</td><td>DUKSAN</td><td>40</td><td></td></tr><tr><td>硝酸カルシウム四水和物</td><td>SIGMA</td><td>C2786-500G</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコール)</td><td>SIGMA</td><td>P2139-2KG</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>SIGMA</td><td>M2393-500G</td><td></td></tr><tr><td>チューブ13ml、100x16mm、PP</td><td>ザルシュテット</td><td>55.515</td><td></td></tr>顕微鏡<tr><td>スライド</td><td>MARIENFELD</td><td>1000412</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーメガネ</td><td>MARIENFELD</td><td>101030</td><td></td></tr>カウント<tr><td>チャンバーMARIENFELD</td><td>650030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axioplan 2イメージング顕微鏡</td>カール<td>ツァイス</td><td>利用不可</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ1.5ml</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>SIGMA</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、プロテオミクスグレード</td><td></td><td>VWR M107-500G</td><td></td></tr><tr><td>TRIS、超高純度グレード</td><td>VWR</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-ジチオスレイトール)、バイオテクノロジーグレード</td><td>VWR</td><td>0281-25G</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルーナトリウム塩 ACS</td><td>VWR</td><td>0312-50G</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>純正</td><td>27210S0350</td><td></td></tr><tr><td>Living Colors A.v. モノクローナル抗体 (JL-8)</td><td>タカラ</td><td>632381</td><td></td></tr></tbody></table>

プロトプ ラストを用いた葉緑体への蛋白質輸送を勉強

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

葉緑体は、光合成など多くの二次代謝と脂質の生産植物の様々 な細胞プロセスを担当する重要な細胞小器官です。葉緑体は、これらの様々 な生理学的なプロセスの多数の蛋白質を必要とします。以上葉緑体タンパク質の 95% は、核でエンコードされ、細胞質から、葉緑体にインポートをゾル性細胞質のリボソームで翻訳後です。したがって、適切なインポートまたはこれら核葉緑体タンパク質が葉緑体にターゲットは葉緑体として植物細胞の適切な機能にとって不可欠です。核葉緑体タンパク質の解析には、葉緑体に特定の対象信号シーケンスが含まれています。葉緑体や細胞質に局在する分子機械はこれらの信号を認識し、インポート処理を実施します。タンパク質インポートまたは体内の葉緑体にターゲットのメカニズムを調べるためには、シロイヌナズナの葉緑体への蛋白質輸送を分析するための迅速で効率的な原形質体ベースの方法を開発しました。このメソッドでは、シロイヌナズナの葉組織から分離したプロトプ ラストを使用します。ここでは、プロトプ ラストを使用して、タンパク質が葉緑体にインポートされる機構を調査するための詳しいプロトコルを提供します。

葉緑体へのタンパク質のインポートは 2 つの方法を使用して調べることができます: SDS ページを介した分離後の蛍光顕微鏡とイムノブロット分析。ここで、赤血球を使用-nt:GFP、融合は、GFP を融合した輸送ペプチドを含む赤血球の 79 の N 末端アミノ酸残基のエンコーディングを構築します。ターゲット蛋白質赤血球からの信号は緑色蛍光タンパク質を葉緑体へインポートするとき-nt:GFP からクロロフィル自家蛍光レッド蛍光シグナルが合併と蛍光顕微鏡 (図 1)。2 つの信号の近くの重なりは、葉緑体へのタンパク質インポートを示します。しばしば GFP シグナルは葉緑体全体に広がっているまたは個々 の蛋白質によって、葉緑体中弱拡散信号と葉緑体の中心に集中しています。蛋白質の輸入は、GFP 抗体を用いたイムノ プロット解析で確認できます。プロトプ ラストから調製した血清総蛋白および西部のしみの分析 (図 2) に続いて SDS-PAGE によって分離が。ほとん...

ここでプロトプ ラストにペグを介した変換法を用いた蛋白質を表現するプロトコルについて述べる。メソッドが、興味の蛋白質、蛋白質のローカリゼーション、種々 の実験条件のインポート プロセスの効率的な調査の簡単な表現を提供します体内。

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

この謎は、葉芽細胞へのタンパク質入力などの細胞生物学の分野でいくつかの質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、葉包体へのタンパク質入力がen vivo条件下で研究できることです。手順を実証するには、私の研究室から2つのポストアウトであるジュンホ・リーとヒョンジュ・カンです。まず、1から2つのB5プレートに2週齢の植物から無傷の葉組織を収穫します。外科用ナイフを使用して葉を収穫し、25ミリリットルの酵素溶液を含む50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。チューブをロータリーシェーカーの上に水平に置き、ペチオールと茎だけが溶液に残るまで、暗闇の中で摂氏22度で穏やかな攪拌で8〜12時間インキュベートします。インキュベーションを完了した後、新鮮なペトリ皿に140マイクロメートルの細孔サイズのメッシュを介して放出されたプロトプラストを含む酵素溶液をフィルター処理します。その後、慎重に50ミリリットルの円錐管に21%スクロース溶液の15ミリリットルの上に溶液を重ねます。98 gsのスイングバケットローターでチューブを10分間遠心し、最も低い加速と減速設定を行います。その後、パトゥラピペットを使用して、酵素溶液を含む最上層および酵素溶液とスクロース溶液の界面から慎重にプロトプラストを除去します。この溶液をW5溶液の30ミリリットルを含む50ミリリットルの円錐管に移し、チューブを反転して混合します。チューブを51 gsで6分間遠心分離します。ピペットを使用して、ペレット内のプロトプラストを邪魔することなく、慎重にこの上清を捨てます。25ミリリットルのW5溶液を加え、プロトプラストを静かに再中断します。安定化のために、最低1時間、摂氏4度の冷蔵庫でインキュベートします。摂氏4度インキュベーション後、プロトプラストを46gsで2分間遠心して完全にペレット化する。慎重にスーパーナテントを完全に取り出し、PROTOPLASTペレットにMANG溶液を加え、1ミリリットル当たり6倍に10倍を達成します。ピペットを使用して、10マイクログラムのプラズマDNAと300マイクロリットルのプロトプラスト溶液を新鮮な13ミリリットルの丸底チューブに加えます。チューブを手で穏やかに回転させることで混合し、すぐに作りたての40%PEG溶液の300マイクロリットルを加えます。チューブをほぼ水平に傾け、手で数回穏やかに回転させることで完全に混ぜます。室温で30分間インキュベートします。その後、W5溶液の1ミリリットルを追加し、以前のように手で軽くチューブを回転させることによって完全に混合します。試料を室温で10分間インキュベートする。最初の1.5ミリリットルを加え、次に2ミリリットルのW5を加え、最終的な添加と混合の後、30分間インキュベートしてさらに2回繰り返します。46 gsでチューブを4分間遠心し、上清を捨てます。ペレットに2ミリリットルのW5溶液を加え、以前と同じように穏やかに、しかし完全に混ぜます。暗い部屋で摂氏22度で18時間インキュベートします。蛍光顕微鏡を用いてタンパク質のインポートを分析するには、トリミングされた先端を持つピペットを使用して、ガラススライド上にプロトプラスト溶液の10マイクロリットルを配置します。カバースリップを使用して慎重に解決策をカバーし、プロトプラストを損傷しないようにします。緑色蛍光タンパク質とクロロフィルの自己蛍光を観察するために設定された励起入フィルターを使用して、蛍光顕微鏡のステージにスライドを置きます。冷却された電荷カップルデバイスカメラを使用して画像をキャプチャし、イマジン編集ソフトウェアを使用して疑似カラー画像を生成して処理します。総タンパク質抽出と免疫ブロッティングの場合は、プロトプラスト溶液から1ミリリットルを取り出し、残りの1ミリリットルを混合します。このプロトプラスト溶液を遠心分離管に移し、46 gsで遠心分離機を4分間移します。遠心分離が完了した後に上清を取り除き、80マイクロリットルの変性バッファーを追加します。5秒間勢的に渦を打ち出す。5つのXDSサンプルバッファーを追加し、よく混ぜ、変性するために10分間沸騰させます。標準STSページと抗GFP抗体による免疫ブロット法を進めます。RbcSおよびTGFTは、GFPに融合したトランジットペプチドを含むRBCSの79末端末端アミノ酸残基をコードする融合構築物であり、蛍光顕微鏡および免疫ブロット法による葉包体へのタンパク質の輸入を研究するために使用された。蛍光顕微鏡で調べた場合、標的タンパク質からの緑色蛍光シグナルは、葉緑体へのタンパク質輸入を示すクロロフィル自己花序からの赤色蛍光シグナルと結合した。総タンパク質を単離した後、免疫ブロットでは2つのタンパク質バンドが観察され、タンパク質が葉白に適切に輸入されたことを示す。上のバンドは、葉芽突きにインポートした後、処理された形式に全長前駆体と下帯に対応しています。タンパク質の処理された形態の量は時間依存的に増加し、タンパク質が葉白質に輸入されることを示唆している。この開発では、この技術は、細胞生物学の分野の研究者がシロイヌナズナでタンパク質の疲れや膜糸摘出を探求する道を開いた。

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JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。...

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

ここでは、ストレス下での単離された葉緑体へのタンパク質のインポートを研究するための新しい方法を説明します。この方法は、迅速かつ簡単であり、葉緑体蛋白質の輸入のための異なるストレス条件、及び対応する調節機構の影響を研究するために適用することができます。...

ストレス植物から単離された葉緑体へのタンパク質のインポートの分析

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

生理活性チラコイドの高収率分離のためにここのプロトコルおよび葉緑体ツイン アルギニン転流 (cpTat)、分泌 (cpSec1)、およびシグナル認識粒子 (cpSRP)...

生理活性とエネルギー依存性タンパク質輸送アッセイでの使用の分離

我々 はここで葉緑体の浄化のためのテスト/実証済みのプロトコル タンパク質インポート複合体 (TIC TOC 複合体)...

タップのタグを使用して葉緑体トランスロコン タンパク質複合体の親和性の浄化

ここでは、シロイヌナズナの葉と 3 つメイン サブ コンパートメント (エンベロープ、質、およびチラコイド) から葉緑体を浄化する手法について述べる差動遠心、連続 Percoll の勾配の組み合わせを使用して、蔗糖不連続密度勾配。メソッドは subplastidial...

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

ミトコンドリアは、骨格筋の表皮形成性の高いレベルを示す重要な代謝小器官です。細胞質ゾルからのタンパク質のインポートは、レチクルムの拡張とミトコンドリア機能の維持に不可欠なオルガネラ生物形成のための重要な経路です。 したがって、タンパク質のインポートは、細胞の健康のバロメーターとして機能します。...

骨格筋ミトコンドリアのタンパク質輸入能の測定

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

コンフォメーションの柔軟性は、タンパク質の機能に重要な役割を果たしています。本明細書において、我々は、規則及び不規則タンパク質に機能を駆動急速な構造変化をプロービングするための水素 - 重水素交換に結合された時間分解エレクトロスプレーイオン化質量分析法の使用を記載しています。...

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

ここで嫌気性蛋白質の浄化、嫌気性蛋白質濃度、酸素電極システムを使用して後続の速度論的解析のためのプロトコルを提案する.DesB...

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

学ぶPEG法によるプロトプラスト変換を用いた葉緑体へのタンパク質輸送のin vivo解析法。GFP標識と蛍光顕微鏡で局在を可視化し、植物細胞生物学の研究に応用できます。

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