Name: Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Aprenda a gerar nanolipossomas catiônicos pelo método de filme seco para entrega eficiente de mRNA transcrito in vitro. Esta técnica aumenta a expressão proteica sem comprometer a viabilidade celular.

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1. geração de Nanoliposomes catiônica (Figura 1)
<ol><li>Dissolva os lipídios DC-colesterol (3beta-[N-(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoil] colesterol cloridrato) e drogas (fosfatidiletanolamina dioleoyl), fornecido como um pó, em clorofórmio para obter uma concentração final de 25 mg/mL. Nota: Guarde os lipídios dissolvidos em-20 ° C.</li>
	<li>Trabalhar com 25 mg/mL de solução de ambos os lipídios. Mix de 40 µ l do DC-colesterol dissolvido e 80 µ l da droga dissolvida em um balão de vidro. Nota: A quantidade de lipídios totais é de 3 mg. Para evitar a rápida evaporação do clorofórmio, coloque os lipídios no gelo durante a pipetagem.</li>
	<li>Vaporize o clorofórmio por 15 min sob um fluxo de gás argônio. Posteriormente, preencher um dessecador com sílica gel, colocar o balão de vidro aberto dentro e aplicar um vácuo durante a noite para certificar-se que o clorofórmio remanescente é evaporado, e um filme lipídico é formado dentro do frasco de vidro. Nota: Trabalho rápido e evite o contato de2 O desnecessário.</li>
	<li>Re-hidratar o filme lipídico formado com 1 mL de água livre de nuclease e levar a suspensão por 15 min (Figura 2A). Depois, coloque a suspensão em um banho de sonication por 1h (Figura 2B). Nota: A suspensão será ligeiramente turva.</li>
	<li>Montar a mini extrusora de acordo com as instruções do fabricante, encher uma seringa com a suspensão lipídico e coloque a seringa cheia e uma seringa vazia de ambos os lados da extrusora. Pressione a suspensão lipídico através da membrana de uma seringa para o outro, 20 x – x 25, para expulsar a suspensão (Figura 2). Nota: O tamanho da NLps é determinado pelo tamanho dos poros da membrana utilizada.</li>
	<li>Armazene o NLps num balão de vidro a 4 ° C até utilização posterior. Nota: Após o tempo de armazenamento prolongado, o NLps deve ser colocado no banho sonication novamente por 15 min a 35 kHz para contornar a formação do complexo.</li>
</ol>2. in Vitro a transcrição do mRNA sintético
<ol><li>Prepare a eGFP-codificação mRNA seguindo o protocolo publicado anterior34.</li>
	<li>Amplificar a sequência de eGFP do plasmídeo com 0,7 µM do RCS (5'-TTG GAC CCT CGT ACA GAA GCT AAT ACG-3') e reversa (5'-T120 CTT CTT ACT CAG GCT TTC TTA AAA GAC CA-3') primers e o polymerase kit com PCR.<ol>
<li>Mix 20 µ l de uma solução-tampão comercial que muda o comportamento de derretimento do DNA (Tabela de materiais), bem como de 20 µ l do mix 5 x do kit da polimerase. Adicione 7 µ l de cada primer (frente e verso).</li>
		<li>Adicionar 25 ng do plasmídeo eGFP para a mistura e 2 µ l de polymerase do kit da polimerase. Nota: Mantenha o polymerase no gelo antes de pipetagem-lo à solução.</li>
		<li>Adicionar livre de nuclease H2O, para a mistura, até um volume de 100 µ l.</li>
		<li>Manter o ciclo de PCR no thermocycler seguindo o protocolo na tabela 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purifica a sequência de DNA eGFP-codificação com o kit de purificação de PCR.<ol>
<li>Portanto, misturar a solução PCR com 500 µ l de tampão de ligação do kit e usá-lo para preencher colunas de purificação.</li>
		<li>Centrifugar as colunas na velocidade máxima por 1 min e descartar o filtrado.</li>
		<li>Adicione 750 µ l de tampão de lavagem eu à coluna, centrifugue novamente com o máximo de velocidade por 1 min e descartar o filtrado.</li>
		<li>Repita a etapa de centrifugação 1 x para remover o tampão do filtro da coluna.</li>
		<li>Transfira a coluna para um tubo de 1,5 mL a fresco.</li>
		<li>Adicionar 20 µ l de nuclease livre H2O para a coluna, incubar durante 1 min e centrifugar por 1 min na velocidade máxima. Repita este passo.</li>
		<li>Medir a concentração de DNA com um fotômetro e armazená-lo a-20 ° C.</li>
		<li>Realize as análises de qualidade de DNA usando electroforese em gel. Adicionar 0,5 g de agarose no tampão Tris-borato-EDTA (TBE) e aquecê-la no microondas em fogo alto até que a agarose é completamente dissolvido.</li>
		<li>Adicionar 5 µ l de solução de gel-coloração para o líquido do agarose, encher a solução na câmara de gel e espere até que o gel é polimerizado.</li>
		<li>Mix 200 ng de DNA com 2 µ l de 6 x carregamento tintura e encha até um volume final de 12 µ l. Pipetar uma escada de DNA, bem como a amostra de DNA, os poços de gel e executar a eletroforese para 1 h a 100 V.</li>
		<li>Analise o gel usando uma gel-analisando a estação sob luz UV.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Executar a transcrição em vitro para gerar o mRNA da sequência de DNA com um kit da transcrição em vitro contendo T7-polymerase e substituir os nucleotídeos modificados de UTP e CTP com Ψ-UTP e metil-CTP.<ol>
<li>Para a transcrição em vitro , misture os ingredientes seguindo a tabela 2. Nota: Substitua 1,5 µ l de metil-CTP com 01:10 Cy3-CTP diluído em livre de nuclease H2O durante a transcrição em vitro de eGFP mRNA para alcançar Cy3-rotulagem do mRNA.</li>
		<li>Incubar a mistura de reação IVT por 4 h a 37 ° C.</li>
		<li>Adicione 1 µ l de DNase I, a partir do polymerase T7 kit e incube por 15 min 37 ° c para digerir o modelo de DNA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para purificar o mRNA, use o kit de limpeza de RNA.<ol>
<li>Encher o mix IVT para o volume de 100 µ l com nuclease livre H2O.</li>
		<li>Adicione 350 µ l de tampão de Lise e misture pipetando para cima e para baixo.</li>
		<li>Adicionar 250 µ l de etanol 100% e misture novamente. Pipete o mix nas colunas de limpeza.</li>
		<li>Centrifugar por 15 s em 8.000 x g e descarte o filtrado.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l de buffer de lavagem em uma coluna, centrifugue novamente 15 s em 8.000 x ge remover o filtrado.</li>
		<li>Lavar a coluna 1 x com 500 µ l de tampão de lavagem e centrifugação por 2 min a 8.000 x g.</li>
		<li>Mova a coluna para um tubo de reação de 1,5 mL fresco. Eluir o mRNA 2 x por uma incubação de 1-min de 20 µ l de nuclease livre H2O na membrana da coluna, seguido por uma centrifugação de 1 min na velocidade máxima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Remova os grupos fosfato do mRNA usando um kit de desfosforilação. Adicionar 4,5 µ l de tampão de fosfatase 10 x e 1 µ l de fosfatase de mRNA e incubar durante 1 h a 37 ° C.</li>
	<li>Purifica o mRNA novamente, seguindo passos 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	<li>Medir a concertação de mRNA com um fotômetro.</li>
	<li>Eletroforese em gel de uso para analisar a pureza e o tamanho do mRNA. Portanto, prepare um gel de agarose, conforme descrito nas etapas 2.3.9 - 2.3.10.<ol>
<li>3.3 Mix µ l de formamida, 1 µ l de formol 37%, 1 µ l de 10 x homens e 1,7 µ l de 6 x carregamento tintura com 200 ng de mRNA e preenchê-lo até 10 µ l com nuclease livre H2O para cada amostra e marcador de RNA.</li>
		<li>Incube a mistura durante 10 minutos a 65 ° C para desnaturação do mRNA. Carregar os poços do gel com o mRNA e o marcador de RNA e funcione o gel durante 1 h a 100 V.</li>
		<li>Analise o gel usando uma estação de doutor de gel com luz UV.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. complexação de mRNA sintético
<ol><li>Descongelar o mRNA sintético no gelo, vórtice e centrífuga pouco antes da abertura do tubo.</li>
	<li>Mix 10 µ l de mRNA sintético (concentração de mRNA é 100 ng / µ l) com 1 µ l, 2,5 µ l, 5 µ l, 10 µ l ou 20 µ l de suspensão de PNL (concentração de PNL é 3 mg/mL). Centrifugue brevemente e incubar durante 20 min em temperatura ambiente (RT) para formação de nanolipoplex. Nota: Não misture por pipetagem. Isto pode levar à perda de volume. Vórtice em breve para uma mistura completa.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de meio de célula normal para o nanolipoplexes e misturá-los pipetando para cima e para baixo.</li>
</ol>4. análise da eficiência de encapsulação de Nanoliposomes
<ol><li>Para realizar os experimentos de encapsulamento, use o kit de quantificação de RNA.</li>
	<li>Prepare a solução diluindo-se para uma alta-escala 1: 200 a tintura fluorescente e 1:2,000 para um ensaio de baixa gama. Nota: Descongele o corante fluorescente no gelo. Prepare a solução de trabalho diretamente antes da utilização.</li>
	<li>Preparar as alta-baixa gama e curvas padrão usando 1 mL de uma solução stock de 2 µ g/mL de eGFP mRNA em livre de nuclease H2O. Nota: Para as curvas padrão, use o mRNA que será usado nas experiências de encapsulamento.</li>
	<li>Use a tabela 3 para a preparação do padrão de alta gama (20 ng/mL - 1 µ g/mL).</li>
	<li>Para o padrão de baixa gama, dilua a 2 µ g/mL eGFP mRNA solução estoque 01:20 para atingir uma concentração final de 100 ng/mL. Prepare um padrão de baixa gama (1 ng/mL - 50 ng/mL), conforme descrito na tabela 4.</li>
	<li>Combine 1 µ g de eGFP mRNA (10 µ l) e 7,5 µ g de NLps (2,5 µ l) e incube por 20 min no RT Nota: Mantenha o mRNA no gelo para evitar a degradação.</li>
	<li>Adicione 1 mL de nuclease livre H2O formulário nanolipoplexes e mistura pipetando para cima e para baixo.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de 1: 200 ou 1:2,000 solução de trabalho de tintura fluorescente RNA as normas e amostras encapsuladas e incubar durante 5 min à RT no escuro.</li>
	<li>Pipetar os padrões e amostras em duplicatas para uma preta placa de 96 poços e medir a fluorescência a 530 nm em um leitor de microplacas (Figura 3).</li>
</ol>5. preparação das células para transfeccao
<ol><li>Placa de 1,5 x 105 A549 células/poço de uma placa de 12 d 1 antes do transfection.</li>
	<li>Incube as células em 37 ° C e 5% CO2 em meio de célula normal (glicose alta/DMEM com 10% soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 1% penicilina/estreptomicina) durante 24 h antes do transfection.</li>
</ol>6. transfection das células
<ol><li>Lave o preparado células 1 x com 1 mL/poço PBS (sem o Ca2 +Mg2 +).</li>
	<li>Adicione 1 mL da mistura de nanolipoplex preparado, contendo 1 µ g de eGFP que mRNA encapsulada em 1 µ l, 2.5 µ l, 5 µ l, 10 µ l ou 20 µ l NLps, para bem da placa preparada com células A549.</li>
	<li>Adicionar a suspensão de nanolipoplex para as células e incubar a condições regulares para 24 h analisar a eficácia de transfeccao, ou por 24 h e 72 h para analisar a viabilidade celular depois do transfection. Nota: Transfection com NLps não exige uma mudança de média.</li>
</ol>7. análise da eficácia de transfecção celular usando citometria de fluxo e microscopia de fluorescência
<ol><li>Remover o sobrenadante e lavar as células com 1ml/bem PBS (sem o Ca2 +/ mg2 +) para remover o restante NLps.</li>
	<li>Prepare as células por citometria de fluxo.<ol>
<li>Trypsinize as células com 500 µ l/poço tripsina/EDTA (0.05%) a 37 ° C por 3 min. parar o processo e inativar a tripsina, adicionando a mesma quantidade (500 µ l/poço) de médio regular contendo FBS.</li>
		<li>Centrifugar as células durante 5 min à 400 x g e remova cuidadosamente o sobrenadante sem tocar o centrifugado.</li>
		<li>Lavar as células com 1 mL de PBS (sem o Ca2 +Mg2 +).</li>
		<li>Ressuspender as células em 300 µ l de solução de fixação 1 x e transferir as células nos tubos de citometria de fluxo.</li>
		<li>Analisar as células em 488 nm em um citômetro de fluxo (Figura 4A). Nota: Vórtice as células 1 x diretamente antes de medir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare as células para microscopia de fluorescência.<ol>
<li>Consertar as células com 1 mL/bem 100% metanol, que anteriormente foi armazenado a-20 ° C.</li>
		<li>Adicionar 500 µ l/poço 300 nM DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) dissolvido em PBS (sem o Ca2 +/ mg2 +) e incube por 5 min no escuro.</li>
		<li>Remover a solução DAPI e lavar as células novamente com 100% de metanol armazenado a-20 ° C.</li>
		<li>Analise as células usando um microscópio de fluorescência (Figura 4B). Nota: Use os seguintes comprimentos de onda de excitação/emissão: eGFP 488/509 nm, nm DAPI 358/461 e Cy3 550/570 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. ensaio da viabilidade celular
<ol><li>Dissolva 5 mg de MTT (brometo de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) em 1 mL de RPMI (sem vermelho de fenol). Nota: O MTT dissolvido deve ser ainda mais diluído 01:10 (concentração final: 0,5 mg/mL) em RPMI antes do uso.</li>
	<li>Lavar as células transfectadas 3 x com 1 mL/poço PBS (sem o Ca2 +/ mg2). Nota: Os restos do meio de célula normal devem ser completamente removidos.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l/poço de 01:10 diluído solução MTT para as células e incube por 4 h a 37 ° C.</li>
	<li>Remova a solução MTT das células após a incubação e adicione 500 µ l/poço DMSO (Dimetilsulfóxido). Incube novamente por 10 min a 37 ° C.</li>
	<li>Pipetar a solução de DMSO em trigêmeos para uma placa de 96 poços de clear-inferior e medir a adsorção a 540 nm, utilizando um leitor de microplacas.</li>
	<li>Definir a viabilidade da célula não tratada em 100% e calcular a viabilidade celular dos outros grupos em comparação com as células controle não tratados (Figura 5).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O protocolo apresentado descreve a geração de NLps com eficácia elevada de encapsulamento para mRNA sinteticamente modificado, assim como o transfection confiável de células em vitro. Além disso, os NLps garantir a liberação do mRNA, que por sua vez, é traduzida em uma proteína funcional no interior das células. Além disso, os transfections usando NLps podem ser executadas no meio celular regular, resultando em alta realidades da pilha durante a transfeccao, e durar até três dias depois do transfection.
<p c...

O uso de mRNA modificados para aplicações terapêuticas tem mostrado grande potencial no último par de anos. Em doenças cardiovasculares, inflamatórias e eurogenética, bem como no desenvolvimento de vacinas, o mRNA é um promissor agente terapêutico1.
Terapia de reposição de proteína com mRNA oferece diversas vantagens sobre a terapia de gene clássica, que se baseia a transfeccao de ADN em células alvo2. A função do mRNA inicia diretamente no citosol. Embora o plasmídeo de DNA (pDNA), uma construção de dupla-hélice, circular DNA contendo uma região promotora e uma sequência de genes codificação da proteína terapêutica3, também atos no citosol, pode apenas ser incorporado em células que estão passando por mitose no momento do transfection. Isso reduz o número de células transfectadas em tecido1,4. Especificamente, o transfeccao de tecidos com atividade fraca mitose, como as células cardíacas, é difícil5. Em contraste com pDNA, a transfeccao e tradução do mRNA ocorrem em células mitóticas e não-mitótica no tecido1,6. A integração viral do DNA no genoma do hospedeiro pode vir com efeitos mutagénicos ou reações imunes7,8, mas depois a transfecção de células com um mRNA de codificação de proteínas, a síntese de novo da proteína desejada começa-se autonomamente9,10. Além disso, a síntese de proteína pode ser ajustada precisamente a necessidade do paciente através de doses individuais, sem interferir com o genoma e arriscar efeitos mutagénicos11. O potencial imunológico-ativando de mRNA sinteticamente gerado poderia ser drasticamente reduzido usando pseudo uridina e 5'-methylcytidine em vez de uridina e citidina12. Uridina pseudo mRNA modificados também foi mostrado para ter uma maior estabilidade biológica e um significativamente maior capacidade translacional13.
Para poder beneficiar das propriedades promissoras de terapia baseada em mRNA em aplicações clínicas, é essencial para criar um veículo adequado para o transporte do mRNA para a célula. Este veículo deve suportar tóxicos propriedades in vitro e em vivo, proteger o mRNA contra nuclease-degradação e prever uma disponibilidade prolongada e tradução do mRNA14suficiente absorção celular.
Entre todos os tipos de portador possível para na vivo entrega da droga, como nanotubos de carbono, pontos quânticos e lipossomas, este último tem sido estudado a mais de15,16. Lipossomas são vesículas consistindo de bicamada lipídica10. Eles são anfifílica com uma hidrofóbica e uma parte hidrofílica, e através do auto arranjo destas moléculas, uma dupla camada esférica é formada de17. Dentro os lipossomas, agentes terapêuticos ou drogas podem ser encapsuladas e, assim, protegidas contra a degradação enzimática de18. Lipossomas contendo N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium cloreto (DOTMA)19, [1,2-bis (oleoyloxy) -3-(trimetilamonio) propano] (DOTAP)20e dioctadecylamidoglycylspermine (cães)21, ou DC-colesterol22, estão bem caracterizados e frequentemente utilizada para transfecção celular com DNA ou RNA.
Os lipossomas catiônicos compõem um lipido carregado positivamente e um fosfolipídeo descarregado23. Transfecção via catiônicos lipossomas é um dos métodos mais comuns para o transporte de ácidos nucleicos em células24,25. As partículas de lipídios catiônicos formam complexos com os grupos fosfato negativamente carregados na espinha dorsal de moléculas de ácido nucleico26. Estes chamados lipoplexes anexar à superfície da membrana celular e entrar na célula por endocitose ou mecanismos de endocitose-como27.
Em 1989, Malone et al. com êxito descrito mediada por lipídios catiônicos mRNA transfeccao28. No entanto, usando uma mistura de DOTMA e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga), o grupo encontrou que DOTMA manifestou efeitos citotóxicos28. Além disso, Zohra et al mostrou que DOTAP (cloreto de 1,2-dioleoyloxy-3-trimetilamónio-propano) pode ser usado como um de reagente de Transfeccao de mRNA29. No entanto, para a eficiente transfecção de células, DOTAP deve ser usado em combinação com outros reagentes, tais como fibronectina29 ou DOPE30. Até agora, DOTMA foi o primeiro lipídios catiônicos no mercado usado para o gene entrega31. Outros lipídios são utilizados como terapêuticas portadores ou estão a ser testados em diferentes fases de ensaios clínicos, (por exemplo, EndoTAG-eu, contendo DOTAP como um portador de lipídios), atualmente está sendo investigado em uma fase-II de julgamento clínico32.
Este trabalho descreve um protocolo para a geração de NLps contendo DC-colesterol e drogas. Esse método é fácil de executar e permite a geração de NLps de tamanhos diferentes. O objetivo geral de PNL geração usando o método seco-filme é criar lipossomas para complexação de mRNA, permitindo assim a célula eficiente e biocompatível transfecção em vitro14,33.

<table><tbody><tr><td>Broridrato de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT)</td><td>AppliChem, Darmstadt, Alemanha</td><td>A2231</td><td></td></tr><tr><td>(3&beta;-[N-(N&prime;,N&prime;-dimetilaminoetano)-carbamoil]cloridrato de colesterol (DC-Colesterol)</td><td>Avanti, Alabama, EUA</td><td>700001</td><td></td></tr><tr><td>4&nbsp; &prime;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>BD FACScan system</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Fix (10x)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha</td><td>340181</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Merck, Darmstadt, Alemanha</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha</td><td>20385.02</td><td></td></tr><tr><td>Dioleoyl fosfatidiletanolamina (DOPE)</td><td>Avanti, Alabama, EUA</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio de fluorescência</td><td>Zeiss Axio, Oberkochen, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Mini extrusora</td><td>Avanti, Alabama, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Opti-Mem</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Tampão PBS (sem Ca2+/Mg2+)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reagentes de RNA Quant-iT Ribo Green Thermo</td><td>Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>Q33140</td><td></td></tr><tr><td>RPMI (sem vermelho de fenol)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>11835030</td><td></td></tr><tr><td>Gel de sílica</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha</td><td>P077</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Kit de polimerase HotStar HiFidelity</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>202602</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td> pseudouridina-5'-trifosfato (&psi;-UTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, EUA</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>5-metilcitidina-5'-trifosfato (metil-CTP)</td><td>TriLink Biotechnologies, San Diego, EUA</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>Cianina 3-CTP</td><td>PerkinElmer, Baesweiler, Alemanha</td><td></td><td></td>NEL580001EA</tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen, Hilden, Alemanha</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Transcrição MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>3&agudo;-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analógico</td><td>New England Biolabs, Ipswich, EUA</td><td>S1411L</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatase Antártica</td><td>Novo England Biolabs, Ipswich, EUA</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Alemanha</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium, Fremont, EUA</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>peqGOLD DNA ladder mix</td><td>VWR, Pensilvânia, EUA</td><td>25-2040</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen 0.5-10kb RNA ladder</td><td>Fisher Scientific, G&ouml; teborg, Suécia</td><td>11528766</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de in vitro transcrito de rna mensageiro

Generation of Cationic Nanoliposomes for the Efficient Delivery of In Vitro Transcribed Messenger RNA

O desenvolvimento do RNA mensageiro (mRNA)-com base em terapêutica para o tratamento de várias doenças se torna cada vez mais importante devido o positivo Propriedades in vitro transcrito (IVT) mRNA. Com a ajuda de IVT mRNA, a síntese de novo de uma proteína desejada pode ser induzida sem alterar o estado fisiológico da célula alvo. Além disso, a biossíntese de proteínas pode ser controlada precisamente devido ao efeito transiente de mRNA IVT.
Para a eficiente transfecção de células, nanoliposomes (NLps) pode representar um veículo de entrega segura e eficiente para a terapêutica do mRNA. Este estudo descreve um protocolo para gerar segura e eficiente catiônica NLps consistindo de DC-colesterol e 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (droga) como um vetor de entrega para IVT mRNA. NLps tendo um definido tamanho, uma distribuição homogénea e uma capacidade de complexação de alta e pode ser produzidos usando o método seco-filme. Além disso, apresentamos os sistemas de teste diferente para analisar sua complexação e eficácias de transfeccao usando sintética reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) mRNA, bem como seus efeitos sobre a viabilidade celular. No geral, o protocolo apresentado fornece uma abordagem eficaz e segura para complexação de mRNA, que pode avançar e melhorar a administração de terapêutica mRNA.

Usando o protocolo como descrito, NLps consistindo de lipídeos DC-colesterol e droga foram preparadas usando o método seco-filme (Figura 1). Durante a preparação, a solução de nanoliposome mostra diferentes fases na turbidez (Figura 2).
A eficácia de encapsulamento do NLps pode ser analisada após o encapsulamento de 1 µ g de mRNA eGFP-codificação, analisando a quantidad...

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de nanoliposomes catiônico, o qual se baseia o método seco-filme e pode ser usado para o cofre e entrega eficiente do in vitro transcrito de RNA mensageiro.

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

The development of messenger RNA (mRNA)-based therapeutics for the treatment of various diseases becomes more and more important because of the positive ...

Este protocolo permite a produção de nanoliposomos seguros e eficientes que podem ser usados como veículos de transfecção para RNA mensageiro terapêutico. Esses nanoliposomos facilitam a absorção de mRNA nas células, resultando em aumento dos níveis de expressão proteica sem afetar a viabilidade celular. A principal vantagem desta técnica é a geração rápida e fácil de nanoliposomos estáveis com tamanho definido e distribuição homogênea.Além disso, protegem o mRNA encapsulado da degradação e levam a uma tradução prolongada. Demonstrando o procedimento estará Antonia Link, uma estudante de doutorado do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare soluções de estoque para os lipídios, DC-colesterol e DOPE, dissolvendo cada um em clorofórmio para uma concentração final de 25 miligramas por mililitro.Misture 40 microliters do DC-colesterol dissolvido com 80 microliters da DROGA dissolvida em um frasco de vidro. Vaporize o clorofórmio sob um fluxo de gás argônio por 15 minutos. Em seguida, encha um desiccator com gel de sílica.Coloque o frasco de vidro aberto dentro e aplique um vácuo durante a noite para garantir que o clorofórmio restante seja evaporado. O filme lipíduo resultante se formará dentro do frasco de vidro. No dia seguinte, adicione um mililitro de água livre nuclease para reidratar o filme lipíduo.E vórtice da suspensão por 15 minutos. Coloque a suspensão em um banho de sônica por uma hora. Depois disso, monte a mini extrusora de acordo com as instruções do fabricante.Encha uma seringa com a suspensão líquida e coloque-a de um lado da extrusora. Coloque uma seringa vazia do outro lado. Pressione a suspensão lipídica através da membrana de uma seringa para a outra, aproximadamente 20-25 vezes para extrusir a suspensão.Em seguida, armazene os nanoliposomos em um frasco de vidro a quatro graus Celsius até estar pronto para usar. Primeiro, descongele o mRNA sintético no gelo. Vórtice o mRNA congelado e, em seguida, centrifuá-lo pouco antes de abrir o tubo.Em seguida, misture um micrograma do mRNA sintético com várias quantidades de suspensão nanoliposome. Centrifugar brevemente e incubar à temperatura ambiente por 20 minutos para formação de nanolipoplex. Em seguida, adicione mililitro de meio celular regular ao nanolipoplex e misture por pipetação para cima e para baixo.Prepare as células um dia antes da transfecção. Portanto, placa 150.000 células A549 em cada poço de uma placa de 12 poços um dia antes da transfecção. Incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e meio celular regular durante 24 horas.Então no dia seguinte, lave cada poço de células preparadas uma vez com um mililitro de PBS. Adicione um mililitro de uma mistura de nanolipoplex preparado a um dos poços que contêm as células A549. Incubar em condições regulares por 24 horas para analisar a eficiência da transfecção, ou por 24-72 horas para analisar a viabilidade celular após a transfecção.Remova o supernatante e lave cada poço com um mililitro de PBS para remover os nanoliposomos restantes. Para preparar as células para a citometria, primeiro adicione 500 microliters de trippsina EDTA a cada poço e incubar a 37 graus Celsius por três minutos para tentarpsinizar as células. Em seguida, adicione 500 microliters de meio regular contendo FBS para interromper o processo e inativar a trippsina.Centrifugar as células a 400 vezes G por cinco minutos. E remova cuidadosamente o supernatante sem perturbar a pelota celular. Lave as células com um mililitro de PBS.Em seguida, suspenda novamente as células em 300 microliters da solução de fixação celular e transfira-as para tubos de citometria de fluxo. Use um citómetro de fluxo para analisar as células a 488 nanômetros. Para preparar as células para microscopia de fluorescência, adicione um mililitro de metanol resfriado a cada poço para corrigir as células.Adicione 500 microliters de uma solução de 300 nanomolar de DAPI dissolvida em PBS a cada poço. Incubar no escuro por cinco minutos. Depois disso, remova a solução DAPI e lave as células novamente com 100% de metanol que foi armazenado anteriormente a menos 20 graus Celsius.Use um microscópio de fluorescência para analisar as células usando os comprimentos de onda de excitação e emissão mostrados aqui. Neste estudo, nanoliposomos são gerados com alta eficácia de encapsulamento para mRNA sintéticamente modificado. Utilizando o kit de quantificação de RNA, a eficácia de encapsulamento dos nanoliposomos pode ser analisada após o encapsulamento de um micrograma de mRNA de codificação eGFP, analisando a quantidade livre de mRNA que não é encapsulada.Após o encapsulamento do EGFP mRNA em diferentes quantidades de nanoliposomos, os nanolipoplexos formados podem ser incubados com células in vitro e a porcentagem de células expressas por eGFP pode ser analisada usando citometria de fluxo 24 horas após a transfecção. Como visto aqui, mesmo apenas um microliter da solução de nanoliposomos é suficiente para alcançar uma alta transfecção das células invitro. Quando as células são transfeinadas com nanoliposomos contendo cy3 rotulados eGFP mRNA, a presença do eGFP mRNA no citoplasma, bem como a proteína eGFP já produzida, pode ser visualizada.Uma vez que a transfecção de células usando nanolipoplexos pode ter efeitos adversos nas células, a viabilidade das células foi testada após 24 horas e 72 horas após a transfecção. Nenhum efeito na viabilidade celular pôde ser detectado quando as células foram tratadas com 2,5 ou cinco microlitros de nanolipoplexos. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de trabalhar em um ambiente livre de etanol o tempo todo, pois isso pode prejudicar a estabilidade nanoliposome.Enquanto prepara e mistura o DC-colesterol com DOPE, você deve usar uma pipeta de vidro para evitar a contaminação dos lipídios dissolvidos com componentes solúveis de pontas de pipeta plástica. Seguindo este protocolo, os nanoliposomos gerados podem ser facilmente manipulados durante ou após a preparação. Por exemplo, a incorporação de moléculas de PEG ou anticorpos específicos levaria a um aumento da estabilidade ou iniciaria a segmentação ativa do tecido.Os nanoliposomos gerados preenchem os aspectos de segurança necessários e facilitam a absorção de mRNA para as células-alvo. Nanoliposomos complexos com um nRNA terapêutico específico podem contribuir essencialmente para o desenvolvimento de novas terapêuticas baseadas em mRNA no campo da engenharia de tecidos ou terapia de substituição, por exemplo.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Repetidas injeções de retro-orbital dos complexos liposomes/siRNA/ITSN-1s catiônicos em camundongos, a cada 72 horas por 24 dias, entregar eficientemente o duplex siRNA para a microcirculação do pulmão do rato reduzindo mRNA ITSN-1s e expressão da proteína em 75%. Esta técnica é altamente reprodutível num modelo animal, não tem efeitos adversos e evita mortes.

Silenciando a longo prazo de Intersectin-1s nos pulmões do rato por entrega repetida de um siRNA específico via lipossomos catiônicos. Avaliação dos efeitos Knockdown por microscopia eletrônica

O objetivo deste protocolo é usar lipossomas catiônicos/aniônicos com um peptídeo neurodirecionado como um sistema de entrega do SNC para permitir que o siRNA atravesse o BBB.  A otimização de um sistema de entrega para tratamentos, como o siRNA, permitiria mais opções de tratamento para príons e outras doenças neurodegenerativas.

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Nós descrevemos um método de usar polyethyleneimine (PEI)-revestido de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético para macrófagos transfecting com siRNA. Essas nanopartículas podem eficientemente entregar siRNA expressão macrófagos gene-alvo em vitro e in vivo e silêncio.

Nanopartículas de óxido de ferro revestido de Polyethyleneimine como um veículo para a entrega de RNA de interferência pequeno para macrófagos In Vitro e In Vivo

São apresentados métodos para preparar e caracterizar as propriedades físico-químicas e a bioatividade de nanopartículas de siRNA com carga neutra e pH responsivo. Os critérios para nanomedicinas bem sucedidas de siRNA tais como o tamanho, a morfologia, a carga de superfície, o carregamento de siRNA, e o silenciamento do gene são discutidos.

Preparação de nanopartículas poliméricos neutralmente carregadas e responsivas ao pH para entrega de siRNA citosólica

As nanopartículas lipídicas são desenvolvidas usando uma abordagem de plataforma de mistura microfluida para encapsulamento de mRNA e DNA.

Formulando e caracterizando nanopartículas lipídicas para entrega de genes usando uma plataforma de mistura microfluida

Os métodos de produção de nanopartículas lipídicas à base de microfluídica (LNP) têm atraído atenção em sistemas de entrega de medicamentos (DDSs), incluindo a entrega de RNA. Este protocolo descreve os processos de fabricação, produção de LNP (LNP carregado de siRNA) e processos de avaliação do LNP usando nosso dispositivo microfluido original chamado iLiNP.

Produção de nanopartículas lipídicas carregadas de siRNA usando um dispositivo microfluido

Usando a polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI), produzimos partículas lentivirais para expressão estável de shRNAs em células-tronco embrionárias humanas H9 (hESCs) e células progenitoras neurais derivadas de H9 (NPCs) com alta eficiência.

Entrega mediada lentiviral de shRNAs para hESCs e NPCs usando polietilenimina de polímero cônico de baixo custo (PEI)

Uma nanopartícula de peptídeo-poloxamina auto-montada (PP-sNp) é desenvolvida usando um dispositivo de mistura microfluida para encapsular e fornecer RNA de mensageiro transcrito in vitro . O mRNA/PP-sNp descrito poderia transfetar eficientemente células cultivadas in vitro.

Transfecção eficiente de mRNA transcrito in vitro em células cultivadas usando nanopartículas de peptídeo-poloxamina

Aqui, um protocolo para a formulação de nanopartículas lipídicas (LNPs) que encapsulam RNAm que codifica a luciferase do vagalume é apresentado. Esses LNPs foram testados quanto à sua potência in vitro em células HepG2 e in vivo em camundongos C57BL/6.

Testando a Eficiência In Vitro e In Vivo de Nanopartículas de RNAm-Lipídios Formuladas por Mistura Microfluídica

Um protocolo detalhado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) usando tecnologias de misturador de jato de impacto confinado (CIJ), incluindo um CIJ de dois jatos e um misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (μMIVM), é demonstrado. Os misturadores CIJ geram ambientes de micromistura turbulentos e reprodutíveis, resultando na produção de LNPs monodispersos.

Sintetizando Nanopartículas Lipídicas por Fluxo Turbulento em Misturadores de Jato de Impacto Confinado

Aprenda a gerar nanolipossomas catiônicos pelo método de filme seco para entrega eficiente de mRNA transcrito in vitro. Esta técnica aumenta a expressão proteica sem comprometer a viabilidade celular.

Geração de Nanoliposomes catiônica para a entrega eficiente de In Vitro transcrito de RNA mensageiro

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