Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave nas neurociências, como as alterações na neuroquímica durante a história natural de doenças neurológicas. A principal vantagem da técnica proposta de EEG de microdiálise é que tal abordagem combinada permite o emparelhamento de alterações na liberação do neurotransmissor dentro de estágios específicos do desenvolvimento e progressão da doença. Comece ligando o amplificador posicionado fora da Gaiola faraday.

Abra o software EEG e inicie a aquisição do EEG e observe o sinal EEG produzido por cabos não ligados. Em seguida, conecte o animal ao sistema de gravação EEG amarrado segurando a cabeça do animal entre dois dedos esticados de uma mão e aparafusando os conectores ao pedestal do eletrodo usando a outra mão livre. Defina um fator de amplificação em cada canal do amplificador de acordo com o sinal de eletrodo de um único animal para que o sinal EEG esteja em escala.

Em seguida, deixe o animal explorar a nova gaiola por pelo menos uma hora sob a observação direta do pesquisador. Ajuste o cabo de acordo com a mercadoria do animal, e certifique-se de que os cabos não interfiram com os movimentos do animal e a postura mentirosa. Finalmente, verifique o enquadramento correto da imagem nas câmeras de vídeo e, em seguida, inicie a gravação de EEG de vídeo.

Comece preparando os testes de microdiálise para o primeiro uso de acordo com o guia do usuário do fabricante e preencha-os com a Solução ringer. Em seguida, corte pedaços de 10 centímetros de comprimento de tubulação FEP e conecte-os às cânulas de entrada e saída da sonda usando os adaptadores de tubulação de diferentes cores. Certifique-se de que o tubo toca os adaptadores sem espaço morto em todas as conexões.

Remova a cânula falsa de seu guia usando a pinça segurando firmemente a cabeça do animal. Insira a sonda de microdiálise na cânula guia e use argila de modelagem para firmar ainda mais a cânula. Em seguida, conecte o animal ao sistema de gravação EEG amarrado.

Em seguida, coloque o animal no cilindro de plexiglass e deixe-o explorar o novo ambiente. Siga os movimentos de ratos acordados e livremente em movimento. Em seguida, conecte a entrada da sonda à seringa de 2,5 mililitros com uma agulha de calibre 22 com uma agulha de calibre 22 com corte contendo a Solução de Ringer usando os adaptadores de tubulação.

Empurre um mililitro da Solução ringer para a sonda em 10 segundos empurrando o pistão da seringa de 2,5 mililitros continuamente. Verifique se há uma gota do líquido que aparece na tomada para significar quando a sonda estiver pronta para uso. Por fim, encha as seringas de 2,5 mililitros conectadas à tubulação FEP por adaptadores de tubo com a Solução de Ringer e monte-as na bomba de infusão.

Ligue a bomba em dois microliters por minuto e deixe-a funcionar durante a noite. Depois de verificar através de gravações de EEG de vídeo a ausência de convulsões nas três horas anteriores à coleta de amostras, pare a bomba carregando as seringas canuladas de tubo FEP preenchidas com a Solução de Ringer. Monte outro conjunto de seringas de 2,5 mililitros conectadas à tubulação FEP com adaptadores de tubulação preenchidos com uma solução de Ringer modificada contendo solução de potássio de 100 mililitros.

Ligue a bomba em dois microliters por minuto e deixe-a funcionar. Verifique se há falta de bolhas de ar no sistema e certifique-se de que o tubo toque nos adaptadores sem espaço morto em todas as conexões. Em seguida, verifique se há a gota do líquido que aparece na tomada para significar quando a sonda estiver pronta para uso.

Em seguida, conecte a tubulação FEP de seringas preenchidas com a Solução ringer à cânula de entrada da sonda em cada animal e aguarde o aparecimento da gota líquida na ponta da tomada. Conecte a saída da sonda à tubulação FEP que leva à coleta no tubo de ensaio. Insira a tubulação FEP no tubo de ensaio fechado de 0,2 mililitro com uma tampa perfurada e certifique-se de que o tubo permaneça no lugar, fixando-o com um pedaço de argila de modelagem.

Depois de executar a bomba em dois microliters por minuto durante 60 minutos sem coletar amostras para equilibrar o sistema, colete cinco amostras consecutivas de dialise de 30 minutos sob condições básicas e armazene amostras no gelo. Após 10 minutos, troque a tubulação das seringas contendo a solução do ringer de potássio de 100 milialares para a solução normal do Ringer e deixe a bomba funcionar. Após a coleta do quinto dialiseto pós-equilíbrio, colete 20 frações de dialiseto microliter a cada 10 minutos durante uma hora.

Em seguida, colete três amostras adicionais de dialise de 30 minutos e pare a bomba. Por fim, armazene as amostras a menos 80 graus Celsius após o experimento até a análise do HPLC. Após a conclusão do experimento, enxágue as sondas de microdiálise usadas com água destilada e armazene-as em um frasco cheio de água destilada limpa até o próximo uso.

Finalmente, enxágue toda a configuração de microdiálise com água destilada seguida de 70% de etanol. Substitua o etanol por ar e armazene a configuração em um ambiente estéril. Estes são os traços representativos de EEG registrados a partir do hipocampo de controle e ratos epilépticos durante a fase crônica da doença.

Não foi observada alteração de EEG em ratos de controle, enquanto uma atividade epileptiforme paroxística sincronizada foi observada cerca de 500 milissegundos antes e durante as convulsões comportamentais em ratos epilépticos. A concentração de glutamato basal encontrada em ratos epilépticos crônicos foi significativamente maior do que em animais de controle. O potássio alto evocou uma liberação adicional de glutamato por cerca de 30 minutos em ratos de controle e por cerca de 60 minutos em ratos epilépticos crônicos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que os animais implantados com o dispositivo são propensos a perdê-lo ao longo de um curso de experimento prolongado, por isso use um conjunto de cabeça leve e cabos suficientemente longos para evitar interferir na mobilidade animal. Dependendo da disponibilidade de um ensaio analítico adequado, o método pode ser usado para testar diferentes moléculas solúveis no cérebro ao empregar o registro de EEG ao mesmo tempo. Após seu desenvolvimento, essa técnica permitiu aos pesquisadores do campo da epilépologia fornecer uma visão das alterações na neurotransmissão excitatória no caso de uma epilepsia do lobo temporal.

Depois de assistir a este vídeo, confiamos que você terá uma melhor compreensão de como realizar microdiálise in vivo juntamente com gravação de Eletrodo de profundidade EEG em um rato epiléptico em movimento livre.