Um método In Vivo para avaliar a barreira de sangue do intestino e metabolismo hepático da Microbiota produtos

A barreira intestinal-sangue é um sistema multicamadas que controla a passagem de nutrientes, metabólitos bacterianos, drogas e outros compostos exógenos do lúmen intestinal para a corrente sanguínea. Como sabemos, a integridade da barreira pode ser prejudicada no gastrointestinal, bem como em doenças cardiovasculares e metabólicas que podem resultar em acesso mais fácil de compostos biologicamente ativos, como metabólitos bacterianos intestinais à corrente sanguínea e podem afetar o funcionamento de todo o organismo. Portanto, a permeabilidade da barreira intestinal-sanguínea pode ser um marcador de doenças intestinais e extraintestinal.

Neste vídeo, apresentamos uma medição direta da permeabilidade da barreira intestinal-sangue em ratos usando amostragem de sangue portal após a administração de uma substância de teste para o trato digestivo. Descrevemos em detalhes a categorização da veia portal e da veia inferior cava logo acima da confluência venosa hepática. A amostragem sanguínea da veia portal e da veia inferior cava permite avaliar não apenas a permeabilidade da barreira intestinal-sangue, mas também uma via de liberação hepática e absorção de moléculas de interesse, como metabólitos de bactérias intestinais ou medicamentos.

Este método praticamente não é influenciado pela função hepática e renal e preserva o fluxo sanguíneo intestinal que é uma forte vantagem sobre métodos in vivo e in vitro comumente usados. Os animais devem jejuar durante a noite antes do procedimento. Realizar todos os procedimentos durante a anestesia geral.

Animais são eutanizados após o experimento. Nosso procedimento começa com a inserção da linha para administração intraintestinal. Aqui propomos a administração intracolônica do marcador.

Talvez seja modificado pela administração em vários níveis de trato digestivo. Por exemplo, estômago ou duodeno. No entanto, leve em conta a velocidade variável da peristalse e possíveis interações com enzimas e ácidos gástricos enquanto administra um marcador em partes superiores do trato gastrointestinal.

Use cateter foley pediátrico tamanho 10 F ou 8 F como cateter colonico. Marque o cateter para indicar a parte que será inserida no cólon de aproximadamente oito centímetros. Verifique a região anal e a contagem das fezes no reto antes de inserir o cateter no cólon.

Se as fezes estiverem presentes, esvazie o reto massageando a área retal. Coloque um lubrificante ao longo do cateter. Em seguida, umedeça o ânus e seus arredores com um lubrificante.

Insira o cateter com um fio-guia através do esfíncter anal externo. Faça movimentos lentos para frente, para trás e circulares. Continue verificando a localização do cateter por palpação abdominal enquanto insere o cateter.

O próximo passo é o cateterismo inferior da veia cava. Você pode pular este procedimento em estudos de permeabilidade intestinal. Tente sentir o pulso na artéria femoral e corte a pele longitudinalmente pelo comprimento de cerca de dois centímetros no lugar onde o pulso é palpável.

Disseca a fáscia e os músculos para visualizar o feixe neurovascular. Em seguida, disseque a veia femoral do feixe neurovascular. Primeiro os nervos, depois a artéria femoral e depois a veia.

Tenha cuidado durante a dissecação do feixe, pois vários ramos minúsculos da veia femoral podem ser facilmente danificados. Em seguida, coloque duas ligaduras na veia femoral. Não amarre os nós ainda.

Pegue as extremidades da ligadura proximal com um suporte de agulha. Em seguida, puxe cuidadosamente as extremidades da ligadura com o suporte para cima para fechar a parte proximal da veia. Espere até que a veia esteja cheia de sangue e amarre o nó distal.

Em seguida, faça uma pequena incisão na veia entre o nó e a ligadura proximal usando tesoura microcirúrgica. Em seguida, insira o cateter usando pinças ou uma agulha com uma extremidade curva como fazemos no vídeo. Fure a veia e use a ponta dobrada da agulha como guia para o cateter.

Solte a ligadura proximal ao inserir o cateter. Insira o cateter por aproximadamente seis a sete centímetros, dependendo do tamanho de um animal para colocar a ponta proximal do cateter na veia cava inferior logo acima da confluência venosa hepática. A colocação adequada do cateter deve ser confirmada após o experimento.

Fixar o cateter na veia femoral com dois nós cirúrgicos únicos. Amarre a ligadura proximal também. Verifique a patência do cateter tentando tirar sangue com uma seringa.

Enxágüe o cateter com 0,3 mililitros do soro fisiológico heparinizado. Feche a ferida cirúrgica com duas camadas de pontos simples. Agora vamos para o cateterismo venoso portal.

Prepare o cateter portal. Consiste em uma agulha, cateter de poliuretano flexível, ponta flexível de polietileno do cateter, plugue e ligadura. A primeira etapa do procedimento é realizar uma laparotomia midline.

Depois de preparar o campo de operação, corte a pele longitudinalmente do xiphoide do esterno até o umbigo. Corte os músculos da parede abdominal ao longo da linha branca. Em seguida, expanda o corte rostrally na forma y para que a cartilagem xifoide esteja entre dois cortes.

O próximo passo é a dissecação da veia portal. Primeiro, umedeça os cotonetes com soro fisiológico. E então exteriorizar o ceco, cólon ascendente e transversal, e laço intestino delgado.

Coloque os intestinos do lado esquerdo para expor a raiz da mesenteria. Cubra os intestinos com gaze umedecida com um soro fisiológico para protegê-los da secagem. Para expor a veia do portal mova cuidadosamente os lóbulos hepáticos para os lados ou para cima em direção ao diafragma com os cotonetes umedecidos.

Aqui podemos ver a veia portal e a veia mesentérica superior. Localize a parte da veia portal que não está coberta com o mesentery e passe a ligadura sob a veia portal. Para proteger os tecidos de danos, umedeça a ligadura com uma solução fisiológica salina.

Aperte com fórceps as extremidades da ligadura e aperte-a suavemente para estabilizar o vaso. Passe a parte mais longa da ligadura do cateter sob a parte livre da veia do portal e puxe-a para que o cateter esteja localizado ao lado da veia portal. Insira a agulha na veia mesentérica superior três milímetros abaixo da junção da veia mesentérica superior e da veia portal.

Segure a agulha em um ângulo de 30 graus e depois de entrar na veia reduza o ângulo e avance a agulha quase horizontalmente em paralelo à veia portal por um comprimento de aproximadamente seis a sete milímetros. Aplique uma ou duas gotas de cola tecidual no local onde a agulha está inserida. Remova os cotonetes que cobriram o fígado.

Depois, coloque os intestinos de volta à cavidade abdominal. Umedeça os intestinos com uma solução salina aquecida e cubra-o com uma gaze estéril umedecida. Verifique a patency do cateter e enxágue o cateter com soro fisiológico heparinizado.

Sangue venoso espontaneamente recua no cateter. Depois de cinco minutos verifique a cor dos intestinos e os movimentos peristálticos para garantir que o fluxo sanguíneo mesenérico adequado seja mantido. No final, feche a cavidade abdominal com três camadas de pontos exteriorizando a parte distal do cateter ao redor do umbigo.

Para coletar sangue da veia portal, abra o plugue do cateter portal e deixe o sangue fluir livremente. Use uma seringa e uma agulha cega e colete não mais do que 0,7 mililitros de sangue. Enxágüe o cateter com soro fisiológico heparinizado e feche o plugue do cateter.

Aqui apresentamos protocolos exemplares de amostragem de sangue portal para avaliação de permeabilidade intestinal. Amostras de sangue da veia cava inferior são necessárias para estudos de liberação hepática e absorção. Para coletar sangue da veia cava inferior proceda exatamente como ao tirar sangue da veia portal.

Aqui apresentamos um protocolo de amostragem de sangue exemplar para medição de desembaraço hepático e para o rastreamento da via sanguínea-hepática-sistêmica do portal intestinal de compostos selecionados. Em nossos estudos usamos um metabólito bacteriano, trimetilamina como marcador de permeabilidade. No entanto, muitas outras substâncias, incluindo marcadores de permeabilidade de classe, também podem ser usadas.

Várias bactérias e metabólitos e tratos também podem ser usados para tratar a via de absorção ou a liberação hepática. Remova o fio-guia e infle o balão usando volume adequado de água estéril geralmente um mililitro, mas verifique realmente o tamanho do balão antes da inserção. O diâmetro do balão não deve exceder um centímetro.

Coloque a cabeça do rato para baixo para minimizar o risco de saída da solução administrada a partir do cólon. Administre lentamente a substância testada usando porta de drenagem e cateter colonic. Utilizamos trimetilamina em uma dose de 100 miligramas por quilograma de peso corporal dissolvido em 0,7 mililitros de soro fisiológico.

Depois de 10 minutos esvaziar o balão do cateter. O despejo hepático compreendido como uma extração hepática pode ser expresso pela diferença entre concentração sanguínea portal e concentração sanguínea de vena cava inferior ou pela razão de veia cava inferior e concentração sanguínea portal. Medimos com sucesso a permeabilidade da barreira intestinal e o despejo hepático da trimetilamina em ratos.

Aqui estão os resultados representativos que demonstram que os ratos hipertensos aumentaram a permeabilidade do cólon ao TMA em comparação com ratos normotensos. Em outra pesquisa, estudamos se a alta ingestão de sal afeta a permeabilidade da barreira intestinal e o despejo hepático da trimetilamina. A administração intracolônica da trimetilamina produziu um aumento significativo na concentração de TMA sanguíneo portal.

O tamanho do aumento e a liberação hepática foram semelhantes entre os grupos. Também rastreamos a via de absorção de ácidos graxos de cadeia curta. Medimos a concentração em fezes, sangue portal e sangue periférico.

Neste vídeo, descrevemos um protocolo abrangente que inclui a medição direta da permeabilidade da barreira intestinal-sangue in vivo que, ao contrário dos métodos comumente utilizados, não é afetada por funções hepáticas e renais, medição de liberação hepática e, terceiro, avaliação da via de absorção de compostos exógenos. A técnica apresentada pode ser ajustada a outros fins experimentais. Por exemplo, aferição de pressão arterial do portal ou administração de medicamentos diretamente para a veia portal.