Name: Separação de espinafre tilacoides complexos de proteínas por eletroforese em Gel verde nativo e caracterização de banda usando contagem de fóton único Time-Correlated (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprenda a separar complexos de tilacoides de espinafre por eletroforese em gel verde nativo e caracterizá-los com TCSPC. Este método rápido permite análise em um único dia, revelando conexões energéticas essenciais para a pesquisa em fotossíntese.

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Financiamento e apoio foram fornecidos pelo departamento de química da Universidade de estado de Michigan.

1. as soluções preparação para despejar géis verdes nativas
<ol><li>Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para a resolução de géis, consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 8.3.</li>
	<li>Prepare uma solução tampão concentrado de 4x para empilhamento géis consistindo de 40% de glicerol, glicina de 200 mM e 100 mM Tris-tamponada de pH 6.3.</li>
	<li>Armazene esses buffers a 4 ° C para evitar o crescimento de mofo. Nota: Os buffers são estáveis por meses a 4 ° C, para que preparação de 100-200 mL de cada buffer para uso contínuo é recomendada.</li>
	<li>Preparar 1 L de 10x executando o buffer que contém 250 mM Tris HCl pH 8,3, glicina de 1,92 M e 1% SDS. Loja a 10 x execução reserva sobre a bancada.</li>
</ol>2. solução preparação para isolamento e solubilização de contém
<ol><li>Preparar 100 mL de tampão de homogeneização de TMK contendo tampão de 50 mM Tris (pH 7), 10 mM MgCl2e 10 mM KCl e armazenar a 4 ° C. Nota: Este é o buffer principal para homogeneização e manipulação de amostras de tilacoides. Como alternativa, soluções estoque concentradas podem ser preparadas e diluídas conforme necessário (tampão Tris, MgCl2e KCl podem todos ser facilmente armazenados sobre a bancada como concentrados de 1 M).</li>
	<li>Prepare soluções estoque de tilacoides os detergentes de solubilização, B-decílico maltoside (DM) e n-octil-B-d-glicosídeo (OG), dissolvendo cada detergente no buffer TMK em 20% w / v. congelar a-20 ° C em alíquotas de 1 mL.</li>
	<li>Prepare o tampão de solubilização de tilacoides (SB), que é também o amortecedor do carregamento da amostra.<ol>
<li>Primeiro, faça TMK-glicerol tampão combinando 7 mLs de buffer TMK e 3 ml de glicerol.</li>
		<li>Para 800 μL de tampão de TMK-glicerol, adicione 100 μL de solução estoque DM e 100 μL de solução-mãe de OG. Guarde esta solução de trabalho de SB, contendo OG DM e 2% 2%, congelado a-20 ° C em alíquotas de 1 mL. Nota: Cada alíquota pode ser descongelada e recongelada, conforme necessário.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. derramando verdes Mini geles para uso posterior
<ol><li>Prepare-se separado de empilhamento e resolvendo gel de soluções em tubos de ensaio 15 mL descartáveis. Nota: Os volumes fornecidos são suficientes para um único gel mini usando espaçadores de chapa de 1,5 mm.<ol>
<li>Para fazer a solução de gel de empilhamento, combine 1,25 mL de 4 x 3,25 mL de água para dar 5 mL de 4% do acrilamido em tampão de empilhamento 1x, 0,5 mL da solução de 40% (39.1 C) acrilamida e buffer de gel de empilhamento. Para fazer o gel de resolução solução combine 1,875 mL de 4x resolvendo buffer, 0,94 mL da solução de 40% (39.1 C) acrilamida e 4,7 mL de água para dar 7,5 mL de acrilamida 5% em 1x solução tampão.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Despeje o gel de resolução.<ol>
<li>Adicionar 50 μL de persulfato de amónio de 10% (APS) para a solução de gel de resolução, em seguida, adicionar 10 μL de TEMED, tampa do tubo e inverta suavemente várias vezes para misturar. Imediatamente despeje a solução de gel entre as placas de gel, deixando aproximadamente 1 cm entre o topo da parte inferior dos dentes pente para o gel de empilhamento e gel de resolução.</li>
		<li>Delicadamente, Pipete 100% de etanol na parte superior do gel resolução ao nível do gel. Nota: Se o gel não definir dentro de 15min, solução fresca de APS deve ser feita e/ou TEMED novo deve ser usado.</li>
		<li>Depois que o gel tem polimerizado (a interface entre o gel e o etanol será facilmente visível e não se moverá quando o gel é derrubado), deite fora o etanol e o borrão com um papel absorvente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Despeje o gel de empilhamento.<ol>
<li>Adicionar 25 μL de 10% APS para a solução de gel de empilhamento, adicionar 5 μL de TEMED, então cap e invertido para misturar da mesma maneira como o gel de resolução. Despeje a solução de gel em cima do gel de resolução até o espaço entre as placas é completamente preenchido e inserir um pente 10-bem. Nota: Quando estiver pronto para ser usado, retirar o pente do gel e lavar os poços com água, certificando-se que os poços estão em linha reta e desobstruídas pelo gel. O gel pode ser armazenado com o pente no lugar a 4 ° C pelo menos vários dias.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. isolamento das membranas tilacoides bruto de espinafre folhas
Nota: Todas as etapas devem efectuar no gelo usando buffers e equipamento pre-refrigerado. Iluminação fraca também é recomendada. Dependendo do critério do experimentador e os processos biológicos, sob estudo, inibidores de protease e/ou fosfatase devem ser adicionados fresco aos buffers TMK antes de homogeneização.
<ol><li>Homogeneizar completamente as folhas de espinafre no buffer TMK com um vidro homogenizacao homogenizador. Nota: Aproximadamente 1 a 2 mL de tampão é normalmente suficiente para uma folha de espinafre pequeno bebê. Uma folha de espinafre único bebê geralmente pode fornecer material suficiente para carregar vários poços em um gel mini 1,5 mm.</li>
	<li>Filtre o homogenate folha crua para remover os resíduos insolúveis.<ol>
<li>Para fazer um simples dispositivo de filtragem, cortar uma delicada tarefa limpar na metade e dobre-o em quartos. Embale a delicada tarefa de limpeza na parte inferior de uma seringa descartável de 5ml e pre-molhado o wipe com buffer TMK.</li>
		<li>Utilize o êmbolo da seringa para premir buffer excesso de fora a limpeza delicada tarefa e certifique-se de que o filtro de limpeza é pressionado firmemente no fundo da seringa após o êmbolo é removido.</li>
		<li>Pipetar o homogenate de folha para o centro do filtro Limpe e utilize o êmbolo para passar o homogenate através do filtro. Recolha o filtrado homogeneizado em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugue o homogenate a 5.000 x g durante 10 minutos a 4° C para material insolúvel, incluindo membranas tilacoides de Pelotas. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 1 mL de tampão TMK.</li>
	<li>Normalize a quantidade de clorofila em cada amostra, ajustando o volume de cada amostra de tilacoides ressuspensão para que cada amostra contém a mesma quantidade total de clorofila, conforme descrito abaixo. Nota: Isto irá permitir que cada amostra a ser solubilizado no mesmo volume de detergente e minimiza a variabilidade na solubilização, devido a diferenças no volume de sedimento.<ol>
<li>Para extrair a clorofila de cada amostra das membranas tilacoides ressuspensão, pegue um 50 μL alíquota em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL e adicionar 950 μL de metanol para ele. Tampe o tubo e misturar várias vezes por inversão.</li>
		<li>Centrifugue o extrato metanol/clorofila a 10.000 x g por 10 min para proteínas precipitadas de Pelotas.</li>
		<li>Determine a concentração de clorofila do pigmento contendo sobrenadante de acordo com Porra et al. 23. fazer leituras de absorvância em 652 e 665 nm utilizando um espectrofotômetro e uma cubeta de 1 cm. Determine a concentração de clorofila total usando a equação abaixo: Jefferson costa um + b (μg/mL) = 22,12 (Abs 652 nm) + 2,71 (Abs 665 nm)</li>
		<li>Usando medições de concentração de clorofila como um guia, remover e descartar algum volume de cada amostra, conforme necessário, para que cada tubo contém a mesma quantidade total de clorofila.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Re-pelotas membranas tilacoides por centrifugação a 5.000 x g durante 10 min. remover e descartar o sobrenadante. Tenha cuidado para remover o sobrenadante todos sem qualquer a pelota por aspiração.</li>
</ol>5. solubilização das membranas tilacoides de carga de géis nativos
<ol><li>Descongelar uma alíquota do TMK 30% glicerol solução de detergente (SB) e inverter várias vezes para misturar. Mantê-lo no gelo.</li>
	<li>Dissolva a pelota de tilacoides, adicionando o volume apropriado de SB para dar uma concentração de clorofila de 1 mg/mL. Nota: Esta concentração é um ponto de partida para encontrar as condições de solubilização ideal, que devem ser determinadas empiricamente. A concentração de clorofila deve ser mantida a mesma entre as amostras para permitir comparações válidas ser feita.</li>
	<li>Pipete acima e para baixo várias vezes ao mesmo tempo tendo o cuidado de evitar a formação de espuma da amostra. Manter-se no gelo para permitir que as amostras de tilacoides solubilizar. Nota: Solubilize pelo menos 10 minutos. Tempo de solubilização deve ser longo o suficiente para que a diferença de tempo de solubilização entre amostras é minimizada. Exemplo: 3 minutos forem necessários para solubilizar todas as amostras, então cerca de 30 minutos deve ser permitidos para solubilização.</li>
	<li>Centrifugue solubilizado contém a 10.000 x g a 4 ° C para granular material insolúvel. Nota: Solubilizado tilacoides amostras são estáveis no gelo por horas, mas armazenamento a-70 ° C deve ser evitado, como ciclos de congelamento e descongelamento podem resultar em perda de bandas megacomplex.</li>
</ol>6. separação de tilacoides solubilizado proteínas por eletroforese em Gel de nativo
<ol><li>Carrega o sobrenadante de tilacoides solubilized preparado no passo 5.4 diretamente sobre o gel nativo preparado anteriormente. Para um gel de 1,5 mm, carrega 15 μL de tilacoides solubilizado por bem.</li>
	<li>Funcione o gel verde nativo essencialmente da mesma maneira como geles de SDS-PAGE usando 1x tampão em execução. Funcione o gel a 100 V e coloque o reservatório de gel de toda sobre o gelo molhado para a duração do percurso para mitigar o aquecimento resistivo do gel. Nota: O gel deve exigir cerca de 2 horas para o pigmento livre na parte dianteira de migração para atingir o fundo do gel (Figura 1).</li>
</ol>7. excisão de tilacoides complexo bandas de géis verdes nativas
Nota: Excisão da banda específica de interesse do gel é necessário para permitir que a banda para ser colocado no caminho do feixe e evitar vadio fluorescência de complexos nas proximidades sendo coletados.
<ol><li>Retire o gel da célula de eletroforese e enxágue executando o tampão com as placas de gel com água destilada. Remover a placa superior do gel e lave o gel com água destilada.</li>
	<li>Manter o gel sobre a placa de vidro inferior e coloque o gel e a placa no gelo. Quando não estiver em uso, mantenha o gel no escuro e cubra com um filme plástico para evitar sequem.</li>
	<li>Com o gel restante na placa de vidro, impostos especiais de consumo cada banda de interesse quando estiver pronto para análise TCSPC. Impostos especiais de consumo bandas limpa com um bisturi afiado ou lâmina de barbear e cuidar para que a banda extirpada não contém nenhum material contaminante de banda.</li>
</ol>8. coleção de espectros de fluorescência de estado estacionário de temperatura
<ol><li>Para cada complexo que será analisado pelo TCSPC, um espectro de fluorescência de temperatura é tomado entre 600 e 800 nm utilizando um espectrômetro de fluorescência. Nota: O comprimento de onda de excitação usado para coletar este espectro deve coincidir com o comprimento de onda usado para TCSPC.</li>
</ol>9. TCSPC das bandas de Gel verde
Nota: Consulte a Figura 2 para uma descrição da instalação do TCSPC.
<ol><li>Sanduíche a fatia de gel entre duas lâminas de microscopia. Use fita adesiva, colocado em cada extremidade de um dos slides microscopia e dobrado várias vezes, para criar os espaçadores para que os slides possam realizar juntos firmemente sem comprimir a fatia de gel. Nota: Isto irá criar um caminho para o feixe de laser passar entre as lâminas de microscópio e através da fatia de gel.</li>
	<li>Adicione uma pequena quantidade de água para a fatia de gel na borda das lâminas de vidro para criar uma interface suave que irá reduzir a dispersão do sinal.</li>
	<li>Braçadeira do gel de diapositivos de sanduíche no caminho do feixe para que o feixe coincida com o gel de cortar a borda aberta das placas, permitindo a emissão de fluorescência ser através das lâminas de vidro em que o gel é imprensado, perpendicular ao percurso do feixe. Nota: O comprimento de onda de excitação utilizado dependerá da experiência. Comprimento de onda de 435 nm vai animar tanto clorofila a e clorofila b, enquanto 465 nm preferencialmente excitará clorofila b. Neste caso, 435 nm foi usado como o comprimento de onda de excitação.</li>
	<li>Colete 10.000 pontos de dados em intervalos regulares em todo o espectro de emissão de fluorescência para cada complexo. Por exemplo, coletar dados cada 10 nm, começando a 680 nm e terminando em 750 nm. Nota: Prepare várias bandas de gel para cada complexo a ser estudado para que aquela amostra fresca está disponível caso o fotobranqueamento impede a coleta de sinal adequada.</li>
</ol>10. TCSPC (análise de dados)
<ol><li>Para um determinado complexo, primeiro normalize a altura de cada curva de decaimento para todos os comprimentos de onda coletadas. Nota: Este passo não é necessário para a construção de Souza mas permite curvas de decaimento ser sobreposto e comparado visualmente com o outro como uma primeira inspeção dos dados.</li>
	<li>Cauda-correspondência de cada curva de decaimento para o espectro de fluorescência de estado estacionário do complexo conforme descrito abaixo.<ol>
<li>Escolha um Commit depois que o sinal de decadência tem espalmadas, geralmente após alguns nanossegundos.</li>
		<li>Para cada comprimento de onda, normalizar a curva de decaimento para que a intensidade de sinal no Commit selecionado é igual ao valor do espectro de fluorescência do estado estacionário que comprimento de onda (ou seja, os valores de todos os comprimentos de onda juntos no Commit selecionado Re-criar o espectro de fluorescência de estado estacionário).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construa a decadência-associar espectros (DAS) de curvas de decaimento de cauda-combinados, conforme descrito abaixo.<ol>
<li>Usando dados de pontos de curvas de decaimento de cauda-combinadas construir uma série de parcelas graficamente a intensidade de fluorescência vs. comprimento de onda em intervalos regulares (por exemplo, cada 10 ps). Por exemplo, a no 50 ps é construída traçando-se o valor de cada curva de decaimento no 50 ps vs. comprimento de onda.</li>
		<li>Sobreposição de todos os espectros de decaimento-associados para criar uma trama de estilo cascata que mostra a decadência do espectro de fluorescência ao longo do tempo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Um nativo gel executar e solubilização de tilacoides bem sucedida resultará na resolução de várias bandas de verdes visíveis distintas sobre o gel sem distorção significativa ou manchas das bandas. Sobrecarga do gel, uma alta concentração de detergente, um pH de amostra incorreta, não dissolvido material, executando o gel muito rapidamente ou a uma temperatura muito alta, e um gel impropriamente derramado são todos os fatores que podem contribuir para complexos de tilacoides mal resolvido. Otimizar as condições do gel em...

Organismos fotossintéticos constantemente devem ajustar sua fisiologia para mudanças nas condições ambientais para maximizar sua produtividade e competir com sucesso com os vizinhos,1. Isto é especialmente verdadeiro para a maquinaria responsável para as reações de luz da fotossíntese, como luz ambiente condições podem flutuar por três ordens de magnitude entre as sombras e a luz do sol. Além disso, fatores ambientais como estresse de calor, frio ou seca podem reduzir a disponibilidade de dióxido de carbono para a fixação de carbono, que é o coletor de elétrons naturais para os produtos das reações luz. Plantas devem, portanto, colher e utilizar radiação solar de forma mais eficiente possível, mantendo a capacidade de dissipar a energia da luz em excesso, se necessário. Enquanto photooxidative dano ainda ocorre rotineiramente sob todas as condições de luz2,3, falha para gerenciar a energia absorvida da excitação com êxito pode levar a célula catastrófico dano e morte. Vários mecanismos adaptativos existem que permitem que o aparato fotossintético a ser afinado para mudanças nas condições ambientais prevalecentes e flutuações transiente (ou seja, em escalas de tempo longas e curtas)4. Estes incluem a resposta a longo prazo (LTR) e não-fotoquímica têmpera (NPQ). NPQ é considerado para abranger pelo menos três outros fenômenos de componente, incluindo transições de estado (qT), energia rapidamente inducible têmpera (qE) e Fotoinibição (qI)5.
Estes processos foram originalmente observados e definidos em grande parte em termos de fenômenos espectroscópicos [por exemplo, NPQ refere-se a uma gota na fluorescência de clorofila observados (têmpera da fluorescência da clorofila) que não é devido a um aumento da taxa de fotoquímica]6. O termo "transições de estado" da mesma forma se refere a mudança observada no montante relativo de fluorescência da PSI e do FSII7. Enquanto as técnicas espectroscópicas que tornaram possível a enumeração destes fenómenos [em particular, amplitude de pulso modulada espectroscopia de fluorescência (PAM)] e continuar a ser um meio vital para a observação e dissecando processos fotossintéticos em vivo, uma grande quantidade de bioquímica é necessário para elucidar os mecanismos subjacentes a estas observações espectroscópicas. Transições de estado, por exemplo, envolve um ciclo de fosforilação/desfosforilação de proteínas LHCII pelo STN7 quinase e fosfatase TAP38/PPH1, respectivamente,8,9,10. Este ciclo ajusta a distribuição física da antena LHCII entre as dois fotossistemas movendo uma porção de trímeros LHCII do FSII para PSI, alterando assim a absorção de secção transversal dos fotossistemas11,12. O componente qE de NPQ rapidamente converte energia de excesso de excitação em calor através das acções do ciclo de epoxidação/de-epoxidação violaxantina/zeaxantina e a proteína PsbS. O papel exato do PsbS neste processo é que ainda não foi totalmente compreendido13. O componente de qI de NPQ, Fotoinibição, é geralmente atribuído a danos à proteína D1 do FSII. Restauração de competência total fotossintética requer um processo de reparação elaborado para corrigir danificados do FSII photocenters. O ciclo de reparação do FSII envolve a migração de complexos do FSII fora as pilhas granal, desmantelamento dos complexos, substituição de proteínas danificadas de D1, remontagem dos complexos do FSII e movimento de complexos do FSII volta para as pilhas granal14. A natureza exata do Fotoinibição e do FSII Fotodano continua a ser um objecto de intenso escrutínio15.
A dificuldade em estudar fenómenos como o estado faz a transição ou reparação do FSII surge, em parte, do fato de que há não uma maneira simples de visualizar a mecânica de sistemas bioquímicos complexos. A abordagem clássica de bioquímica para o entendimento de um processo é primeiro separar seus componentes para que eles podem ser caracterizados em isolamento. Eletroforese em gel de nativo surgiu de esforços bem sucedidos na década de 1980 para separar e caracterizar os complexos de fotossistema de membranas tilacoides com mais métodos preparativa (centrifugação gradiente de sacarose e cromatografia)16. Os detergentes sistemas desenvolvidos para solubilizar suavemente os complexos nativos de membranas tilacoides logo foram adaptados para métodos de separação eletroforética, mais notavelmente por Allen e Staehelin17 e e Pedro e Thornber18, dando origem a eletroforese em gel verde nativo. Enquanto representando apenas um fora de uma variedade de técnicas no arsenal experimental, nativo de página tem um número de características atraentes que a tornaram um método muito utilizado em pesquisas de fotossíntese. PÁGINA nativa é relativamente rápido e simples, que requerem equipamento pouco especializado, proporcionando simultaneamente uma separação de alta resolução de um grande número de complexos de tilacoides. Isso faz o nativa página uma ferramenta conveniente para estudar a dinâmica de tilacoides e, quando combinado com página padrão na segunda dimensão, bem como uma variedade de sistemas tampão e detergente, um sistema versátil para localizar e caracterizar novos complexos de tilacoides.
Dito isso, géis verdes nativos teve uma reputação de ser uma técnica não-confiável, especialmente em mãos inexperientes, como é fácil produzir maus resultados consistindo de géis fuzzy, manchadas com poucas bandas. Este problema foi resolvido, em parte, com a introdução do azul-nativo página19. O uso de tintura de coommassie no sistema de reserva BN faz separação de proteína mais robusto. Portanto, BN-página é frequentemente uma técnica mais fácil e mais confiável para um novato relativo para configurar e pode fornecer separações de alta resolução de complexos de tilacoides. Por estas razões, BN-página tornou-se o método de escolha para a maior parte do trabalho deste campo. Enquanto BN-PAGE é geralmente mais lento funcionar do que a electroforese do gel verde, sua principal desvantagem é que a coloração de tintura coommassie interfere com a identificação das bandas fracas contendo clorofila, respeitando também a jusante espectroscópicas caracterização problemática.
Fornecer as informações bioquímicas géis nativos e SDS-PAGE 2D pode ser grandemente reforçada quando combinados com dados de técnicas espectroscópicas. Independentemente do sistema utilizado, com o uso de géis nativos para identificar complexos, um problema central é que a identificação sempre pode ser contestada (i.e., as proteínas encontradas em uma banda poderia sempre representam comigrating complexos ou componentes, prefiro do que um complexo único fisiologicamente autêntico). Caracterização espectroscópica fornece informações biofísicas sobre os pigmentos nas bandas de gel verde e pode ser usada para determinar quais tipos de complexos são susceptíveis de conter. Fluorescência da clorofila é especialmente útil a este respeito devido ao frequentemente dramàtica diferentes espectros e vidas de fluorescência que são característicos de complexos diferentes pigmentos fotossintéticos-proteína. Enquanto os espectros de fluorescência simples estado estacionário 77K têm sido historicamente útil em confirmar as identidades dos complexos de gel de nativo, moderno tempo-correlacionados fotão contando (TCSPC) pode fornecer muito mais informações. TCSPC permite não só a caracterização dos complexos com base no tempo de vida de fluorescência, mas também torna possível a descrição detalhada de transferência de energia entre os componentes espectrais dentro de um complexo. Este tipo de caracterização está se tornando cada vez mais necessário, como o uso de várias páginas espelhadas de sistemas gel nativo e novos complexos putativos são descobertos, permitindo a identificação de complexos de proteínas para melhor ser autenticado e fornecendo novos biofísicas informações sobre como funcionam estes complexos.
Neste artigo, nós fornecemos um método que permite que aqueles que têm pouca ou nenhuma experiência com eletroforese em gel de nativo para obter uma resolução de alta qualidade de complexos de tilacoides nativa com a finalidade de investigar a mecânica das reações de luz fotossíntese. Esta técnica básica então pode ser aumentada a critério do experimentador para melhorar os resultados ou estender a aplicabilidade de outras espécies. Em seguida descrevemos o processo para submeter gel verde nativo bandas TCSPC, bem como algumas etapas para análise básica e apresentação dos dados fornecidos pela técnica. O acoplamento da electroforese do gel de nativo com análise TCSPC estende a utilidade destes sistemas de gel, fornecendo autenticação e biofísica caracterização de complexos de proteínas dentro das bandas. O sistema do gel verde aqui descrito se baseia que desenvolvido por Allen e Staehelin17 com algumas modificações e é o mesmo usado em Schwarz et al. 20. este sistema é um dos muitos, mas tem características específicas que são úteis para esta metodologia. É rápida o suficiente para que o isolamento de tilacoides, eletroforese em gel e análise TCSPC conveniente podem ser realizadas em um dia, prevenindo possíveis problemas de degradação e armazenamento de amostra. Encontramos, também, que este método é robusto nas mãos de usuários inexperientes, enquanto continua a fornecer resultados que variam de boa a superior, dependendo do grau de otimização.
É importante ter em mente que os complexos visualizados em um gel nativo dependem sobre o detergente e o buffer de sistemas utilizados, bem como sobre a biologia do organismo sob investigação. Sistemas diferentes de detergente e buffer preferencialmente separam os diferentes tipos de complexos, e um determinado organismo fotossintético terá diferentes complexos de outros organismos, não os quais estarão presentes sob qualquer circunstância. O sistema descrito aqui é particularmente adequado para o estudo da PSI megacomplexes, conforme descrito em Schwarz et al. 20, mas cai na extremidade mais desestabilizador do espectro para quem está estudando megacomplexes do FSII. Para um estudo abrangente dos diversos sistemas de detergente e tampão usada em eletroforese em gel nativa das proteínas de tilacoides, é aconselhável rever Järvi et al. 21 e Rantala et al 22.

<table><tbody><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>#648310</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Decil Maltosídeo</td><td>Sigma</td><td>D7658</td><td>n-decil beta d maltopiranosídeo, não dodecil maltosídeo ou alfa decil maltosídeo</td></tr><tr><td>Octil Glicosídeo</td><td>Sigma</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Solução de 37,5/1 C a 40%</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioRad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>BioRad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr></tbody></table>

separação de espinafre tilacoides complexos de proteínas por eletroforese em gel verde nativo e caracterização de banda usando contagem de fóton único time-correlated

Separation of Spinach Thylakoid Protein Complexes by Native Green Gel Electrophoresis and Band Characterization using Time-Correlated Single Photon Counting

As reações de luz da fotossíntese são realizadas por uma série de complexos de proteínas pigmentadas nas membranas tilacoides. A estequiometria e organização destes complexos é altamente dinâmico no longo e escalas de tempo curto devido a processos que se adaptam a fotossíntese para mudanças nas condições ambientais (ou seja, não-fotoquímica têmpera, transições de estado e o resposta a longo prazo). Historicamente, estes processos têm sido descritos espectroscopicamente em termos de mudanças na fluorescência da clorofila, e espectroscopia continua a ser um método vital para o monitoramento de parâmetros fotossintéticos. Há um número limitado de maneiras em que a subjacente dinâmica complexa de proteínas pode ser visualizada. Aqui nós descrevemos um método rápido e simples para a separação de alta resolução e visualização dos tilacoides complexos, eletroforese em gel verde nativo. Este método é acoplado com tempo-correlacionados fotão contando para caracterização detalhada das propriedades de fluorescência da clorofila das bandas separadas no gel verde.

Resultados representativos para a electroforese do gel verde são apresentados na Figura 1. Pista 1 fornece um exemplo de resultados ideais para eletroforese em gel verde de espinafre contém, em que um número máximo de faixas verdes claras e nítidas é visível. Estes resultados são um pouco atípicos, em parte porque não todas as bandas que vi na pista 1 estão normalmente presentes em uma determinada amostra. Limpeza da amostra adicional, sob a forma de isolamen...

Aqui nós apresentamos um protocolo para complexos de tilacoides solubilizado, separadas por eletroforese em Gel de verde nativo. Bandas de gel verde posteriormente são caracterizadas por tempo correlacionados Single Photon contagem (TCSPC) e etapas básicas para análise de dados são fornecidas.

Separação de espinafre tilacoides complexos de proteínas por eletroforese em Gel verde nativo e caracterização de banda usando contagem de fóton único Time-Correlated

The light reactions of photosynthesis are carried out by a series of pigmented protein complexes in the thylakoid membranes. The stoichiometry and ...

Este método é útil para responder a certas perguntas-chave no campo da pesquisa da fotossíntese, como se os complexos putakoóides fisiologicamente reais com componentes energeticamente conectados? A principal vantagem do gel verde e do protocolo TCSPC descrito aqui é que ele é rápido e robusto. As amostras podem ser facilmente processadas e analisadas em um único dia, tornando as questões de armazenamento e estabilidade menos preocupantes.Embora o TCSPC possa fornecer informações sobre os sistemas fotossintéticos que estudamos aqui, ele também pode ser aplicado a outros sistemas que vão desde químicos até físicos e biológicos, como estudos de movimento molecular fluorescente em líquidos, células ou motivos estruturais novos, como camadas monomoleculares e líquidos iônicos. Para iniciar este procedimento, prepare as soluções de estoque necessárias e mini géis verdes conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, obtenha um pouco de gelo e apague as luzes.Usando um homogeneizador do Dounce de vidro, homogeneize completamente as folhas de espinafre em aproximadamente um a dois mililitros de tampão TMK. Para criar um simples dispositivo de filtragem, corte uma tarefa delicada ao meio e dobre-a em trimestres. Remova o êmbolo de uma seringa e, em seguida, embale a tarefa dobrada limpe na parte inferior da seringa.Pipetar a folha homogeneizar-se no centro do filtro de limpeza de tarefas, em seguida, use o êmbolo para passar o homogeneizar através do filtro e colecioná-lo em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugar o homogeneizar a 5.000 g e quatro graus Celsius por 10 minutos para pelotar o material insolúvel, incluindo as membranas de tirokoide. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em um mililitro de tampão TMK.Para extrair clorofila de cada amostra, pegue uma alíquota de 50 microliter e transfira-a para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Adicione 950 microliters de metanol, tampa o tubo e misture invertendo-o várias vezes. Centrifugar a 10.000 g por 10 minutos para pelotar as proteínas precipitadas.Utilizando as medidas de concentração de clorofila como guia, remova e descarte algum volume de cada amostra conforme necessário até que cada tubo contenha a mesma quantidade total de clorofila. Centrifugar a 5.000 g por 10 minutos para re-pelotar as membranas de tirokoóide. Remova e descarte o supernasce, tomando cuidado para remover todo o supernatante sem perturbar a pelota.Primeiro, descongele uma alíquota de solução de detergente TMK 30%glicerol. Inverta várias vezes para misturar e manter a solução no gelo. Adicione um volume apropriado da solução de detergente para dissolver a pelota e resultar em uma concentração final de clorofila de um miligrama por mililitro.Pipeta para cima e para baixo repetidamente enquanto é cuidadoso para evitar espumar na amostra. Em seguida, mantenha a amostra no gelo para permitir que as amostras de tiroakoide solubilizem. Após a solubilização completa, centrifugar a amostra a 10.000 g e quatro graus Celsius por 10 minutos para pelotar o material insolúvel, resultando em um supernatante verde claro e escuro.Depois disso, carregue 15 microliters de supernanato de tirokoide solubilizado diretamente em cada poço de um gel nativo de 1,5 milímetros previamente preparado. Usando tampão de corrida 1X, comece a executar o gel verde nativo a 100 volts. Coloque todo o tanque de gel em gelo molhado durante a corrida para mitigar o aquecimento resistivo.Quando o gel terminar de funcionar, remova-o da célula de eletroforese e enxágue o tampão de corrida das placas de gel com água destilada. Retire a placa superior do gel e enxágue o gel com água destilada. Coloque o gel, que ainda está na placa de vidro inferior, no gelo;quando o gel não estiver em uso, cubra-o com plástico e mantenha-o no escuro para evitar que ele seque.Em seguida, use um bisturi afiado ou lâmina de barbear para extirpar cada faixa de interesse quando estiver pronto para prosseguir com a análise TCSPC. Certifique-se de que a banda excised não contém material de banda contaminante. Para cada complexo analisado, use um espectrômetro fluorescente para fazer um espectro fluorescente de temperatura ambiente entre 600 e 800 nanômetros.Coloque fita adesiva em cada extremidade dos slides e dobre-a várias vezes para criar espaçadores, o que permitirá que os slides sejam mantidos juntos firmemente sem comprimir o espaço entre eles, em seguida, sanduíche a fatia de gel entre dois slides de microscopia de vidro. Adicione uma pequena quantidade de água à fatia de gel na borda dos slides de vidro para criar uma interface lisa que reduzirá a dispersão de sinais. Em seguida, aperte o sanduíche de gel no caminho do feixe para que o feixe atinja a fatia de gel através da borda aberta das placas.Para cada complexo, colete 10.000 pontos de dados totais em intervalos regulares em todo o espectro de emissões de fluorescência. Para analisar os dados para um determinado complexo, primeiro normalizar a altura máxima de cada curva de decomposição para todos os comprimentos de onda coletados, em seguida, a cauda corresponde a cada curva de decaimento ao espectro de fluorescência de estado constante do complexo, conforme descrito no protocolo de texto. Resultados representativos para a eletroforese de gel verde fornecem um exemplo de um resultado ideal para a análise de timilarias de espinafre, onde uma série de faixas verdes claras e afiadas são visíveis.As faixas 2 e 3 apresentam resultados mais típicos do simples isolamento da tireilaboida e da eletroforese em um gel de acrilamida não gradiente de 5%. As faixas 4, 5 e 6 fornecem um exemplo de resultados ruins devido ao aumento dos graus de solubilização da amostra de tirokoide, enquanto a faixa 7 demonstra os resultados que podem ser alcançados quando os tiroxilarias arabidopsis são usados em vez de espinafre. Depois que as curvas de dados dos dados do TCSPC foram definidas para o mesmo registro de tempo, elas podem ser normalizadas para a mesma altura máxima, o que permite que as curvas sejam comparadas como uma primeira análise dos dados.Curvas de decadência normalizadas de diferentes complexos podem então ser sobrepostas umas com as outras em um determinado comprimento de onda, permitindo que as diferenças de comportamento entre os complexos sejam visualizadas. A cauda que corresponde às curvas de decomposição permite a construção de espectros associados à decomposição. Como visto aqui, o espectro associado à decadência para o LHCII é notável pela falta de recursos dinâmicos e a forma do espectro de fluorescência LHCII permanece a mesma que o sinal decai ao longo do tempo.A decomposição do espectro da fluorescência também está atrasada, exigindo 100 picosegundos para atingir a fluorescência máxima. Isso sugere que a energia não é transferida entre pigmentos energeticamente distintos dentro do complexo à medida que a fluorescência decai. O espectro associado à decadência é então construído para o complexo da Banda 5.Em comparação com o LHCII, a fluorescência da Banda 5 decai muito mais rapidamente, atingindo intensidade máxima em apenas 30 picosegundos e, em seguida, decading para menos de 20% da intensidade inicial após 500 picosegundos. Ao tentar esse procedimento, é importante lembrar que a interpretação dos dados do TCSPC dependerá de informações bioquímicas adicionais que identifiquem os componentes dos complexos em estudo, por exemplo, por 2 DSDS-PAGE e Western Blotting ou espectrometria de massa.

separation-spinach-thylakoid-protein-complexes-native-green-gel

Research

JoVE Journal

Environment

Ambiente

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Identificação de modificações pós-translacionais de Complexos de proteína vegetal

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Uma Nova Abordagem para a Análise Comparativa de Complexos Multiproteicos Baseado em<sup&gt; 15</sup&gt; N Metabólica Labeling e quantitativa Espectrometria de Massa

Este protocolo detalha a reconstituição de complexos coletores de luz in vitro. Essas proteínas integrais da membrana coordenam clorofilas e carotenóides e são responsáveis pela coleta de luz em plantas superiores e algas verdes.

In Vitro Reconstituição de Complexos de Light-colheita de plantas e algas verdes

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NC-GELFrEE - Limpar nativo de gel eluída fracção líquida Entrapment Electroforese

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Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

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Eletroforese nativa clara/azul híbrida para a separação e análise de supercomplexos de cadeia respiratória mitocondrial

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Separação de espinafre tilacoides complexos de proteínas por eletroforese em Gel verde nativo e caracterização de banda usando contagem de fóton único Time-Correlated

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