Name: Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Aprenda um modelo de câmara de fluxo in vitro para estudar aderência bacteriana a enxertos teciduais. Este método revela interações moleculares cruciais para compreender a patogênese da endocardite infecciosa.

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Este estudo foi patrocinado por uma concessão do fundo de pesquisa KU Leuven (OT/14/097) dada ao RH. TRV foi Postdoctoral Fellow da Fundação de pesquisa FWO - Flandres (Bélgica; Grant Number - 12K0916N) e RH é suportado pela pesquisa clínica fundo de UZ Leuven.

1. preparar o enxerto de tecidos para estudos In Vitro
Nota: Três tipos de tecidos foram utilizados: patch de pericárdio bovino (BP), enxertos criopreservado Homograft (CH) e bovinos de Veia Jugular (BJV). Em caso de conduta BJV e CH (tecido processadas pelo Banco Europeu de Homograft (EHB) e armazenados em nitrogênio líquido antes de usar), foram utilizados tanto a parede e folhetos valvulares. Patch de BP e conduíte BJV foram comprados de fabricantes. Antes da utilização, descongele o CH seguindo as instruções de EHB12.
<ol><li>Lave todos os tecidos com 0,9% NaCl antes de usar.</li>
	<li>Prepare-se biópsias de tecido usando uma biópsia de pele descartável punch para cortar pedaços de tecido circular (10 mm de diâmetro).</li>
	<li>Corte todos os patches de tecido para a mesma altura usando bisturis estéril descartáveis.</li>
	<li>Em tecidos fixados com glutaraldeído (por exemplo conduit BJV), incube pedaços de enxerto durante a noite a 4 ° C com 200 g/L de albumina humana para neutralizar o fixador.</li>
	<li>Lavar resíduos de glutaraldeído com 0,9% NaCl em uma placa de microtitulação.  Repeti 3 vezes durante 1 minuto.</li>
</ol>2. preparar as bactérias para experimentos de perfusão
Nota: Três isolados bacterianos foram utilizados: Cowan (ATCC 12598) S. aureus , s. epidermidis ATCC 149900 e S. sanguinis NCTC 7864. S. aureus e S. epidermidis foram cultivadas a 37 ° C em caldo tryptic soja (TSB) e S. sanguinis foi cultivado a 37 ° C com 5% CO2 em caldo de infusão cérebro coração (BHI).
<ol><li>Prepare uma noite cultura de bactérias em uma placa de ágar de sangue sólido.<ol>
<li>Usar um loop estéril para raspar as bactérias congeladas e inocular em uma placa de ágar sangue de Mueller-Hinton para cultura durante a noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usar um loop de inoculação estéril para pegar uma única colônia da cultura ágar sangue durante a noite e inocular em 10 mL de TSB ou BHI em um tubo de 14 mL e cultura durante a noite a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugar as culturas durante a noite (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e ressuspender as pelotas em 10 mL de salina tamponada fosfato (PBS). Coloque os tubos de 14 mL no gelo.</li>
	<li>Prepare-se uma alíquota da solução de 3,7 mg/mL de 5 (6) - carboxi - fluoresceína N-hidróxi-succinimidil éster (CF) em etanol e armazenar a-20 ° C. Dilua ainda mais o estoque de CF para 150 µ g/mL, usando água 'ultrapura '. Nota: Proteger os tubos de luz usando a folha de alumínio e armazenar a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugar as bactérias (3000 x g, 4 ° C, 10 min) e Resuspenda as pelotas em 800 µ l de PBS e adicione 200 µ l da solução CF 150 µ g/mL (concentração final de 30 µ g/mL, usado para experiências de perfusão). Proteger os tubos de luz com papel alumínio e incube por 30 minutos usando um agitador orbital.</li>
	<li>Depois da rotulagem, bloco com 2% de solução de albumina de soro bovino (BSA) em PBS e girar (3000 x g, 4 ° C, 10 min). Siga com uma etapa de lavagem usando 10 mL de PBS e pelota bactérias por centrifugação (3000 x g, 4 ° C, 10 min).</li>
	<li>Dilua as bactérias com PBS para obter 10 unidades formadoras de colônia de7 (CFU) /mL (verificado pela UFC contando com placas de sangue Ágar Mueller-Hinton), que corresponde a uma OD600 (densidade óptica) de 0,65. Manter os tubos no escuro no gelo antes experimentos de perfusão. Romance Tenha em mente que as medições de600 OD refletem o número aproximado de bactérias. Para contar a dose de vacina eficaz, o método de diluição serial é uma etapa adicional necessária para verificar o OD com base em números, conforme descrito na seção 3.8.</li>
</ol>3. in vitro perfusão experimentos utilizando uma câmara de fluxo paralelo-placa
<ol><li>Monte de biópsias de tecido de 10 mm de diâmetro e a mesma espessura (preparado nas etapas 1.1-1.5) em um sistema de câmara de fluxo com a superfície interior voltada para cima para entrar em contato com a suspensão bacteriana. Nota: A mesma espessura de tecido através de vários enxertos garante que a mesma altura de tecido é alcançada no canal permitindo o fluxo laminar em todas as condições. Todos os elementos da câmara de fluxo são apresentados e descritos na Figura 1.<ol>
<li>Para começar o protocolo, coloque o pedaço de tecido redondo entre uma lâmina de microscópio com uma perfuração circular de 8 mm e uma junta de borracha. Nota: O microscópio possui o filme ultra-fino inferior para permitir a geração do furo de 8 mm. Juntamente com a folha de borracha, ele corrige o tecido para permitir o contato direto entre a amostra e o fluxo médio e também previne a luxação da biópsia durante o experimento. A superfície do tecido investigada, que é exposta ao fluxo (diâmetro menor) não pode ser manipulada pelo fórceps.</li>
		<li>Encaixe o suporte com o tecido a folha da gaxeta que está incorporada no quadro de metal inferior da câmara.</li>
		<li>Fixe a estrutura de metal superior com a folha da gaxeta correspondente à parte inferior da câmara com o suporte do tecido inserido anteriormente. Posteriormente montar a câmara inteira com oito parafusos e porcas de parafuso. Certifique-se que a altura da câmara é sempre o mesmo através de enxertos. Nota: A altura da câmara deve ser determinada sempre sobre os parafusos de aperto. Use um paquímetro ou régua.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligue a câmara de fluxo com uma bomba peristáltica e o reservatório do líquido com os tubos.</li>
	<li>Perfundir os tecidos com suspensões de 107 UFC/mL (verificado pela UFC contando e relacionadas com medições de600 OD) bactérias fluorescente-etiquetadas em PBS com uma tensão de cisalhamento de 3 Dina/cm2 (Dina por centímetro quadrado unidade de pressão) por meios da bomba peristáltica (4 mL/min de taxa de fluxo) para 1 h, usando um reservatório 400ml bacteriana (projeto In-house, Figura 1) condicionado a 37 ° C, usando um termostato de placa (Tabela de materiais).</li>
	<li>Recircular continuamente a suspensão bacteriana de 100 mL, usando o mesmo reservatório.</li>
	<li>Após a perfusão, desmonte a câmara para liberar o enxerto e lavar a peça de tecido duas vezes com 4 mL de PBS em uma placa de 12 usando o agitador orbital de laboratório por 3 min cada. Posteriormente, corte a parte interna da prótese usando uma biópsia de pele soco de um diâmetro menor.</li>
	<li>Coloque cada biópsia do tecido num tubo separado 14 mL contendo 1 mL de estéril 0,9% NaCl. Rotule o tubo como #1.</li>
	<li>Separar as bactérias do tecido usando um banho sonication por 10 min (amplitude = 100% e frequência = 45 kHz). Nota: Completo desapego das bactérias do tecido enxertos devem ser avaliados após incubação de patches durante a noite a 37 ° C, em meio líquido TSB, seguido por medições de600 OD comparado para controlar os patches tratadas com uma solução livre de bactérias.</li>
	<li>Use um método de diluição serial em placas de ágar sangue de Mueller-Hinton para contar CFUs.<ol>
<li>Prepare um tubo único 14 mL com 10 mL de solução salina estéril para fazer diluições em série da suspensão bacteriana obtidos após sonication. Rotule este tubo como #2. Nota: Para cada tecido experimento um tubo com 10 mL de 0,9% NaCl é necessário.</li>
		<li>Prepare-se três tubos de 14 mL com 10ml de estéril 0,9% NaCl para diluições em série de suspensão bacteriana inicial do passo 2.7. Rotule os tubos como segue 3 #, 4 #, 5 #. Nota: Este passo é necessário saber o número real de UFC em suspensão bacteriana, usado para o experimento de perfusão.</li>
		<li>Vórtice misturar cada tubo de vórtice s. 15 os tubos com a biópsia de tecido, bem como a suspensão bacteriana inicial para fazer diluições em série.</li>
		<li>Prepare três placas de ágar, dois para o experimento de tecido (perfusão de bactérias e controle da perfusão de PBS) e um terceiro para a suspensão bacteriana inicial usado para perfusions.</li>
		<li>Rotule a três setores por prato para o experimento de tecido da seguinte forma 10-1, 10-3 e 10-4. Para contar o número de CFUs na perfusates bacteriana, rotular o prato da seguinte forma: 10-1, 10-3, 10-5 e 10-7. Nota: Todas as indicações em ágar placas como 10-1, 10-3 e assim por diante referem o número final de UFC/mL, calculado no dia seguinte. Placa de controle não exige qualquer setores. Antes da utilização, placas de ágar sangue devem ser colocadas sob o capô laminar e abriu para remover o excesso de umidade.</li>
		<li>Para continuar a preparar as diluições em série, transferir 100 µ l do tubo #1 para o tubo #2 e misture vigorosamente com vortex.</li>
		<li>Espalhou-se 100 µ l do conteúdo do tubo #1 e #2 para o correspondente de setores 10-1 e 10-3 da placa de ágar. Da mesma forma, espalhar 10 µ l de tubo #2 sobre o setor 10-4, repita esta etapa 4 vezes para obter 4 crescimentos separados de cada volume de 10 µ l. Nota: Devido ao pequeno volume usado para chapeamento para o setor 10-4, é aconselhável ter vários número de gotas para fazer um número médio de CFUs crescidos.</li>
		<li>Para preparar as diluições de série da cultura inicial, transferir 100 µ l de suspensão bacteriana do passo 2.7 para tubo #3 e misture vigorosamente com vortex. Adicionar 100 µ l do tubo #3 #4 de tubo e misture bem, repita o procedimento para tubo subsequente #5.</li>
		<li>Espalhou-se 100 µ l do conteúdo dos tubos 3 #, 4 #, 5 # e a suspensão bacteriana ajustada (passo 2.7), respectivamente, para os setores de 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 da placa de ágar sangue.</li>
		<li>Deixe as placas de ágar sangue de capuz laminar de ar seco os spreads bacterianos, normalmente por 10 minutos. Depois, coloque as placas a 37 ° C para incubação durante a noite.</li>
		<li>Após a incubação durante a noite, conte as colônias bacterianas para obter o número de CFUs resultantes da adesão a biópsias de tecidos, bem como CFUs/mL na suspensão bacteriana de partida usada para a perfusão. Expressa os resultados como UFC/cm2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. fluorescência microscopia de bactérias aderidas enxertar tecidos mediante perfusão
<ol><li>Após a perfusão, lavar peças de tecido com PBS (consulte a etapa 3.5) e cortar a parte interna de um enxerto usando um soco de um diâmetro menor.</li>
	<li>Preparar uma placa de 6 e coloque as gotas de meio de montagem (Tabela de materiais).</li>
	<li>Coloque cada pedaço de tecido com sua superfície perfundido para baixo em uma única gota de meio de montagem.</li>
	<li>Ler uma placa usando um scanner de fluorescência (Tabela de materiais). Definir parâmetros de excitação e emissão de comprimentos de onda de acordo com um fluoróforo usado para rotular bacteriana.</li>
</ol>

<ol><li>Que, Y. A., Moreillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infective+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Infective endocarditis.</a> Nature Reviews Cardiology. 8 (6), 322-336 (2011).</li>
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<li>Liesenborghs, L., Verhamme, P., Vanassche, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus%2C+master+manipulator+of+the+human+hemostatic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus, master manipulator of the human hemostatic system.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (3), 441-454 (2018).</li>
<li>Chiu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+ICAM-1+and+decreases+VCAM-1+and+E-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Artheriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases ICAM-1 and decreases VCAM-1 and E-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Artheriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (1), 73-79 (2004).</li>
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<li>Veltrop, M. H. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Species-+and+Strain-Dependent+Induction+of+Tissue+Factor+in+Human+Vascular+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial Species- and Strain-Dependent Induction of Tissue Factor in Human Vascular Endothelial Cells.</a> Infection and Immunity. 67 (11), 6130-6138 (1999).</li>
</ol>

Observações clínicas recentes dar atenção especial a IE como uma complicação em pacientes submetidos a substituição da válvula da RVOT6,13. Disfunção da válvula implantada no IE é o resultado da interação bacteriana com o enxerto endovascular, levando a extensa inflamatória procoagulante reações1,e14. O modelo apresentado romance em vitro permitiu-nos investigar se as diferenças em estruturas de ...

Staphylococcus aureus (S. aureus) emprega uma variedade de estratégias de virulência para burlar o sistema de defesa imunológica host colonizando superfícies biológicas ou não biológicos, implantadas na circulação humana, que leva a graves infecções intravasculares como sepse e IE,1,2,3,4,5. Restos de IE um tratamento importante associado a complicação em pacientes após o implante de válvulas protéticas do coração enquanto factores individuais, contribuindo para o aparecimento de IEare não ainda plenamente compreendido6,7. Sob condições de fluência, as bactérias encontram forças de cisalhamento, que eles precisam superar para aderir ao vaso parede8. Modelos, que permitem estudar a interação entre bactérias e tecido da prótese valvular ou endotélio sob fluxo, são de interesse como eles refletem na vivo situação mais.
Vários mecanismos específicos facilitam a aderência bacteriana às células endoteliais (ECs) e a matriz de subendothelial expostos (ECM) levando a colonização do tecido e maturação de vegetações, sendo essenciais primeiros passos no IE9. Várias proteínas de superfície estafilocócicas ou MSCRAMMs (componentes superfície microbianas reconhecer moléculas da matriz adesiva) têm sido descritos como mediadores de adesão às células do hospedeiro e a proteínas de ECM interagindo com moléculas como a fibronectina, fator de fibrinogênio, colágeno e von Willebrand (VWF)8,10,11. No entanto, tendo em conta a dobrar intra molecular de alguns fatores de virulência, estudadas na maior parte em condições estáticas, muitas dessas interações podem ter diferente relevância nas infecções endovascular na circulação de sangue.
Portanto, apresentamos um in-house projetado em vitro fluxo paralelo-placa modelo de câmara, que permite a avaliação da aderência bacteriana aos diferentes componentes do ECM e ECs no contexto de enxertos de tecido implantado na posição RVOT. O objetivo geral do método descrito neste trabalho é estudar os mecanismos de interação entre as bactérias e os tecidos subjacentes endovascular em condições de fluxo, que estão intimamente relacionados com o ambiente na vivo de patógenos de circulação sanguínea, tais como S. aureus. Esta nova abordagem enfoca a susceptibilidade de superfícies de tecido de enxerto para aderência bacteriana para identificar potenciais fatores de risco para o desenvolvimento do IE.

<table><tbody><tr><td>Remendo de pericárdio bovino (BP), Pericárdio Peri-Guard Flexível</td><td>Synovis Surgical Innovations, EUA</td><td>PC-0404SN</td><td></td></tr><tr><td>Conduítes de veia jugular bovina (BJV)</td><td>Conduíte de contegra; Medtronic Inc, EUA</td><td>M333105D001</td><td></td></tr><tr><td>homoenxerto criopreservado CH</td><td>European Homograft Bank (EHB)</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Acu-Punch</td><td>Acuderm Inc, EUA</td><td>P850 (8 mm); P1050 (10 mm)</td><td></td></tr> <tr><td>albumina humana</td><td>Flexbumin; Baxter, Bélgica</td><td>BE171464 LOTE:16G12C</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de soja tríptico (TSB)</td><td>Fluka, Steinheim, Alemanha</td><td>22092-500G</td><td></td></tr><tr><td>Caldo de infusão cardíaca (BHI)</td><td>Fluka</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS).</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-Carboxifluoresceína N-hidroxisuccinimida éster (CF)</td><td>Sigma-Aldrich, Alemanha</td><td>21878-100MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (MODELO ISM444B)</td><td>Padrão Ismatec BVP-Z; Cole Parmer, Wertheim, Alemanha</td><td>631942-2</td><td></td></tr><tr><td>Banho de sonicação</td><td>Limpador ultrassónico VWR; VWR, Radnor, Pa</td><td>142-6044</td><td>230V/50 -60Hz 60VA; HF45kHz, 30W</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen by ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer 2000 (scanner de fluorescência)</td><td>GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, Pa</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Arium Pro VF - água ultrapura - H2O</td><td>MilliQ Millipore</td><td>87206462</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas microscópicas - Câmaras de cultura de tecidos (1 poço)</td><td>Sarstedt</td><td>94.6140.102</td><td></td></tr><tr><td>1-well em Lumox destacável</td><td>Sarstedt</td><td>94.6150.101</td><td></td></tr><tr><td>Aço Inoxidável - lâminas cirúrgicas Tubo de</td> Silicone <td>Swann-Morton</td><td>311</td><td></td></tr><tr><td>Tygon, 1/8"ID x 1/4"OD</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-95702-06 Faixa de</td><td>temperatura: &ndash; 80 a 200 graus; C Esterilizar: Com óxido de etileno, irradiação gama, ou autoclave por 30 min, 15 psi de pressão</td></tr><tr><td>PharMed BPT Tubing</td><td>Saint-Gobain</td><td>AY242012</td><td>Autoclavável 30 min a 121&deg; Tubulação C</td></tr><tr><td>Tygon LMT-55</td><td>Saint Gobain Performance Plastics&trade;</td><td></td><td></td>15312022</tr><tr><td>termostato</td><td>BMG BIOMEDIZINTECHNIK</td><td>300-0042</td><td>230V, 90VA, 50Hz</td></tr></tbody></table>

um modelo in vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Várias condutos valvulados e válvulas de stent montado são utilizadas para substituição de válvula de trato (RVOT) de saída do ventrículo direito em pacientes com doença cardíaca congênita. Quando usando materiais protéticos, no entanto, esses enxertos são suscetíveis a infecções bacterianas e várias respostas do hospedeiro.
Identificação de fatores bacterianos e anfitrião que desempenham um papel vital na endovascular aderência dos microorganismos é de importância para compreender melhor a fisiopatologia da superveniência de infecções como a endocardite infecciosa (IE) e desenvolver preventiva estratégias. Portanto, o desenvolvimento de modelos competentes para investigar a adesão bacteriana em condições fisiológicas de cisalhamento é necessário. Aqui, descrevemos o uso de um recém-projetado em vitro perfusão câmara baseado em placas paralelas que permite o estudo da adesão bacteriana aos diferentes componentes dos tecidos de enxerto como expostos a matriz extracelular, células endoteliais e áreas inertes . Esse método combinado com formadoras de Colônia (CFU) unidade de contagem é adequada para avaliar a propensão dos materiais de enxerto para adesão bacteriana sob fluxo. Além disso, o sistema de câmara de fluxo pode ser usado para investigar o papel dos componentes do sangue na adesão bacteriana sob condições de cisalhamento. Temos demonstrado que a fonte de tecido, sua morfologia superficial e especificidade de espécies bacterianas não são os principais fatores determinantes na adesão bacteriana enxertar tecidos usando nosso modelo de perfusão in-house projetado em vitro .

Para melhor compreender os mecanismos por trás IE desenvolvimento, este modelo permite a avaliação de bacteriano e fatores de tecido associado apresentam a situação na vivo do início da infecção.
No detalhe, a abordagem do romance em vitro permite quantificar adesão bacteriana em condições de fluxo de tecidos diferentes do enxerto por perfusing fluorescente etiquetadas bactérias sobre os tecidos exerce...

Descrevemos um in-house projetado em vitro fluxo modelo de câmara, que permite a investigação de adesão bacteriana ao enxerto de tecidos.

Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na patogênese da endocardite infecciosa, e pathobiogramas através de campos como a interação entre bactérias, células sanguíneas e células endoteliais que revestem a musculatura. A principal vantagem dessa técnica é que os enxertos teciduais podem estar diretamente expostos a interações mútuas com vários alvos, como bactérias, plaquetas e proteínas em condições padronizadas de fluxo. A implicação dessa técnica se estende à nossa terapia de endocardite infecciosa, pois pode desvendar interações moleculares importantes e fatores que impulsionam a alta infecciosidade de certos tecidos.Este método fornece uma visão sobre a patogênese da formação de vegetação. Também pode ser aplicável em estudos que investigam permeabilidade vascular, mobilidade celular e expressão de células genéticas. Para iniciar o protocolo, coloque uma biópsia de tecido previamente preparada com 10 milímetros de diâmetro, e a mesma espessura entre um slide de microscópio e uma perfuração circular de oito milímetros, e uma junta de borracha com a superfície interna voltada para cima, para entrar em contato com a suspensão bacteriana.Concentre-se na orientação do enxerto de tecido enquanto colocado no suporte. Certifique-se de que a superfície interna do tecido já está exposta à corrente sanguínea para entrar em contato com seu meio experimental. Em seguida, insira seu suporte com o tecido na folha de junta que está embutida na estrutura metálica inferior da câmara.Conecte a estrutura metálica superior com a folha de junta correspondente na parte inferior da câmara com o suporte de tecido previamente inserido. Em seguida, monte a câmara inteira com oito parafusos e porcas de parafuso. Certifique-se de que a altura da câmara é sempre a mesma entre os enxertos usando uma pinça ou régua.Em seguida, conecte a câmara de fluxo com uma bomba peristáltica. Em seguida, conecte o reservatório de fluido de 400 mililitros com os tubos. Perfundam os tecidos com suspensões de 100 mililitros de dez a sete unidades formadoras de colônias fluorescentes em salina tamponada de fosfato com o estresse de três dinaços por centímetro quadrado e taxa de fluxo correspondente de quatro mililitros por minuto durante uma hora usando a bomba peristáltica e o reservatório bacteriano.Recircular continuamente a suspensão bacteriana de 100 mililitros usando o mesmo reservatório de coleta. Após a perfusão, desmonte a câmara para liberar o enxerto. Lave a peça de tecido duas vezes com quatro mililitros de PBS em uma placa de 12 poços usando um agitador orbital por três minutos.Em seguida, corte a parte interna do enxerto usando um soco de biópsia da pele com um diâmetro menor. Coloque cada biópsia tecidual em um tubo separado de 14 mililitros contendo um mililitro de cloreto de sódio estéril de 0,9%. Retire as bactérias do tecido usando um banho de sônica por 10 minutos.Prepare um único tubo de 14 mililitros com 10 mililitros de cloreto de sódio estéril de 0,9% para fazer diluições seriais da suspensão bacteriana obtida após a sônicação. Rotule o tubo número dois. Prepare três tubos de 14 mililitros com 10 mililitros de cloreto de sódio estéril de 0,9% para diluições seriais da suspensão bacteriana inicial levada ao experimento de profusão.Rotule os tubos número três, número quatro e número cinco. Em seguida, proteja três placas de ágar, uma para a perfusão bacteriana, uma para a perfusão de controle da PBS, e a terceira para a suspensão bacteriana inicial usada para perfusões. Rotule três setores por placa para o experimento tecidual da seguinte forma:10-1, 10-3 e 10-4.Para contar o número de unidades formadoras de colônias na perfusão bacteriana, rotule a placa da seguinte forma: 10-1, 10-3, 10-5 e 10-7. Vórtice os tubos contendo a biópsia tecidual por 15 segundos cada, para fazer diluições seriais. Para preparar as diluições seriais, transfira 100 microliters do tubo número um para o tubo número dois, e vórtice do tubo para misturar completamente a solução.Espalhe 100 microliters do conteúdo do tubo número um e número dois para os setores correspondentes, 10-1 e 10-3 da placa de ágar. Em seguida, espalhe 10 microliters de tubo número dois no setor 10 quatro. Repita esta etapa quatro vezes para obter quatro crescimentos separados de cada volume de 10 microliters.Para preparar diluições seriais da cultura inicial, primeiro vórtice a diluição por 15 segundos e transferir 100 microliters de suspensão bacteriana para o tubo número três, e misturar vigorosamente por vórtice. Adicione 100 microliters do tubo número três ao tubo número quatro e misture novamente. Repita o procedimento para o tubo número cinco do tubo número quatro.Espalhe 100 microliters do conteúdo dos tubos número três, número quatro, número cinco, e a cultura inicial rotulada, respectivamente, nos setores 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 da placa de ágar de sangue. Deixe as placas de ágar de sangue sob o capô laminar para secar as propagações bacterianas, normalmente por 10 minutos. Depois, coloque as placas a 37 graus Celsius para incubação durante a noite.Após a incubação noturna, conte as colônias bacterianas para obter o número de UFC. Sob condições de estresse, observou-se apego bacteriano semelhante entre os vários tecidos de enxerto tanto para a infecção por staphylococcus aureus quanto para a infecção por estafilococos. Após os procedimentos, estreptococos sanguinis apresentaram redução significativa da adesão à parede vesícula jugular bovina, quando comparada com o remendo bovino pericárdio.Ao comparar as três espécies de bactérias, estreptococos sanguinis apresenta significativamente menor adesão à parede venosa jugular bovina em relação ao staphylococcus aureus e staphylococcus epidermidis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter preparado tecidos corretos da mesma cabeça. Ele garantirá condições semelhantes em todos os espécimes do experimento e minimizará a variabilidade dos dados entre diferentes séries de experimentos.Após seu desenvolvimento, essa técnica permite que os pesquisadores explorem os complexos sistemas de desordem de forma passo a passo, enriquecendo suas abordagens de modelo in vitro com diferentes elementos para construir total complexidade perto do estado médico.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um método para a cultura de uma monocamada de células endoteliais em toda a superfície interior 3D inteiro de um dispositivo micro com microvascular de tamanho canais (= 30 mm) é descrito.

A microfluídica Endothelialized para estudo das interacções microvasculares em Doenças Hematológicas

Fonte: Ditkowski, B., et al. Um modelo in vitro de um sistema de perfusão de placas paralelas para estudar a adesão bacteriana a tecidos de enxerto. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o método de usar uma câmara de fluxo de placas paralelas para perfundir bactérias marcadas fluorescentemente sobre tecidos de enxerto vascular, permitindo uma análise controlada da adesão bacteriana e da patogênese precoce sob condições de fluxo de cisalhamento.

Modelo in vitro de fluxo paralelo de placas para estudar a adesão bacteriana em biópsia de tecido

Fonte: Calatayud Arroyo, M., et al. Avaliação da Viabilidade de um Consórcio Bacteriano Sintético na Interface In Vitro Intestino-Microrganismo. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra um modelo intestino-microrganismo in vitro para estudar a viabilidade bacteriana. Uma cocultura de células Caco-2 e HT29-MTX é incubada com bactérias pré-tratadas sob condições digestivas simuladas. A integridade da barreira epitelial é avaliada usando resistência elétrica transepitelial, e frações do meio, muco...

Modelo intestinal in vitro para avaliar adesão bacteriana e internalização

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method for studying host-pathogen interactions using a micro-parallel plate flow chamber seeded with human primary endothelial cells. Following endothelial cell activation by an ionophore and perfusion with fluorescently labeled bacteria, the cells release von Willebrand factor (VWF), which binds bacterial adhesins under shear...

Micro-Parallel Plate Flow Chamber Model for Studying Bacterial Adhesion to Human Endothelial Cells

Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

An In Vivo Model to Study Shear-Dependent Bacterial Adhesion

Neisseria meningitidis é um patógeno específico humano que infecta os vasos sanguíneos. Neste protocolo microvasos humanos são introduzidos em um rato por enxertia de pele humana em ratos imunocomprometidos. As bactérias aderem extensivamente para os vasos humanos, levando a danos vasculares e desenvolvimento da erupção purpúrica normalmente observada em casos em humanos.

Humanizado mouse modelo para estudar Infecções Bacterianas Segmentação microvasculatura

Para estudar a interação das bactérias com os vasos sanguíneos sob tensão de cisalhamento, são descritas uma câmara de fluxo e um modelo de microscopia intravital mesentérica in vivo que permite dissecar os fatores bacterianos e hospedeiros que contribuem para a adesão vascular.

In Vitro e In Vivo modelo para estudar a adesão bacteriana para o Vaso de parede em condições de escoamento

Leucócitos, avidamente, interagir com células vasculares e plaquetas após lesão de parede do vaso ou durante a inflamação. Aqui, descrevemos um simples ensaio baseado em fluxo laminar para caracterizar os mecanismos moleculares que fundamentam as interações entre os leucócitos e os seus parceiros de celulares.

Ensaios baseados em fluxo laminar para investigar o recrutamento de leucócitos em culturas de células vasculares e plaquetas aderentes

Este protocolo demonstra métodos para permitir a cultura in vitro estendida de xenoenxertos derivados do paciente (PDX). Um passo aumenta a viabilidade geral das culturas de cluster multicelulares em hidrogéis 3D, através da remoção direta de células únicas não viáveis. Um passo secundário demonstra as melhores práticas para a cultura PDX em uma plataforma microfluida perfumada.

Viabilidade aprimorada para culturas de hidrogel 3D Ex vivo de xenoenxertos derivados do paciente em uma plataforma microfluida perfusada

Este protocolo apresenta a instalação e operação de um biorreator impresso em 3D recentemente desenvolvido para a cultura ex vivo de vasos sanguíneos em perfusão. O sistema foi projetado para ser facilmente adotado por outros usuários, prático, acessível e adaptável a diferentes aplicações experimentais, como biologia básica e estudos farmacológicos.

Ex Vivo Cultura de Perfusão de Grandes Vasos Sanguíneos em Biorreator Impresso em 3D

Aprenda um modelo de câmara de fluxo in vitro para estudar aderência bacteriana a enxertos teciduais. Este método revela interações moleculares cruciais para compreender a patogênese da endocardite infecciosa.

Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos

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