Um modelo In Vitro de um sistema de perfusão paralelo-placa para estudar a aderência bacteriana para enxertar tecidos

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na patogênese da endocardite infecciosa, e pathobiogramas através de campos como a interação entre bactérias, células sanguíneas e células endoteliais que revestem a musculatura. A principal vantagem dessa técnica é que os enxertos teciduais podem estar diretamente expostos a interações mútuas com vários alvos, como bactérias, plaquetas e proteínas em condições padronizadas de fluxo. A implicação dessa técnica se estende à nossa terapia de endocardite infecciosa, pois pode desvendar interações moleculares importantes e fatores que impulsionam a alta infecciosidade de certos tecidos.

Este método fornece uma visão sobre a patogênese da formação de vegetação. Também pode ser aplicável em estudos que investigam permeabilidade vascular, mobilidade celular e expressão de células genéticas. Para iniciar o protocolo, coloque uma biópsia de tecido previamente preparada com 10 milímetros de diâmetro, e a mesma espessura entre um slide de microscópio e uma perfuração circular de oito milímetros, e uma junta de borracha com a superfície interna voltada para cima, para entrar em contato com a suspensão bacteriana.

Concentre-se na orientação do enxerto de tecido enquanto colocado no suporte. Certifique-se de que a superfície interna do tecido já está exposta à corrente sanguínea para entrar em contato com seu meio experimental. Em seguida, insira seu suporte com o tecido na folha de junta que está embutida na estrutura metálica inferior da câmara.

Conecte a estrutura metálica superior com a folha de junta correspondente na parte inferior da câmara com o suporte de tecido previamente inserido. Em seguida, monte a câmara inteira com oito parafusos e porcas de parafuso. Certifique-se de que a altura da câmara é sempre a mesma entre os enxertos usando uma pinça ou régua.

Em seguida, conecte a câmara de fluxo com uma bomba peristáltica. Em seguida, conecte o reservatório de fluido de 400 mililitros com os tubos. Perfundam os tecidos com suspensões de 100 mililitros de dez a sete unidades formadoras de colônias fluorescentes em salina tamponada de fosfato com o estresse de três dinaços por centímetro quadrado e taxa de fluxo correspondente de quatro mililitros por minuto durante uma hora usando a bomba peristáltica e o reservatório bacteriano.

Recircular continuamente a suspensão bacteriana de 100 mililitros usando o mesmo reservatório de coleta. Após a perfusão, desmonte a câmara para liberar o enxerto. Lave a peça de tecido duas vezes com quatro mililitros de PBS em uma placa de 12 poços usando um agitador orbital por três minutos.

Em seguida, corte a parte interna do enxerto usando um soco de biópsia da pele com um diâmetro menor. Coloque cada biópsia tecidual em um tubo separado de 14 mililitros contendo um mililitro de cloreto de sódio estéril de 0,9%. Retire as bactérias do tecido usando um banho de sônica por 10 minutos.

Prepare um único tubo de 14 mililitros com 10 mililitros de cloreto de sódio estéril de 0,9% para fazer diluições seriais da suspensão bacteriana obtida após a sônicação. Rotule o tubo número dois. Prepare três tubos de 14 mililitros com 10 mililitros de cloreto de sódio estéril de 0,9% para diluições seriais da suspensão bacteriana inicial levada ao experimento de profusão.

Rotule os tubos número três, número quatro e número cinco. Em seguida, proteja três placas de ágar, uma para a perfusão bacteriana, uma para a perfusão de controle da PBS, e a terceira para a suspensão bacteriana inicial usada para perfusões. Rotule três setores por placa para o experimento tecidual da seguinte forma:10-1, 10-3 e 10-4.

Para contar o número de unidades formadoras de colônias na perfusão bacteriana, rotule a placa da seguinte forma: 10-1, 10-3, 10-5 e 10-7. Vórtice os tubos contendo a biópsia tecidual por 15 segundos cada, para fazer diluições seriais. Para preparar as diluições seriais, transfira 100 microliters do tubo número um para o tubo número dois, e vórtice do tubo para misturar completamente a solução.

Espalhe 100 microliters do conteúdo do tubo número um e número dois para os setores correspondentes, 10-1 e 10-3 da placa de ágar. Em seguida, espalhe 10 microliters de tubo número dois no setor 10 quatro. Repita esta etapa quatro vezes para obter quatro crescimentos separados de cada volume de 10 microliters.

Para preparar diluições seriais da cultura inicial, primeiro vórtice a diluição por 15 segundos e transferir 100 microliters de suspensão bacteriana para o tubo número três, e misturar vigorosamente por vórtice. Adicione 100 microliters do tubo número três ao tubo número quatro e misture novamente. Repita o procedimento para o tubo número cinco do tubo número quatro.

Espalhe 100 microliters do conteúdo dos tubos número três, número quatro, número cinco, e a cultura inicial rotulada, respectivamente, nos setores 10-3, 10-5, 10-7 e 10-1 da placa de ágar de sangue. Deixe as placas de ágar de sangue sob o capô laminar para secar as propagações bacterianas, normalmente por 10 minutos. Depois, coloque as placas a 37 graus Celsius para incubação durante a noite.

Após a incubação noturna, conte as colônias bacterianas para obter o número de UFC. Sob condições de estresse, observou-se apego bacteriano semelhante entre os vários tecidos de enxerto tanto para a infecção por staphylococcus aureus quanto para a infecção por estafilococos. Após os procedimentos, estreptococos sanguinis apresentaram redução significativa da adesão à parede vesícula jugular bovina, quando comparada com o remendo bovino pericárdio.

Ao comparar as três espécies de bactérias, estreptococos sanguinis apresenta significativamente menor adesão à parede venosa jugular bovina em relação ao staphylococcus aureus e staphylococcus epidermidis. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ter preparado tecidos corretos da mesma cabeça. Ele garantirá condições semelhantes em todos os espécimes do experimento e minimizará a variabilidade dos dados entre diferentes séries de experimentos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica permite que os pesquisadores explorem os complexos sistemas de desordem de forma passo a passo, enriquecendo suas abordagens de modelo in vitro com diferentes elementos para construir total complexidade perto do estado médico.