Preparação de fatias aguda da medula espinhal para a gravação de células inteiras remendo-braçadeira nos neurônios da substância Gelatinosa
18 de janeiro de 2019
Aqui, descrevemos os passos essenciais para gravações de células inteiras remendo-braçadeira feitas de neurônios da substância gelatinosa (SG) na fatia da medula espinhal em vitro . Esse método permite que as propriedades intrínsecas da membrana, transmissão sináptica e caracterização morfológica dos neurônios SG para ser estudado.
Este método pode ajudar a esclarecer os mecanismos espinhais subjacentes à transmissão sensorial, regulação nociceptiva e desenvolvimento de dor crônica ou dor A principal vantagem dessa técnica é que ela pode permitir a preservação neuronal ideal e pode imitar condições in vivo até certo ponto. Comece puxando eletrodos de gravação de microcapillarias de vidro borossilicato usando um puxador capilar. Em seguida, encha um molde com ágar derretido para preparar um 1,2 centímetro por 1,5 centímetro por bloco de ágar de 2,0 centímetros.
Corte o bloco para ter um canal central se planejar seções transversais. Ou uma carne de canal com a borda do bloco para seções parasagitais. Antes da profusão transcárdia e extração da medula espinhal, prepare 500 mililitros de ACSF à base de sacarose.
Esfrie a solução para gelo frio e equilibre com 95% O2 e 5%CO2. Esfrie todas as ferramentas de dissecção no gelo. Faça uma incisão longitudinal de cinco centímetros na pele traseira de caudal a rostral.
Em seguida, corte a caixa torácica entre a coluna e as costelas de ambos os lados. Use uma tesoura para fazer um corte na extremidade caudal da coluna. Em seguida, corte os tecidos circundantes e isole rapidamente o segmento lumbosacral da coluna vertebral.
Transfira o segmento lumbosacral para um prato de vidro contendo sacarose gelada à base de CASF. Com o lado ventral para cima, use uma tesoura fina para cortar o pedículo vertebral bilateralmente e expor a medula espinhal cuidadosamente. Isole uma seção de dois centímetros de comprimento da medula espinhal com o alargamento lumbosacral e transfira a seção espinhal para outro prato de vidro cheio de sacarose fria ACSF.
Trabalhe sob um microscópio de dissecção para remover as meninges e a membrana aracnoide pia. Corte todas as raízes ventral e dorsal o mais rápido possível. Tome cuidado para evitar a lesão na medula espinhal, especialmente o chifre dorsal ao remover as meninges e as raízes espinhais.
Coloque a medula espinhal no bloco de ágar previamente aparado. Para preparar fatias transversais, conecte o lado ventral da medula espinhal ao ágar com o lado dorsal em direção à lâmina. Para preparar fatias parasagitais, conecte o lado ventral com supercola ao ágar em uma direção vertical.
Em seguida, monte o bloco de ágar em uma plataforma de vibratome com supercola. E prepare fatias transversais ou parasagitais de 300 a 500 mícrons com uma velocidade avançada de 0,025 milímetros por segundo e uma frequência de vibração de 80 Hertz. A medula espinhal deve ser cortada dorso-ventrally.
Para os melhores resultados, a fatia deve ser preparada dentro de 15 a 20 minutos. A espessura da fatia espinhal não deve ser superior a 600 mícrons para satisfazer a visibilidade celular. Use uma pipeta de plástico aparada para transferir as fatias para a malha de nylon em uma câmara de armazenamento contendo ACSF continuamente oxigenado a 32 graus Celsius.
Para realizar gravações de grampos de remendo de células inteiras a partir de neurônios de croseto ou SG de substantia, use soluções intracelulares baseadas em íons de potássio para gravação, aplicando solução baseada em cáção de césio apenas para o registro de correntes inibitórias pós-sinápticas. Mova suavemente a fatia da medula espinhal para a câmara de gravação. E, em seguida, estabilizá-lo firmemente com um fio de platina em forma de U com fios de nylon para a estabilidade da fatia ideal.
Profuse firmemente a fatia com ACSF borbulhado à temperatura ambiente e coloque a taxa de profusão em dois a quatro mililitros por minuto para obter oxigenação suficiente. Em seguida, usando uma lente de microscópio de baixa resolução, identifique a região dos neurônios SG como uma banda translúcida. Escolha um neurônio saudável, caracterizado por uma forma tridimensional com uma membrana brilhante e lisa como a célula alvo usando o objetivo de alta resolução e ajustá-lo ao centro da tela do monitor de vídeo.
Encha uma micro pipeta com um volume apropriado de solução intracelular baseada em íon de potássio ou íon de alumínio. Em seguida, insira a micro-pipeta no suporte do eletrodo e certifique-se de que a solução intracelular esteja entrando em contato com o fio de prata dentro do suporte. Coloque a micro pipeta em foco e use o micromanipulador para imergi-la no ACSF.
Aplique uma leve pressão positiva para afastar qualquer sujeira e detritos. Mova gradualmente a micro pipeta em direção ao neurônio alvo. Uma vez que a pipeta se aproxime do neurônio e uma covinha muito pequena se forma na membrana neuronal, libere a pressão positiva para formar um gigaseal.
Alterar o potencial de exploração para menos 70 milvolts, que é próximo do potencial fisiológico de membrana de descanso de uma célula. Em seguida, aplique uma sucção transitória e suave à micro pipeta para romper a membrana e criar uma boa configuração de células inteiras. Regisma propriedades de disparo testando o padrão de disparo de cada neurônio no grampo atual com uma série de um segundo despolarizando pulsos de corrente de 25 a 150 picoamps com incrementos de 25 picoamp no potencial de membrana de repouso.
Para registrar correntes subtenente somáticas, mantenha o potencial da membrana a menos 50 milvolts no modo de fixação de tensão e aplique uma série de pulsos de tensão hiperpolarising de uma segunda duração de menos 60 milivolts a menos 120 milvolts com um decremento de 10 milvolt. Registre correntes pós-sinápticas excitatórias com a solução intracelular baseada em íon de potássio no modo de fixação de tensão com um potencial de retenção de menos 70 milivolts. Registre IPSC usando solução intracelular baseada em íons de celulose para gravação de IPSC's.
Depois de segurar o potencial da membrana a menos 70 milivolts por aproximadamente cinco minutos, altere gradualmente o potencial de retenção para zero milvolts. Aguarde alguns minutos para estabilizar e comece a registrar os eventos do IPSC. Padrões de disparo determinados injetando uma série de pulsos de corrente despolarizantes de um segundo em um neurônio SG com potencial de membrana de repouso podem ser classificados como disparo tônico, disparo atrasado, disparo de lacunas, explosão inicial, estouro ático, pico único e disparo relutante.
Esta imagem mostra o protocolo de evocação para correntes de subtenências no grampo de tensão. Esses traços representativos mostram a resposta à injeção de corrente hiperpolarizadora classificada como IH, IA e TI. Este é um traço representativo de SEPSC registrado a partir de neurônios SG a menos 70 milvolts na ausência e presença de 50 APV micromolar e 20 cnqx micromolar. Este traço mostra os SEPC gravados antes da adição de APV e CNQX em uma escala de tempo expandida.
Após este procedimento estão os métodos como gravações de grampo de remendo emparelhado ou optogenética pode ser realizado para responder a perguntas adicionais como caracterizar microcircuitos neuronais específicos na gelatinosa substantia.
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Visão Geral
Este estudo descreve os procedimentos para realizar gravações por microeletrodo de placa inteira em neurônios da substância gelatinosa (SG) em fatias de medula espinhal in vitro. Ao empregar este método, os pesquisadores podem investigar as propriedades intrínsecas da membrana, a transmissão sináptica e as características morfológicas dos neurônios da SG.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Eletrfisiologia
- Biologia Celular
Antecedentes
- A substância gelatinosa é fundamental para compreender o processamento sensorial e a regulação da dor.
- O registro de potencial em modo de célula inteira pode elucidar as propriedades eletrofisiológicas desses neurônios.
- Este método melhora a preservação neuronal e simula condições in vivo.
- Compreender os neurônios da substância gelatinosa pode fornecer insights sobre os mecanismos da dor crônica.
Objetivo do Estudo
- Descrever a metodologia para gravações de patch-clamp em fatias de medula espinhal.
- Investigar as propriedades intrínsecas dos neurônios da substância gelatinosa.
- Explorar a transmissão sináptica em relação aos mecanismos da dor.
Métodos Utilizados
- Registros por patch-clamp em células inteiras realizados em fatias de medula espinhal in vitro.
- O modelo biológico foca nos neurônios da substância gelatinosa.
- Nenhum fluxo de trabalho de multiômica é mencionado no texto.
- Os passos críticos incluem o preparo de ACSF à base de sacarose, o isolamento do segmento da medula espinhal e o corte do tecido dentro de limites temporais específicos.
- As técnicas de registro incluem o ajuste de potenciais de retenção e a identificação das propriedades neuronais sob microscópio.
Resultados Principais
- O estudo apresenta um protocolo para identificar e registrar atividade de neurônios do gânglio esfenopalatino, permitindo a caracterização detalhada de suas propriedades eletrofisiológicas.
- Alterações eletrofisiológicas e padrões de disparo podem ser analisados para obter informações sobre a excitabilidade neuronal e a dinâmica sináptica.
- As respostas biológicas principais incluem a caracterização de padrões de disparo tônico e outros padrões de disparo com base nas condições experimentais.
- O método facilita a exploração dos mecanismos de modulação da dor com base nas atividades sinápticas.
Conclusões
- A metodologia descrita permite a investigação da funcionalidade dos neurônios do gânglio espinhal e é fundamental para compreender as vias da dor.
- A precisão do método e a preservação dos neurônios aumentam sua aplicabilidade na pesquisa em neurociência.
- Os achados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à dor crônica e à transmissão sensorial.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a caracterização eletrofisiológica detalhada de neurônios da substância gelatinosa, apoiando a validação de alvos na pesquisa de vias da dor. Ao preservar a integridade neuronal e imitar condições in vivo, aumenta a confiança preditiva em estudos mecanicistas da transmissão nociceptiva e do desenvolvimento da dor crônica. O método facilita a verificação de hipóteses e a elucidação de vias essenciais para as fases iniciais da descoberta de fármacos com foco em neurociência.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas relacionadas aos mecanismos de transmissão sensorial e regulação da dor.
- Valor Científico: Apoia a validação funcional de alvos ao caracterizar a excitabilidade neuronal e as propriedades sinápticas em circuitos relevantes para doenças.
- Valor Científico: Contribui para a redução de riscos mecanicistas por meio da avaliação quantitativa das propriedades intrínsecas da membrana e dos padrões de disparo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Fornece um método reprodutível de preparação de fatias de medula espinhal, permitindo sistemas padronizados de ensaio para triagem de compostos.
- Valor Operacional: Garante a viabilidade e estabilidade das fatias dentro de limites definidos de tempo e temperatura, apoiando leituras eletrofisiológicas consistentes.
- Valor Operacional: Facilita a medição quantitativa de correntes pós-sinápticas e padrões de disparo neuronal como pontos finais do ensaio.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Oferece modelagem de sistemas relevantes para doenças ao estudar os mecanismos espinhais subjacentes ao desenvolvimento da dor crônica e da coceira.
- Valor Científico: Apoia o alinhamento translacional de biomarcadores ao vincular fenótipos eletrofisiológicos a vias de regulação nociceptiva.
- Valor Operacional: Permite continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de gravações estáveis em regime de corrente e tensão constantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, fornecendo dados eletrofisiológicos que auxiliam na avaliação precoce de compostos na pesquisa da dor.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias em circuitos nociceptivos da medula espinhal por meio de gravação neuronal direta.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas, como correntes pós-sinápticas excitatórias e inibitórias, para avaliação do efeito de compostos.
- Análises: Permite a análise estatística de padrões de disparo e correntes sublimiares para comparar condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao modelar o processamento espinhal de sinais de dor relevante para humanos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para investigar múltiplos alvos dentro da via da dor utilizando preparação consistente de fatias.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva no engajamento do alvo por meio da caracterização detalhada das propriedades neuronais e da transmissão sináptica.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio de parâmetros definidos de corte, protocolos de oxigenação e controles de temperatura.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de prosseguir/não prosseguir ao reduzir a ambiguidade mecanicista na modulação das vias da dor.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos com base em seus efeitos na função neuronal da substância gelatinosa.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletrofisiologia, dissecação de tecidos e visualização microscópica para o preparo bem-sucedido de fatias e gravação.
- Depende de instrumentação, incluindo vibrátomo, micromanipulador, amplificador de patch-clamp e sistemas de oxigenação para ACSF.
- Necessita padronização entre equipes quanto à orientação do corte, composição das soluções e protocolos de tempo entre laboratórios.
- Envolve considerações de adaptação ao aplicar o método a diferentes segmentos da medula espinhal ou espécies além de modelos roedores.
- Inclui limitações práticas, como a janela de 15–20 minutos para o preparo da fatia e a restrição de espessura de 600 micrômetros para visibilidade celular ideal.
