Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral
17 de novembro de 2018
Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para a administração oral de antibióticos para ratos, coleta de amostras fecais, extração de DNA e quantificação de bactérias fecais por qPCR.
Este protocolo fornece um método confiável para quantificar as alterações é a microbiota intestinal de camundongos após a administração de antibióticos orais. Isso pode ajudar a pesquisar sobre interações de microbiota cruzada fornecendo insights sobre as patologias associadas à disbiose microbiana, como a doença inflamatória intestinal. A principal vantagem desses regimes de tratamento de antibióticos é que eles previnem a perda de peso característica normalmente associada à administração de antibióticos orais aos camundongos.
Para pré-formar o tratamento com antibióticos através de gavage oral prepare um coquetel de antibióticos misturando soluções de estoque que foram preparadas como descrito no protocolo técnico. Para um volume de mililitros misturam 50 microliters de ampicilina, 50 microliters de gentamicina, 50 microliters de neomicina, 500 microliters de metronidazole, 25 microliters de vancomicina e 325 microliters de água. Carregue a mistura de antibióticos em uma seringa de um mililitro, eliminando quaisquer bolhas e conecte uma agulha de gavage de gálada apropriada.
Pegue a pele sobre o ombro do rato firmemente e estique a cabeça e o pescoço para endireitar o esôfago. Direcione a ponta da bola da agulha de alimentação ao longo do céu da boca e para a parte de trás da faringe. Em seguida, passe-o suavemente para o esôfago e injete os 200 microliters de solução.
Administre o coquetel antibiótico uma vez por dia durante o experimento. Alternativamente para administrar antibióticos através da água potável, prepare um coquetel de antibióticos como descrito no protocolo técnico. É importante incluir adoçante na mistura de antibióticos, pois este é um fator crucial para evitar a desidratação dos camundongos.
Encha o coquetel antibiótico em uma garrafa de água a aproximadamente 100 mililitros por garrafa. Proteja a garrafa da luz e coloque em uma gaiola de rato. Substitua o coquetel antibiótico por estoque fresco duas vezes por semana durante a duração do experimento.
O monitoramento cuidadoso do peso dos camundongos e o estado geral de saúde devem ser pré-formados diariamente durante toda a administração de antibióticos. Pesar e rotular dois tubos de autoclave mililitro para coleta de amostras. Para a coleta de amostras de fezes frescas coloque cada rato em um contidor.
Em seguida, colete pelotas fecais diretamente do ânus em um tubo de coleta. Após a realização da eutanásia, conforme descrito no protocolo técnico, havia uma carcaça de rato com o abdômen totalmente exposta e pulverizar a área abdominal com 70% de etanol. O uso de fórceps esterilizados e tesouras fazem uma incisão transversal no abdômen para expor o peratenium sem danificar nenhum tecido interno.
Levante o peratenium e faça uma incisão para expor os intestinos. Remova os intestinos com as fórceps e a tesoura e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Use cuidadosamente fórceps para provocar o intestino delgado longe das artérias mesentéricas e gordura.
Estenda o intestino e coloque-o em uma limpeza de laboratório limpa. Com uma medida de régua e corte quatro centímetros do íleo distal do intestino delgado. Corte e descarte o centímetro do intestino proximal ao ceco.
Restará uma porção de três centímetros de íleo que será usada para coletar bactérias intestinais. Segure a porção de ímuo sobre um tubo estéril de dois mililitros. Colete o conteúdo intestinal extrudando diretamente o intestino e coletando a amostra no tubo.
Esta amostra terá bactérias do conteúdo de íleo. Prepare uma seringa de 20 mililitros com soro fisátil tamponado de fosfato frio e lave a porção de íleo descartando o fluxo. Coloque a porção de ímuto em uma placa de Petri estéril e abra-a longitudinalmente com uma tesoura.
Raspe o interior da parede do íleo com um bisturi. Colete qualquer bactéria no bisturi lavando-a com um mililitro de PBS sobre um tubo de centrífuga limpo. Gire a oito mil vezes G por cinco minutos para pelotar as bactérias.
Após a centrifugação descartar o supernante. Esta amostra conterá bactérias da parede do íleo. Pese os tubos contendo as amostras de fezes e íleo.
Subtraia o peso dos tubos vazios para obter o peso fecal em cada amostra. Extrair DNA bacteriano de fezes, conteúdo de íleo e amostras de parede de íleo usando kits disponíveis comercialmente. Armazene as amostras de DNA a menos 20 graus Celsius até usar.
Descongele o padrão qPCR, DNA de amostra fecal e reagentes qPCR de um kit comercialmente disponível no gelo. Diluir o padrão em água livre de DNA estéril em uma faixa de 10 a 7 a 10 até as duas cópias por microliter. Diluir o DNA da amostra fecal para metade, um quinto e um décimo de concentrações.
Em seguida, faça uma reação de mixagem mestre para o número total das reações mais uma. Misture 30 microliters da mistura mestre e 5 microliters do modelo, que é o padrão, amostra ou água para o controle negativo. Em seguida, adicione 10 microliters deste mix a cada poço em uma placa qPCR 384 bem óptica.
Realize cada reação em triplicado. Sele brevemente a placa qPCR e centrífuga. Em seguida, carregue a placa na máquina qPCR que está programada como listada no protocolo técnico.
Finalmente obtenha os valores do limiar de ciclo para o padrão e amostras antes de calcular os números de cópia 16S rDNA para amostras fecais. Os resultados representativos mostram perda de peso em camundongos após a administração de antibióticos por gavage oral ou através da água potável. Nenhuma perda de peso perceptível é detectada em camundongos que recebem antibióticos por gavage oral.
Quando os camundongos são tratados com antibióticos na água potável, eles perdem cerca de 10% de seu peso corporal nos primeiros dias de tratamento, mas recuperam o ganho normal de peso posteriormente. A quantificação de bactérias em amostras fecais requer o uso de uma curva padrão obtida pelo plotagem do logaritmo do número da cópia para o padrão versus os valores C-T obtidos no qPCR. Dentro da faixa linear, a equação de análise de regressão permite quantificação da abundância de rDNA 16S dentro das amostras fecais.
Como mostrado aqui para fezes, conteúdo de intestino delgado e amostras de parede de intestino delgado. Após cinco ou dez dias de administração de antibióticos orais, há uma forte diminuição na densidade de bactérias em amostras de fezes de camundongos tratados com antibióticos. No entanto, a densidade de bactérias nas fezes se recuperou para níveis normais uma semana após a administração de antibióticos ser interrompida.
Tanto o gavage oral quanto a administração de antibióticos na água potável diminuem brevemente a carga bacteriana fecal em camundongos tratados. Pesquisadores que selecionam o método individual que melhor se encaixa nos requisitos experimentais considerando fatores como a duração do tratamento. O método qPCR para quantificação de bactérias pode ser modificado para quantificar a taxa bacteriana individual usando primers específicos.
Isso fornecerá informações quantitativas e qualitivas sobre o tamanho e a composição do microbioma.
Visão Geral
Este protocolo fornece um método confiável para quantificar alterações na microbiota intestinal de camundongos após a administração oral de antibióticos. Ele auxilia pesquisas sobre interações da microbiota e patologias associadas à disbiose microbiana.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Neurociência
- Farmacologia
Antecedentes
- Compreender o impacto dos antibióticos na microbiota intestinal é essencial para estudar doenças relacionadas.
- O tratamento com antibióticos pode levar à disbiose microbiana, afetando a saúde geral.
- A perda de peso é um efeito colateral comum da administração de antibióticos em camundongos.
- Protocolos para administração e monitoramento eficazes são essenciais para resultados precisos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método para administrar antibióticos a camundongos sem perda significativa de peso.
- Coletar e analisar amostras fecais para quantificação de DNA bacteriano.
- Investigar os efeitos dos antibióticos na composição da microbiota intestinal.
Métodos Utilizados
- Preparação de coquetéis de antibióticos para administração por gavagem oral ou água de bebida.
- Coleta de amostras fecais e conteúdo intestinal após eutanásia.
- Extração de DNA das amostras utilizando kits comerciais.
- Quantificação de bactérias por meio de análise de qPCR.
Resultados Principais
- Camundongos que receberam antibióticos por gavagem oral não apresentaram perda significativa de peso.
- A administração de antibióticos na água de beber resultou em perda inicial de peso, mas foi observada recuperação.
- A quantificação do DNA bacteriano revelou alterações significativas na composição da microbiota.
- Curvas-padrão foram estabelecidas para a medida precisa da abundância de rDNA 16S.
Conclusões
- O protocolo minimiza efetivamente a perda de peso durante o tratamento com antibióticos em camundongos.
- Oferece um método confiável para estudar os efeitos dos antibióticos na microbiota intestinal.
- Os achados contribuem para a compreensão da disbiose microbiana e suas implicações para a saúde.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite a quantificação confiável de alterações na microbiota intestinal murina após tratamento com antibióticos orais, apoiando estudos pré-clínicos de disbiose microbiana associada a imunopatologias. Ao minimizar artefatos de perda de peso, melhora a interpretabilidade dos dados para validação de alvos em modelos de inflamação e doenças mediadas pelo sistema imunológico. O ensaio de densidade bacteriana baseado em qPCR fornece resultados quantitativos e reprodutíveis, essenciais para a redução de riscos mecanicistas e para a confiança preditiva em fluxos de trabalho de descoberta precoce.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses sobre a interação entre microbiota e sistema imunológico em modelos de doenças inflamatórias intestinais e artrite.
- Valor Operacional: Fornece regimes de antibióticos com estabilidade de peso que reduzem variáveis de confusão na avaliação do fenótipo-alvo.
- Valor Preditivo: Apoia a validação funcional de alvos ao correlacionar alterações na densidade microbiana com respostas funcionais das células imunes.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Prontidão do ensaio: Fornece preparação padronizada de amostras fecais e extração de DNA compatível com plataformas de qPCR de alto rendimento.
- Saída quantitativa: Gera medições do número de cópias de rDNA 16S por meio de curvas-padrão, permitindo consistência entre lotes em estudos de modulação do microbioma.
- Escalabilidade: Suporta delineamentos amostrais longitudinais para campanhas de triagem de resposta à dose e curso temporal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela a disbiose induzida por antibióticos observada em pacientes humanos, aumentando a validade translacional dos achados pré-clínicos.
- Redução Mecanística de Riscos: Relaciona alterações na comunidade microbiana à função de células imunes, reduzindo ambiguidades nas relações entre vias e alvos.
- Continuidade Pré-clínica: Permite o acompanhamento longitudinal da recuperação da microbiota após o tratamento, contribuindo para avaliações de segurança e riscos de resistência.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a otimização de compostos líderes, oferecendo a modulação da microbiota como uma variável mecanicista em programas de imunologia e doenças infecciosas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre fenótipos dependentes da microbiota em modelos de doenças por meio de perturbação controlada com antibióticos.
- Triagem: Permite amostras de microbioma prontas para ensaios, para avaliação dos efeitos de compostos sobre a carga bacteriana e a composição.
- Análise: Fornece dados quantitativos de abundância de rDNA 16S que permitem comparação entre condições e cálculo do tamanho do efeito.
- Pesquisa Translacional: Relaciona alterações da microbiota murina com padrões de disbiose relevantes para humanos, apoiando desenhos de estudo alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade de quantificação da microbiota reutilizável em diversas áreas terapêuticas e sistemas modelo.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva ao reduzir fatores de confusão relacionados à perda de peso em estudos sobre microbiota e sistema imunológico.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de coquetéis padronizados de antibióticos e etapas de validação por qPCR.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou interromper projetos ao fornecer vínculos mecanicistas entre alterações microbianas e desfechos imunológicos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na relevância da doença dependente da microbiota.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em manuseio de camundongos, técnica de gavagem oral e processamento de amostras anaeróbicas.
- Depende de equipamentos para qPCR, geração de curva padrão e compatibilidade com kits de extração de DNA.
- Necessita padronização entre equipes para coleta de amostras, armazenamento e procedimentos de normalização.
- Envolve considerações de adaptação ao estender o método a diferentes linhagens de camundongos, combinações de antibióticos ou segmentos intestinais.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de eutanásia para obter tecido intestinal e a variabilidade potencial no rendimento de pelotas fecais.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
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Title
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Administration of Antibiotics
2:29
Collection of Fecal Samples from Stool, Ileum Content and Ileum Wall
5:16
Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR
6:33
Results: Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR after Oral Antibiotic Treatment
7:51
Conclusion
