Name: Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Aprenda a quantificar mudanças na microbiota intestinal de camundongos após tratamento antibiótico oral usando qPCR. Este método minimiza a perda de peso e permite análises precisas da composição bacteriana.

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Este trabalho foi financiado pelo Conselho de pesquisa médica UK (subvenção ao senhor p. b/L008157/1); R.J. foi apoiado por uma bolsa de Marie Marie Curie (H2020-ACEM-IF-2015-703639); P.M.B. foi apoiado por uma bolsa de estudo do Conselho de pesquisa médica do Reino Unido e faculdade Londres doutorado parceria do rei formação em ciências biomédicas (Sr/N013700/1).

Foram realizados experimentos descritos aqui, usando de 6 a 8 semanas velhos ratos de tipo selvagem (C57BL6/J) mantidos em uma instalação do patógeno específico livre (SPF). Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo College de Londres do rei e o Francis Crick Instituto bem-estar Animal e corpo de revisão ética e o Home Office do Reino Unido. Antes de começar qualquer procedimento animal, certifique-se de que as permissões apropriadas são obtidas através da instituição/organização local.
1. a administração de antibióticos
Nota: Dois métodos alternativos de tratamento antibiótico são fornecidos: gavagem oral (etapa 1.1) e administração de antibióticos através da água potável (etapa 1.2).
<ol><li>Gavagem oral<ol>
<li>Preparar ações de antibióticos individuais, dissolvendo-os em água esterilizada às seguintes concentrações: ampicilina 100 mg/ml, gentamicina a 100 mg/mL, neomicina 100mg/ml, metronidazol a 10 mg/mL e vancomicina em 100 mg/mL. Filtro de esterilizar usando um filtro de 0,45 µm. Alíquota e loja a-20 ° C.</li>
		<li>Prepare um coquetel de antibióticos misturando os estoques preparados acima. Para um volume de 1 mL, misture 50 µ l de ampicilina (5 mg/mL final), 50 µ l de gentamicina (5 mg/mL final), 50 µ l de neomicina (5 mg/mL final), 500 µ l de metronidazol (5 mg/mL final), 25 µ l de vancomicina (2,5 mg/mL final) e 325 µ l de água. Prepare o coquetel fresco antes da utilização.</li>
		<li>Carregar a antibiótica mistura em uma seringa de 1ml estéril e fixar uma agulha de gavagem de calibre adequado (20 G para ratos de 15 – 20 g) ao eliminar quaisquer bolhas.</li>
		<li>Ratos de gavage com 200 µ l de mistura de antibiótica.<ol>
<li>Pegue a pele por cima do ombro do mouse firmemente, esticar a cabeça e o pescoço para endireitar o esôfago. Direcionar a bola-ponta da agulha alimentação ao longo do teto da boca e para trás da parede posterior da faringe. Em seguida, delicadamente passá-lo para baixo para o esôfago e injecte a solução de 200 μL.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Administre a antibiótica cocktail vez diariamente para a duração do experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Antibióticos na água potável Cuidado: Monitorize cuidadosamente peso rato diariamente para as duas primeiras semanas de administração de antibiótica na água potável.<ol>
<li>Preparar um coquetel de antibióticos dissolvendo-se o seguinte em 1 litro de água esterilizada: 1 g de ampicilina (1G/L final), 1 g de neomicina (1 g/L final), 1 g de metronidazol (1G/L final), 0,5 g de vancomicina (0,5 g/L final) e 8 sachês (0,75 g cada) de artificial adoçante (60 g/L final). Agite até dissolver. Loja a 4 ° C. Nota: O adoçante é adicionado para esconder o sabor de antibióticos e prevenir a desidratação de ratos. Enquanto várias marcas de adoçantes podem funcionar, a concentração final necessária pode ser diferente para cada marca específica.</li>
		<li>Preencher o coquetel de antibióticos dentro de uma garrafa de água (~ 100 mL/frasco) e coloque a garrafa em uma gaiola do rato. Nota: Usar garrafas marrons ou cobrir as garrafas com papel alumínio para proteger os antibióticos de luz.</li>
		<li>Substitua o coquetel de antibióticos com estoque fresco duas vezes por semana durante a duração do experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. coleta de amostras fecais de fezes, conteúdo do íleo e parede do íleo
<ol><li>Pesar e etiquetar mL 2 tubos esterilizados para coleta de amostra.</li>
	<li>Recolha de amostras de fezes frescas, coloque cada rato em uma retenção e recolher pelotas fecais diretamente do ânus em um tubo de coleta. Nota: Amostras também podem ser obtidas colocando ratos em uma gaiola limpa autoclavada e coletando amostras de fezes com Pinças esterilizadas limpas.</li>
	<li>Eutanásia em ratos com CO2 asfixia seguida por deslocamento cervical.</li>
	<li>Colocar uma carcaça do mouse com o abdômen completamente exposto e pulverizar a área abdominal com etanol a 70%.</li>
	<li>Usando uma tesoura e pinça esterilizada, fazer uma incisão transversa no abdômen para expor o peritônio sem danificar qualquer tecidos internos. Levante o peritônio e fazer uma incisão para expor os intestinos.</li>
	<li>Remover os intestinos, (do cólon, estômago), com a pinça e a tesoura e coloque-o em uma placa de Petri estéril.</li>
	<li>Com cuidado, use fórceps para arreliar o intestino delgado (SI) longe das artérias mesentéricas e gordura. Estender o intestino e colocá-lo em uma limpeza de laboratório limpo.</li>
	<li>Com uma régua, meça e corte 4 cm do íleo distal de SI (a parte mais próxima ao ceco). Corte e elimine a 1 cm do intestino proximal ao ceco. Vai haver uma porção de 3 cm de íleo deixada que será usado para coletar as bactérias intestinais.</li>
	<li>Mantenha a porção do íleo (3 cm) sobre um tubo estéril de 2 mL. Recolha o conteúdo intestinal por extrusão diretamente do intestino e colecionando a amostra no tubo. Esta amostra terá bactérias do conteúdo do íleo.</li>
	<li>Preparar uma seringa de 20 mL com soro fisiológico frio tamponado de fosfato (PBS) e liberar a porção do íleo (descarte o escoamento).</li>
	<li>Coloque a porção de íleo em uma toalha de papel limpa e abri-lo no sentido longitudinal, com uma tesoura.</li>
	<li>Raspe o interior da parede íleo com um bisturi.</li>
	<li>Recolha todas as bactérias sobre o bisturi lavando o bisturi com 1 mL de PBS sobre um tubo de centrífuga limpo. Girar a 8.000 × g por 5 min para as bactérias de pelotas e descartar o sobrenadante. Este exemplo irá conter bactérias da parede do íleo. Nota: Amostras fecais de fezes, conteúdo do íleo e parede podem ser congeladas e armazenadas a-80 ° C até o uso.</li>
	<li>Pesar os tubos contendo as amostras de fezes e íleo de conteúdo e subtrair o peso dos tubos de vazio (da etapa 2.1) para obter o peso fecal em cada amostra.</li>
	<li>Extrai ADN bacteriano de fezes, conteúdo do íleo e amostras de parede do íleo usando kits comercialmente disponíveis. Armazenar as amostras de DNA a-20 º C até o uso.</li>
</ol>3. quantificação da Microbiota Intestinal por qPCR
Nota: Este procedimento inclui a geração de um padrão (passo 3.1) e o método de afinação de qPCR para amostras fecais e padrão (passo 3.2)
<ol><li>Geração de um padrão para qPCR<ol>
<li>Use a reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar o DNA genômico extraído de uma cultura bacteriana usando os reagentes13 e as condições PCR detalhadas no quadro 1do gene 16S rRNA.</li>
		<li>Executar o produto do PCR em um gel de agarose 1,5% e purificar a banda de DNA usando um kit de extração de DNA disponível comercialmente.</li>
		<li>Ligate fragmento do DNA purificado usando uma clonagem kit (veja a Tabela de materiais, usar um vetor contendo marcadores de resistência aos antibióticos e fusão de gene β-galactosidase (LacZ) para a seleção de colônia azul/branco) e transformar DH10 competentes Escherichia coli seguindo as instruções do fabricante. Placa de transformação para ampicilina (100 µ g/mL), placas de ágar de Luria Bertani (LB) X-galão (20 µ g/mL) (10 g/L triptona, 5g/L de extrato de levedura, 10 g/L de NaCl, 15 g/L de ágar). Incubar durante a noite (O/N) a 37 ° C.</li>
		<li>Selecione uma colônia única positivo (branco) da placa. -Inocular em caldo LB de 5 mL contendo 100 mg/mL ampicilina e incubar O/N a 37 ° C, agitação a 250 rpm.</li>
		<li>Da cultura O/N, isolar e purificar o plasmídeo usando um kit miniprep comercial de acordo com as instruções do fabricante. Nota: É importante para a inserção do plasmídeo de sequências nesta fase, para garantir que o plasmídeo contém somente uma cópia do gene 16S rRNA e determinar seu comprimento em pares de bases (bp).</li>
		<li>Linearizar o plasmídeo com uma enzima de restrição que corta o plasmídeo de uma só vez.</li>
		<li>Purifica o plasmídeo linear usando um kit disponível comercialmente.</li>
		<li>Determinar a concentração do plasmídeo por medir a absorvância a 260 nm, utilizando um espectrofotômetro.</li>
		<li>Calcule o número de cópias do plasmídeo / µ l de amostra usando a seguinte fórmula14: número de cópias = (quantidade * 6.022 × 1023) / (comprimento * 1 × 109 * 650) onde a quantidade é a concentração de DNA obtida na etapa 3.1.8 (em µ ng/l); e o comprimento é o comprimento total do plasmídeo (com a inserção) no bp. O número de cópias serão obtidos como cópias / µ l. Nota: Existem ferramentas on-line com base na fórmula acima que permitem o fácil cálculo do número de cópias do plasmídeo.</li>
		<li>Alíquota e armazenar o padrão conforme necessário a-20 º C até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>qPCR set-up para Standard e amostras fecais<ol>
<li>Descongele o qPCR padrão (da etapa 3.1.10), DNA de amostras fecais (da etapa 2.15) e qPCR reagentes (a partir de um kit comercialmente disponível) no gelo. Nota: qPCR reagentes usados neste exemplo incluem a mistura de reação SYBR Green qPCR e primers para diante e reversos (tabela 2).</li>
		<li>Diluir o padrão em água estéril livre de DNA em uma escala de 107 a 102 cópias / µ l (diluições em série, por exemplo, 1/5 de 107 a 6,4 x 102 cópias / µ l). Diluir a amostra fecal DNA para 1/2, 1/5, 1/10.
</li>
		<li>Fazer uma reação de mistura de mestre para o número total de reações mais 1 (tabela 2).</li>
		<li>Mix de 30 µ l de mistura principal e 5 µ l de modelo (norma, amostra ou água para controle negativo)</li>
		<li>Adicione 10 µ l desta mistura para cada poço em um prato de qPCR 384-bem óptico. Realize cada reação em triplicado.</li>
		<li>Selar o lugar de qPCR, centrifugue brevemente e carregar a placa na máquina qPCR programada com as seguintes condições de ciclismo: 95 ° C por 20 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 60 ° C por 1 min.</li>
		<li>Obter valores CT padrão e amostras.</li>
		<li>Gera uma curva de calibração plotando os valores de CT para os padrões versus o logaritmo do número de cópia do plasmídeo (como calculado na etapa 3.1.9). Realize a regressão linear da curva padrão.</li>
		<li>Calcule o número de cópias de rDNA 16S para amostras fecais por interpolação valores CT (obtidos na etapa 3.2.2) na curva padrão. Nota: 16S rDNA, número de cópias para cada amostra deve ser corrigido Considerando o factor de diluição da amostra (preparada no passo 3.2.2), os volume final os ácidos nucleicos que foram eluídos (na etapa 2.15) e a quantidade de amostra fecal (calculado na etapa 2.14) para obter cópias do gene por grama de fezes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui nós fornecemos protocolos experimentais para a administração oral de antibióticos para ratos e quantificação de bactérias fecais por qPCR. A combinação de antibióticos usados em alvos deste protocolo (contendo ampicilina e gentamicina, neomicina, metronidazol, vancomicina) bactérias gram-positivas e Gram-negativas, oferecendo atividade bactericida contra um espectro completo de bactérias. Tanto a gavagem oral e a administração de antibióticos na água potável diminuem consideravelmente bacteriana fecal carregar5,6,12. Além disso, ambos os tratamentos têm um profundo efeito sobre o fenótipo dos ratos como eles desenvolvem várias características típicas dos ratos germ-free incluindo tamanho reduzido do baço e alargada do ceco. A seleção de um método específico para administração de antibióticos pode possivelmente depende da duração do experimento como o método de gavagem oral requer a administração diária de antibióticos, sendo mais trabalhosas e possivelmente causando mais desconforto para o animais em longo prazo.
Para a administração de antibióticos na água potável, cuidado deve ser tomado com a adição de adoçante à mistura de antibióticos como este é um fator crucial para manter os ratos da desidratação. Vários grupos têm mostrado como a administração de antibióticos em água potável (sem adição de adoçante) conduz à muito grave e rápida perda de peso com todos os mouses perder mais de 20% do peso corporal inicial dentro dos primeiros dias do experimento5 , 6. em nosso protocolo, o uso de adoçante sacarina baseado parecia ser suficiente para mascarar o sabor de antibiótico na água e os ratos perdida peso nos primeiros dias após a administração de antibióticos, mas recuperou seus pesos rapidamente após essa ( Figura 1). No entanto, em nossos experimentos 5-10% dos ratos ainda alcançar o ponto de extremidade humano de > 20% perda de linha de base de peso corporal e precisava ser sacrificado. Nós também testamos adoçantes sucralose-baseado que falharam completamente para evitar a desidratação de camundongos (100% dos ratos perdidos > 20% do peso) enquanto outros autores publicaram falhas semelhantes para adoçantes aspartame-baseado5,6. Somado a isso, a idade, fundo genético e estado de saúde geral dos ratos utilizados para os experimentos devem ser consideradas, como eles podem influenciar a perda de peso e bem-estar animal, durante o tratamento com antibióticos. Assim, o acompanhamento atento dos ratos peso e estado de saúde geral deve ser realizada diariamente durante as duas primeiras semanas de administração oral de antibióticos.
qPCR métodos fornecem uma abordagem rápida e econômica para quantificação de 16S rRNA em amostras fecais. No entanto, algumas limitações devem ser consideradas em relação esta técnica incluindo: eu) a exigência de um padrão confiável de alta qualidade; II) o design e a eficiência dos primers qPCR; III) o fato de que os microorganismos podem ter números diferentes de cópia do gene 16S rRNA, assim cópias do gene não podem diretamente ser igual de contagens de célula15. Não obstante, qPCR é um método robusto e sensível, que permite a rápida análise de amostras fecais. Esse método pode ser especialmente útil para validar rapidamente o efeito de diversos tratamentos (incluindo antibióticos) em cargas de bactérias fecais como detalhada aqui. Além disso, embora nós fornecemos um protocolo para a quantificação do total 16S rRNA, esse método pode ser facilmente adaptado (por projetar primers específicos16) para permitir a identificação dos táxons bacterianas individuais, proporcionando assim tanto quantitativa e informações qualitativas sobre microbiome tamanho e composição.
Em resumo, nós fornecemos dois protocolos de tratamento antibiótico oral de ratos e um método baseado em qPCR quantificar alterações induzida por antibióticos em bactérias fecais. Embora estes protocolos podem ser ainda mais otimizados e combinados com outras abordagens de acordo com as necessidades individuais de experimentais, podem servem como ferramentas de rápida, econômicas e confiáveis para manipular a microbiota intestinal murino e para estudar os efeitos do tratamento com antibiótico na homeostasia intestinal e doença.

A mucosa gastrointestinal dos mamíferos é um ambiente único, colonizado por uma mistura altamente complexa de microorganismos que estabelecem uma relação mutualista com o host. O sistema de defesa da mucosa intestinal é composto por uma camada epitelial e uma infinidade de células do sistema imunológico que restringem os comensais dentro do intestino, preservando o seu número e diversidade. Por outro lado, organismos comensais são necessários para o desenvolvimento de um sistema imune completamente funcional. Enquanto as interações entre host e bactérias comensais são normalmente benéficas, torna-se cada vez mais claro que esse diagrama de sistema imunológico microbiota desregulação pode favorecer o desenvolvimento de doenças inflamatórias crônicas, tal asinflammatory do intestino artrite asma ou doença1,2.
A microbiota do intestino pode ser alterada por vários fatores, mas talvez as alterações mais drásticas são induzidas por tratamento com antibióticos que severamente altera o tamanho e a composição de comunidades bacterianas3,4. Enquanto os benefícios de antibióticos para tratar infecções são inquestionáveis, as alterações da microbiota induzidas pela exposição aos antibióticos nos seres humanos também podem modificar as defesas imunitárias que podem levar a efeitos nocivos sobre a saúde. Por exemplo, o tratamento com antibióticos nos seres humanos tem sido associado a um risco aumentado de Clostridium difficile-induzida por certos tipos de câncer3, asma e diarreia. Tratamento antibiótico em camundongos recapitula o impacto e a longo prazo alterações encontradas em comunidades de intestino de pacientes tratados com antibióticos e permitiu a investigação das ligações entre alterações em comunidades microbianas e função imune celular mecanicistas. No entanto, vários relatos têm demonstrado que a administração de antibióticos sobre a água potável ad libitum resulta em perda de peso muito perceptível como ratos abster-se de água potável, presumivelmente devido ao seu mau gosto5,6. Assim, nestes modelos a desidratação grave concomitante à administração de antibióticos oral pode complicar a interpretação de experimentos com o objetivo de identificar o efeito do tratamento com antibiótico na função imune celular.
Várias abordagens podem ser usadas para explorar o tamanho e a composição de comunidades microbianas no compartimento intestinal7. Próxima geração tecnologias de sequenciamento apresentaram dados inestimáveis sobre esta questão8, no entanto, estes métodos são relativamente caros e exigem análises de bioinformatic perito para interpretação dos dados. Por outro lado, métodos tradicionais de cultura microbiológica permitam a detecção das espécies bacterianas, mas eles têm baixa sensibilidade e uma grande fração de bactérias comensais (particularmente anaeróbios) são muito difíceis ou impossíveis de se cultivar com métodos atualmente disponíveis8. Técnicas de reação em cadeia (qPCR) polimerase quantitativos estão sendo usadas cada vez mais para quantificação e identificação de espécies bacterianas fecais, que proporcionam uma rápida e confiável independente de cultura medida da carga microbiana total. Por conseguinte, qPCR métodos provaram útil para estudar as mudanças na microbiota associada com a idade ou com a progressão de várias doenças, incluindo a doença de entranhas inflamatório9,10. Dessa forma, qPCR métodos fornecem uma abordagem rápida e econômica para validar o efeito de diferentes tratamentos (incluindo antibióticos) em cargas de bactérias fecais e microbiota composição10,11,12.
Aqui, apresentamos um relato detalhado passo a passo de dois protocolos distintos para administração de antibiótico oral para ratos, coleta de amostra fecal, extração de DNA, elaboração de normas e quantificação de bactérias em amostras fecais por qPCR. Esses protocolos fornecem um método confiável para manipular a microbiota intestinal em camundongos e para estudar os efeitos do tratamento com antibiótico na homeostasia intestinal e doença.

<table><tbody><tr><td>Sal de ampicilina sódica</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de sal de trissulfato de neomicnina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>N1876</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazol</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de vancomicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>V2002</td><td></td></tr><tr><td>Sal de sulfato de gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G3632</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>Y1625</td><td></td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td> <td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Adoçante Sweet'n Low</td><td>Sweet'N Low</td><td></td><td>Disponível no Reino Unido a partir de Amazon.co.uk</td></tr><tr><td>X-Gal (5-brom-4-cloro-3-indoil BD-galactopiranosídeo)</td> <td>Fisher Salino</td> Tampolado <td>com</td> Fosfato da scientific 10234923 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Ultrapura</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau RT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9935</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polimerase de Alta Fidelidade</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Desoxinucleotídeo (dNTP) Solução Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725124</td><td>com clonagem ROX</td></tr><tr><td>TOPO TATM para sequenciamento</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp fast DNA Stool mini kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick gel&nbsp; kit de extração</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de seringa 0.45 &micro; m</td><td>Fisher scientific</td><td>10460031</td><td></td></tr><tr><td>Swann-MortonTM Lâminas de bisturi estéreis de aço carbono Seringa</td><td>de 11792724</td><td></td><td>científica Fisher</td></tr><tr><td>(1 mL)</td><td>Seringa de 303172</td><td></td><td></td>BD Plastipak</tr><tr><td>(20 mL)</td><td>BD Plastipak</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo de microcentríguo cristalino</td><td>StarLab</td><td>E1415-1500</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Ultra alto tubo de microcentrífuga de recuperação</td><td>StarLab</td><td>I1420-2600</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de dosagem oral 20 G x 38 mm curvadas (pk/3)</td><td>Vet-Tech</td><td>DE008A</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de Esterilização 50 mm&nbsp;</td><td>Suprimentos de Laboratório Científico</td><td>PET2020</td><td></td></tr><tr><td>selos de placa qPCR absolutos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB1170</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmpTM placa óptica de 384 poços&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems</td><td>)4309849</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7TM 7 sistema de PCR em tempo real com bloco de 384 poços</td><td>Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems)</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro (Nanodrop 1000)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Prism microcentrífuga</td><td>Labnet</td><td>C2500</td><td></td></tr><tr><td>MultiGene Optimax Termociclador</td><td>Labnet</td><td>TC9610</td><td></td></tr></tbody></table>

polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino microbiota intestinal após o tratamento antibiótico oral

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

A microbiota do intestino tem uma influência central na saúde humana. Disbiose microbiana é associado com muitos immunopathologies comuns, tais como artrite, asma e doença inflamatória intestinal. Assim, compreender os mecanismos subjacentes a interferência do sistema imunológico microbiota é de importância crucial. Administração de antibióticos, enquanto ajudava o afastamento do agente patogénico, também induz mudanças drásticas no tamanho e composição das comunidades bacterianas intestinais que podem ter um impacto sobre a saúde humana. Tratamento antibiótico em camundongos recapitula o impacto e a longo prazo mudanças na microbiota humana de antibióticos pacientes tratados e permite que a investigação das ligações entre alterações em comunidades microbianas e função imune celular mecanicistas. Enquanto vários métodos de tratamento antibiótico de ratos têm sido descritos, algumas delas induzem severa desidratação e perda de peso, complicando a interpretação dos dados. Aqui, nós fornecemos dois protocolos para administração de antibiótica oral, que pode ser usada para tratamento a longo prazo dos ratos sem induzir a maior perda de peso. Estes protocolos de fazem uso de uma combinação de antibióticos que visam tanto Gram-positiva e gram-negativa bactérias e podem ser fornecidos ou ad libitum na água potável ou por gavagem oral. Além disso, descrevemos um método para a quantificação da densidade microbiana em amostras fecais por qPCR, que pode ser usado para validar a eficácia do tratamento com o antibiótico. A combinação dessas abordagens fornece uma metodologia confiável para a manipulação da microbiota intestinal e o estudo dos efeitos do tratamento com antibiótico em camundongos.

Aqui nós fornecemos dois protocolos alternativos de tratamento antibiótico oral de ratos. A Figura 1 mostra o percentual de peso corporal (relacionado com peso de linha de base original para cada animal) em ratos tratados com antibióticos por gavagem oral (vermelha) ou na água potável (azul) durante 10 dias consecutivos. Nenhum peso-perda perceptível é encontrada nos ratos que recebem antibióticos por gavagem oral. No entanto, quando os ratos são tratados com antibióticos ad libitum na água potável, perder peso (~ 10%) dentro os primeiros dias da administração de antibióticos, mas recuperar o ganho de peso normal depois disso (Figura 1). No entanto, por volta das 5-10% dos ratos recebendo antibióticos na água potável pode chegar &gt; 20% perda de peso na primeira semana de tratamento, caso em que eles são sacrificados.
A quantificação das bactérias em amostras fecais requer o uso de uma curva padrão adequado que é obtido traçando o log do número de cópia para o padrão (como calculado no passo 3.2.2) versus os valores de CT obtidos qPCR (etapa 3.2.7). Figura 2A mostra um exemplo representativo de uma curva padrão que satisfaça os critérios de desempenho de curva padrão com um valor de2 R de 0.99827, uma inclinação de-3.09 e uma eficiência ((-1 + 10^(-1/slope))*100) de 110%. R2 valores de 0,99 e eficiências PCR dentro do intervalo de 90 a 110% são preferidos. Dentro da escala linear, a equação de regressão análise permite a quantificação da 16S rDNA abundância dentro de amostras fecais. Figura 2B mostra o número de cópias de 16S rDNA em fezes fecal, conteúdo de SI e da parede de SI. Na Figura 2B dados são mostrados como 16S rDNA cópias/g de amostra fecal de fezes fecal e conteúdo de SI. Para a parede de SI, os dados são apresentados como o número total de 16S rDNA cópias obtidas a partir de bactérias recuperadas a 3 cm da parede de SI (como a quantidade de material começar é muito pequena para obter um peso exato).
Para avaliar o efeito de antibióticos na densidade de bactérias em amostras fecais, os ratos foram tratados com antibióticos por gavagem oral diariamente por 10 dias (dias 1 a 10) e amostras de fezes foram coletadas antes (dia 0), nos pontos de tempo diferentes durante o tratamento com antibióticos ( dias 5 e 10) e 7 dias depois de parar a administração de antibióticos (dia 17; Figura 3A). Como mostrado na Figura 3B, tratamento antibiótico induz uma forte diminuição no número de cópias de 16S rDNA/g de fezes detectado nos dias 5 e 10, enquanto a densidade de bactérias nas fezes recuperadas para níveis normais (comparáveis ao pré-tratamento) 1 semana após Administração de antibióticos foi interrompida (dia 17).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig1.jpg"> Figura 1: administração de antibióticos. Os ratos receberam antibióticos por gavagem oral (vermelha) ou na água potável (azul) durante 10 dias consecutivos. Enredo mostra os pesos dos ratos durante toda a duração dos experimentos em relação ao peso original antes da administração de antibióticos (dia 0). Dados são mostrados como média ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig2.jpg"> Figura 2: amplificação de qPCR de gene 16S rRNA de padrões e amostras fecais. (A) Regressão Linear da curva de calibração com descritores de curva padrão. (B) cálculo das abundâncias de gene de amostras fecais. Dados são mostrados como média ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58481/58481fig3.jpg"> Figura 3: bactérias fecais durante o tratamento com antibióticos. (A) diagrama esquemático da agenda para a administração de antibióticos por gavagem oral (Ab) e coleta de amostra como retratado com *. (B) 16S rDNA copia por grama de fezes em amostras de fezes de ratos recolhidos no dias indicados. Dados são mostrados como média ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58481/58481fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Volume de</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA</td>
			<td>8 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampão 10 X</td>
			<td>2 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (10mM)</td>
			<td>0,4 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactérias - cartilha F (10 mM)</td>
			<td>1 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactérias - R primeira demão (10 mM)</td>
			<td>1 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq Polimerase</td>
			<td>0,2 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>7.4 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>20 Μ l</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sequências da primeira demão</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactérias - cartilha de F</td>
			<td>5' ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactérias - cartilha de R</td>
			<td>5' ATTACCGCGGCTGCTGGC 3'</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Condições de ciclismo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Temperatura</td>
			<td>Tempo</td>
			<td>Ciclos de</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>94 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>60 ° C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>1 min</td>
			<td>30 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>72 ° C</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 ° C</td>
			<td>∞</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: PCR reagentes e condições. Esta tabela fornece os reagentes e condições de ciclagem do PCR para amplificar o gene de rRNA 16S de cultura bacteriana para a geração de um padrão para usar em ensaios da qPCR. Sequências da primeira demão foram originalmente publicadas por Kruglov et al 13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Volume de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mistura de mestre SYBR Green (2x)</td>
			<td>Μ l 17,5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactérias - cartilha F (10 mM)</td>
			<td>0,7 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eubactérias - R primeira demão (10 mM)</td>
			<td>0,7 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>11.1 Μ l</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: mistura de mestre qPCR. Os volumes mostrados (volume final 35 µ l) são para uma única amostra ser executado em triplicado (10 µ l de cada) em um prato de 384-bem qPCR (contabilização de 5 µ l extra para pipetagem erro). A quantidade pode ser ampliada de acordo com o número de amostras a analisar.

Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para a administração oral de antibióticos para ratos, coleta de amostras fecais, extração de DNA e quantificação de bactérias fecais por qPCR.

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Este protocolo fornece um método confiável para quantificar as alterações é a microbiota intestinal de camundongos após a administração de antibióticos orais. Isso pode ajudar a pesquisar sobre interações de microbiota cruzada fornecendo insights sobre as patologias associadas à disbiose microbiana, como a doença inflamatória intestinal. A principal vantagem desses regimes de tratamento de antibióticos é que eles previnem a perda de peso característica normalmente associada à administração de antibióticos orais aos camundongos.Para pré-formar o tratamento com antibióticos através de gavage oral prepare um coquetel de antibióticos misturando soluções de estoque que foram preparadas como descrito no protocolo técnico. Para um volume de mililitros misturam 50 microliters de ampicilina, 50 microliters de gentamicina, 50 microliters de neomicina, 500 microliters de metronidazole, 25 microliters de vancomicina e 325 microliters de água. Carregue a mistura de antibióticos em uma seringa de um mililitro, eliminando quaisquer bolhas e conecte uma agulha de gavage de gálada apropriada.Pegue a pele sobre o ombro do rato firmemente e estique a cabeça e o pescoço para endireitar o esôfago. Direcione a ponta da bola da agulha de alimentação ao longo do céu da boca e para a parte de trás da faringe. Em seguida, passe-o suavemente para o esôfago e injete os 200 microliters de solução.Administre o coquetel antibiótico uma vez por dia durante o experimento. Alternativamente para administrar antibióticos através da água potável, prepare um coquetel de antibióticos como descrito no protocolo técnico. É importante incluir adoçante na mistura de antibióticos, pois este é um fator crucial para evitar a desidratação dos camundongos.Encha o coquetel antibiótico em uma garrafa de água a aproximadamente 100 mililitros por garrafa. Proteja a garrafa da luz e coloque em uma gaiola de rato. Substitua o coquetel antibiótico por estoque fresco duas vezes por semana durante a duração do experimento.O monitoramento cuidadoso do peso dos camundongos e o estado geral de saúde devem ser pré-formados diariamente durante toda a administração de antibióticos. Pesar e rotular dois tubos de autoclave mililitro para coleta de amostras. Para a coleta de amostras de fezes frescas coloque cada rato em um contidor.Em seguida, colete pelotas fecais diretamente do ânus em um tubo de coleta. Após a realização da eutanásia, conforme descrito no protocolo técnico, havia uma carcaça de rato com o abdômen totalmente exposta e pulverizar a área abdominal com 70% de etanol. O uso de fórceps esterilizados e tesouras fazem uma incisão transversal no abdômen para expor o peratenium sem danificar nenhum tecido interno.Levante o peratenium e faça uma incisão para expor os intestinos. Remova os intestinos com as fórceps e a tesoura e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Use cuidadosamente fórceps para provocar o intestino delgado longe das artérias mesentéricas e gordura.Estenda o intestino e coloque-o em uma limpeza de laboratório limpa. Com uma medida de régua e corte quatro centímetros do íleo distal do intestino delgado. Corte e descarte o centímetro do intestino proximal ao ceco.Restará uma porção de três centímetros de íleo que será usada para coletar bactérias intestinais. Segure a porção de ímuo sobre um tubo estéril de dois mililitros. Colete o conteúdo intestinal extrudando diretamente o intestino e coletando a amostra no tubo.Esta amostra terá bactérias do conteúdo de íleo. Prepare uma seringa de 20 mililitros com soro fisátil tamponado de fosfato frio e lave a porção de íleo descartando o fluxo. Coloque a porção de ímuto em uma placa de Petri estéril e abra-a longitudinalmente com uma tesoura.Raspe o interior da parede do íleo com um bisturi. Colete qualquer bactéria no bisturi lavando-a com um mililitro de PBS sobre um tubo de centrífuga limpo. Gire a oito mil vezes G por cinco minutos para pelotar as bactérias.Após a centrifugação descartar o supernante. Esta amostra conterá bactérias da parede do íleo. Pese os tubos contendo as amostras de fezes e íleo.Subtraia o peso dos tubos vazios para obter o peso fecal em cada amostra. Extrair DNA bacteriano de fezes, conteúdo de íleo e amostras de parede de íleo usando kits disponíveis comercialmente. Armazene as amostras de DNA a menos 20 graus Celsius até usar.Descongele o padrão qPCR, DNA de amostra fecal e reagentes qPCR de um kit comercialmente disponível no gelo. Diluir o padrão em água livre de DNA estéril em uma faixa de 10 a 7 a 10 até as duas cópias por microliter. Diluir o DNA da amostra fecal para metade, um quinto e um décimo de concentrações.Em seguida, faça uma reação de mixagem mestre para o número total das reações mais uma. Misture 30 microliters da mistura mestre e 5 microliters do modelo, que é o padrão, amostra ou água para o controle negativo. Em seguida, adicione 10 microliters deste mix a cada poço em uma placa qPCR 384 bem óptica.Realize cada reação em triplicado. Sele brevemente a placa qPCR e centrífuga. Em seguida, carregue a placa na máquina qPCR que está programada como listada no protocolo técnico.Finalmente obtenha os valores do limiar de ciclo para o padrão e amostras antes de calcular os números de cópia 16S rDNA para amostras fecais. Os resultados representativos mostram perda de peso em camundongos após a administração de antibióticos por gavage oral ou através da água potável. Nenhuma perda de peso perceptível é detectada em camundongos que recebem antibióticos por gavage oral.Quando os camundongos são tratados com antibióticos na água potável, eles perdem cerca de 10% de seu peso corporal nos primeiros dias de tratamento, mas recuperam o ganho normal de peso posteriormente. A quantificação de bactérias em amostras fecais requer o uso de uma curva padrão obtida pelo plotagem do logaritmo do número da cópia para o padrão versus os valores C-T obtidos no qPCR. Dentro da faixa linear, a equação de análise de regressão permite quantificação da abundância de rDNA 16S dentro das amostras fecais.Como mostrado aqui para fezes, conteúdo de intestino delgado e amostras de parede de intestino delgado. Após cinco ou dez dias de administração de antibióticos orais, há uma forte diminuição na densidade de bactérias em amostras de fezes de camundongos tratados com antibióticos. No entanto, a densidade de bactérias nas fezes se recuperou para níveis normais uma semana após a administração de antibióticos ser interrompida.Tanto o gavage oral quanto a administração de antibióticos na água potável diminuem brevemente a carga bacteriana fecal em camundongos tratados. Pesquisadores que selecionam o método individual que melhor se encaixa nos requisitos experimentais considerando fatores como a duração do tratamento. O método qPCR para quantificação de bactérias pode ser modificado para quantificar a taxa bacteriana individual usando primers específicos.Isso fornecerá informações quantitativas e qualitivas sobre o tamanho e a composição do microbioma.

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Aprenda a quantificar mudanças na microbiota intestinal de camundongos após tratamento antibiótico oral usando qPCR. Este método minimiza a perda de peso e permite análises precisas da composição bacteriana.

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral (Vídeo) | JoVE Journal

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