Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral
November 17th, 2018
Aqui nós fornecemos protocolos detalhados para a administração oral de antibióticos para ratos, coleta de amostras fecais, extração de DNA e quantificação de bactérias fecais por qPCR.
Este protocolo fornece um método confiável para quantificar as alterações é a microbiota intestinal de camundongos após a administração de antibióticos orais. Isso pode ajudar a pesquisar sobre interações de microbiota cruzada fornecendo insights sobre as patologias associadas à disbiose microbiana, como a doença inflamatória intestinal. A principal vantagem desses regimes de tratamento de antibióticos é que eles previnem a perda de peso característica normalmente associada à administração de antibióticos orais aos camundongos.
Para pré-formar o tratamento com antibióticos através de gavage oral prepare um coquetel de antibióticos misturando soluções de estoque que foram preparadas como descrito no protocolo técnico. Para um volume de mililitros misturam 50 microliters de ampicilina, 50 microliters de gentamicina, 50 microliters de neomicina, 500 microliters de metronidazole, 25 microliters de vancomicina e 325 microliters de água. Carregue a mistura de antibióticos em uma seringa de um mililitro, eliminando quaisquer bolhas e conecte uma agulha de gavage de gálada apropriada.
Pegue a pele sobre o ombro do rato firmemente e estique a cabeça e o pescoço para endireitar o esôfago. Direcione a ponta da bola da agulha de alimentação ao longo do céu da boca e para a parte de trás da faringe. Em seguida, passe-o suavemente para o esôfago e injete os 200 microliters de solução.
Administre o coquetel antibiótico uma vez por dia durante o experimento. Alternativamente para administrar antibióticos através da água potável, prepare um coquetel de antibióticos como descrito no protocolo técnico. É importante incluir adoçante na mistura de antibióticos, pois este é um fator crucial para evitar a desidratação dos camundongos.
Encha o coquetel antibiótico em uma garrafa de água a aproximadamente 100 mililitros por garrafa. Proteja a garrafa da luz e coloque em uma gaiola de rato. Substitua o coquetel antibiótico por estoque fresco duas vezes por semana durante a duração do experimento.
O monitoramento cuidadoso do peso dos camundongos e o estado geral de saúde devem ser pré-formados diariamente durante toda a administração de antibióticos. Pesar e rotular dois tubos de autoclave mililitro para coleta de amostras. Para a coleta de amostras de fezes frescas coloque cada rato em um contidor.
Em seguida, colete pelotas fecais diretamente do ânus em um tubo de coleta. Após a realização da eutanásia, conforme descrito no protocolo técnico, havia uma carcaça de rato com o abdômen totalmente exposta e pulverizar a área abdominal com 70% de etanol. O uso de fórceps esterilizados e tesouras fazem uma incisão transversal no abdômen para expor o peratenium sem danificar nenhum tecido interno.
Levante o peratenium e faça uma incisão para expor os intestinos. Remova os intestinos com as fórceps e a tesoura e coloque-o em uma placa de Petri estéril. Use cuidadosamente fórceps para provocar o intestino delgado longe das artérias mesentéricas e gordura.
Estenda o intestino e coloque-o em uma limpeza de laboratório limpa. Com uma medida de régua e corte quatro centímetros do íleo distal do intestino delgado. Corte e descarte o centímetro do intestino proximal ao ceco.
Restará uma porção de três centímetros de íleo que será usada para coletar bactérias intestinais. Segure a porção de ímuo sobre um tubo estéril de dois mililitros. Colete o conteúdo intestinal extrudando diretamente o intestino e coletando a amostra no tubo.
Esta amostra terá bactérias do conteúdo de íleo. Prepare uma seringa de 20 mililitros com soro fisátil tamponado de fosfato frio e lave a porção de íleo descartando o fluxo. Coloque a porção de ímuto em uma placa de Petri estéril e abra-a longitudinalmente com uma tesoura.
Raspe o interior da parede do íleo com um bisturi. Colete qualquer bactéria no bisturi lavando-a com um mililitro de PBS sobre um tubo de centrífuga limpo. Gire a oito mil vezes G por cinco minutos para pelotar as bactérias.
Após a centrifugação descartar o supernante. Esta amostra conterá bactérias da parede do íleo. Pese os tubos contendo as amostras de fezes e íleo.
Subtraia o peso dos tubos vazios para obter o peso fecal em cada amostra. Extrair DNA bacteriano de fezes, conteúdo de íleo e amostras de parede de íleo usando kits disponíveis comercialmente. Armazene as amostras de DNA a menos 20 graus Celsius até usar.
Descongele o padrão qPCR, DNA de amostra fecal e reagentes qPCR de um kit comercialmente disponível no gelo. Diluir o padrão em água livre de DNA estéril em uma faixa de 10 a 7 a 10 até as duas cópias por microliter. Diluir o DNA da amostra fecal para metade, um quinto e um décimo de concentrações.
Em seguida, faça uma reação de mixagem mestre para o número total das reações mais uma. Misture 30 microliters da mistura mestre e 5 microliters do modelo, que é o padrão, amostra ou água para o controle negativo. Em seguida, adicione 10 microliters deste mix a cada poço em uma placa qPCR 384 bem óptica.
Realize cada reação em triplicado. Sele brevemente a placa qPCR e centrífuga. Em seguida, carregue a placa na máquina qPCR que está programada como listada no protocolo técnico.
Finalmente obtenha os valores do limiar de ciclo para o padrão e amostras antes de calcular os números de cópia 16S rDNA para amostras fecais. Os resultados representativos mostram perda de peso em camundongos após a administração de antibióticos por gavage oral ou através da água potável. Nenhuma perda de peso perceptível é detectada em camundongos que recebem antibióticos por gavage oral.
Quando os camundongos são tratados com antibióticos na água potável, eles perdem cerca de 10% de seu peso corporal nos primeiros dias de tratamento, mas recuperam o ganho normal de peso posteriormente. A quantificação de bactérias em amostras fecais requer o uso de uma curva padrão obtida pelo plotagem do logaritmo do número da cópia para o padrão versus os valores C-T obtidos no qPCR. Dentro da faixa linear, a equação de análise de regressão permite quantificação da abundância de rDNA 16S dentro das amostras fecais.
Como mostrado aqui para fezes, conteúdo de intestino delgado e amostras de parede de intestino delgado. Após cinco ou dez dias de administração de antibióticos orais, há uma forte diminuição na densidade de bactérias em amostras de fezes de camundongos tratados com antibióticos. No entanto, a densidade de bactérias nas fezes se recuperou para níveis normais uma semana após a administração de antibióticos ser interrompida.
Tanto o gavage oral quanto a administração de antibióticos na água potável diminuem brevemente a carga bacteriana fecal em camundongos tratados. Pesquisadores que selecionam o método individual que melhor se encaixa nos requisitos experimentais considerando fatores como a duração do tratamento. O método qPCR para quantificação de bactérias pode ser modificado para quantificar a taxa bacteriana individual usando primers específicos.
Isso fornecerá informações quantitativas e qualitivas sobre o tamanho e a composição do microbioma.
Visão Geral
Este protocolo fornece um método confiável para quantificar mudanças na microbiota intestinal de camundongos após a administração oral de antibióticos. Auxilia na pesquisa sobre interações da microbiota e patologias associadas à disbiose microbiana.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Neurociência
- Farmacologia
Fundamentos
- Entender o impacto dos antibióticos na microbiota intestinal é crucial para estudar doenças relacionadas.
- O tratamento com antibióticos pode levar à disbiose microbiana, afetando a saúde geral.
- Perda de peso é um efeito colateral comum da administração de antibióticos em camundongos.
- Protocolos para administração e monitoramento eficazes são essenciais para resultados precisos.
Objetivo do Estudo
- Estabelecer um método para administrar antibióticos a camundongos sem perda significativa de peso.
- Coletar e analisar amostras fecais para quantificação de DNA bacteriano.
- Investigar os efeitos dos antibióticos na composição da microbiota intestinal.
Métodos Utilizados
- Preparação de coquetéis de antibióticos para administração oral ou em água de beber.
- Coleta de amostras fecais e conteúdo intestinal após a eutanásia.
- Extração de DNA das amostras usando kits comerciais.
- Quantificação de bactérias por meio de análise qPCR.
Principais Resultados
- Camundongos que receberam antibióticos via administração oral mostraram nenhuma perda significativa de peso.
- Antibióticos na água de beber resultaram em perda inicial de peso, mas a recuperação foi observada.
- A quantificação do DNA bacteriano revelou mudanças significativas na composição da microbiota.
- Curvas padrão foram estabelecidas para medição precisa da abundância de 16S rDNA.
Conclusões
- O protocolo minimiza efetivamente a perda de peso durante o tratamento com antibióticos em camundongos.
- Fornece um método confiável para estudar os efeitos dos antibióticos na microbiota intestinal.
- Os resultados contribuem para a compreensão da disbiose microbiana e suas implicações para a saúde.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables reliable quantification of murine intestinal microbiota changes following oral antibiotic treatment, supporting preclinical studies of microbial dysbiosis linked to immunopathologies. By minimizing weight loss artifacts, it improves data interpretability for target validation in inflammation and immune-mediated disease models. The qPCR-based bacterial density assay provides quantitative, reproducible outputs essential for mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbiota-immune crosstalk hypotheses in inflammatory bowel disease and arthritis models.
- Operational Value: Provides weight-stable antibiotic regimens that reduce confounding variables in target phenotype assessment.
- Predictive Value: Supports functional target validation by correlating microbial density shifts with immune cell functional readouts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers standardized fecal sample preparation and DNA extraction compatible with high-throughput qPCR platforms.
- Quantitative Output: Generates 16S rDNA copy number measurements via standard curves, enabling lot-to-lot consistency in microbiome modulation studies.
- Scalability: Supports longitudinal sampling designs for dose-response and time-course screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models antibiotic-induced dysbiosis observed in human patients, enhancing translational validity of preclinical findings.
- Mechanistic De-risking: Links microbial community changes to immune cell function, reducing ambiguity in pathway-target relationships.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal tracking of microbiota recovery post-treatment, informing safety and resistance risk assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing microbiota modulation as a mechanistic variable in immunology and infectious disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of microbiota-dependent phenotypes in disease models via controlled antibiotic perturbation.
- Screening: Enables assay-ready microbiome samples for evaluating compound effects on bacterial load and composition.
- Analytics: Delivers quantitative 16S rDNA abundance data that allows cross-condition comparison and effect size calculation.
- Translational Research: Connects murine microbiota changes to human-relevant dysbiosis patterns, supporting biomarker-aligned study designs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microbiota quantification capability applicable across multiple therapeutic areas and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing weight-loss confounders in microbiota-immune studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized antibiotic cocktails and qPCR validation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing mechanistic links between microbial shifts and immune outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on microbiota-dependent disease relevance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine handling, oral gavage technique, and anaerobic sample processing.
- Depends on qPCR instrumentation, standard curve generation, and DNA extraction kit compatibility.
- Necessitates cross-team standardization for sample collection timing, storage, and normalization procedures.
- Involves adaptation considerations when extending to different mouse strains, antibiotic combinations, or intestinal segments.
- Includes practical limitations such as the need for euthanasia to access intestinal tissue and potential variability in fecal pellet yield.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Administration of Antibiotics
2:29
Collection of Fecal Samples from Stool, Ileum Content and Ileum Wall
5:16
Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR
6:33
Results: Quantification of Intestinal Microbiota by qPCR after Oral Antibiotic Treatment
7:51
Conclusion
