Novos métodos para a Administração Intranasal sob anestesia por inalação para avaliar a entrega da droga de nariz-de-Brain
14 de novembro de 2018
Aqui, descrevemos dois métodos novos da administração intranasal estável sob anestesia por inalação com o mínimo de estresse físico para animais experimentais. Podemos também descrever um método de avaliação quantitativa dos níveis de distribuição de drogas no cérebro através da via de nariz-de-cérebro usando radiolabeled [14C]-inulina como um substrato de modelo de macromoléculas solúveis em água.
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das ciências farmacêuticas sobre administração intranasal e farmacocinética e farmacologia de medicamentos de interesse. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para a avaliação quantitativa de candidatos a medicamentos de entrega do nariz para o cérebro e anestesia de inalação com estresse mínimo para os animais. As implicações dessa técnica se estendem para a terapia de doenças do sistema nervoso central, pois contribui para o desenvolvimento de tecnologias de entrega de medicamentos através da rota nariz-cérebro.
Demonstrando o procedimento será Mitsuyoshi Fukuda, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para entrega intranasal via micropipette em uma instalação isolada de isótopo de rádio. Fita e anesthetize o rato em uma tábua de cortiça na posição supina, e administrar 25 microliters de solução de inulina de carbono-14 em uma a duas doses de microliter, alternativamente, nas narinas direita e esquerda do animal.
Para a entrega reversa de cannulação do lado das vias aéreas através do esôfago, coloque o rato anestesiado sob um microscópio dissecando e faça uma incisão de pele de 1,5 centímetro sobre a garganta. Use fórceps para expandir a incisão até que a traqueia seja exposta, e faça uma incisão de um milímetro na traqueia exposta. Insira uma cânula de 1,2 centímetros na posição pré-marcada na incisão e conecte a extremidade oposta da cânula ao interior de uma máscara de inalação.
Depois disso, use fórceps para expor o esôfago sob a traqueia. Use uma tesoura para fazer uma incisão de um milímetro no esôfago e inserir uma segunda cânula de 1,4 centímetros na posição pré-marcada em direção à extremidade posterior da cavidade nasal. É importante inserir cânula a um comprimento adequado de acordo com o peso do animal experimental e ajustar o comprimento da cânula em outras.
Liga a cânula esofágica e conecte uma agulha de calibre 27 a uma seringa de um mililitro cheia de uma solução de administração conectada a uma bomba de microsiringe programável. Em seguida, entregue 25 microliters de inulina de carbono-14 a uma taxa constante de cinco microliteres por minuto até que todo o volume de solução tenha sido administrado. Uma taxa de difusão lenta, mas constante, é importante para a retenção do máximo de solução medicamentosa possível dentro da cavidade nasal.
Para quantificar a quantidade de inulina de carbono-14 que cruzou a barreira hemencefálica 30 minutos após a administração da inulina, use uma tesoura para abrir cuidadosamente o crânio de cada animal tratado experimentalmente do lado da medula oblongata, e use uma microspatula para colher cuidadosamente os cérebros. Coloque cada cérebro em um pedaço de papel filtro umedecido em uma placa de Petri no gelo enquanto é colhida. E use um cotonete encharcado de soro fisiológico para limpar qualquer sangue da superfície de cada cérebro.
Em seguida, rapidamente, mas com cuidado, dissecar os cérebros em bulbo olfativo, cerebrum e medulla oblongata, além de seções de pons. E coloque as amostras cerebrais em solubilizador de tecido por uma hora a 50 graus Celsius, seguido pela adição de 10 microliters de coquetel de cintilação líquida. Para determinar a radioatividade da solução aplicada, transfira uma alíquota de 25 microliter da solução de administração, dissolvida no coquetel de cintilação, para um frasco de cintilação, e meça as desintegrações por minuto da radioatividade de carbono-14 dentro da amostra cerebral e a solução aplicada em um balcão de cintilação líquida.
Sob anestesia por inalação, nenhuma variação inter-individual experimental é observada entre animais entregues intranasally. Quando o método de administração da cavidade nasal de cânula nângeal reverso esofágico é usado, níveis significativamente mais elevados de inulina de carbono-14 são observados na lâmpada olfativa, cerebrum e medulla oblongata, do que através da entrega de micropipette. Além disso, a inulina de carbono mais alto é detectada na lâmpada olfativa e na medula oblongata, ambas proeminentemente evoluídas na via nariz-cérebro, do que no cerebrum.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da entrega nariz-cérebro explorarem a bioatividade de agentes terapêuticos de grandes moléculas no sistema nervoso central.
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Visão Geral
Este artigo apresenta dois novos métodos para administração intranasal estável sob anestesia inalatória, projetados para minimizar o estresse físico em animais experimentais. Além disso, descreve um método de avaliação quantitativa da distribuição de fármacos no cérebro por meio da via nariz-cérebro utilizando inulina radiomarcada com [14C].
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Ciências farmacêuticas
- Sistemas de liberação de fármacos
- Neurociência
Contexto
- A administração intranasal é uma via promissora para a entrega de fármacos ao sistema nervoso central.
- Minimizar o estresse durante os experimentos é essencial para práticas de pesquisa éticas.
- A avaliação quantitativa da distribuição de fármacos pode aprimorar a compreensão da farmacocinética.
- Compostos radiomarcados podem servir como modelos eficazes para o estudo dos mecanismos de entrega de fármacos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver métodos para administração intranasal estável de fármacos.
- Avaliar a eficácia da entrega de fármacos por meio da via nariz-cérebro.
- Minimizar o estresse físico em animais experimentais durante os procedimentos.
Métodos Utilizados
- Administração de solução de inulina marcada com carbono-14 por meio de micropipeta.
- Uso de anestesia por inalação para reduzir o estresse em camundongos.
- Posicionamento dos camundongos em posição supina sobre uma placa de cortiça para estabilidade.
- Administração alternada de doses do fármaco nas narinas direita e esquerda.
Resultados Principais
- Administração bem-sucedida de fármacos com estresse mínimo aos animais.
- Avaliação quantitativa dos níveis de distribuição do fármaco alcançados.
- Demonstração da eficácia do método de entrega da narina ao cérebro.
- Implicações potenciais para o tratamento de doenças do sistema nervoso central.
Conclusões
- Os métodos desenvolvidos fornecem uma abordagem confiável para a administração intranasal de fármacos.
- Essas técnicas podem avançar a pesquisa em farmacologia e sistemas de liberação de medicamentos.
- Estudos futuros podem explorar aplicações mais amplas nas terapias do sistema nervoso central.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O estabelecimento de modelos confiáveis de entrega do nariz ao cérebro é essencial para reduzir os riscos de terapêuticas direcionadas ao SNC, contornando a barreira hematoencefálica. A avaliação quantitativa do transporte de macromoléculas em condições controladas permite previsibilidade confiável na avaliação de candidatos prioritários. Esses métodos apoiam decisões iniciais de descoberta ao fornecer dados farmacocinéticos reprodutíveis a partir de modelos animais submetidos a estresse mínimo.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar hipóteses de transporte pela via nariz-cérebro para terapêuticos macromoleculares mediante quantificação de traçadores radiomarcados.
- Valor Operacional: Oferece administração padronizada sob anestesia inalatória, reduzindo a variabilidade e melhorando a reprodutibilidade entre estudos.
- Valor Preditivo: Gera dados quantitativos de distribuição no bulbo olfatório, cérebro e medula oblonga, auxiliando na validação do engajamento do alvo e das vias de transporte.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Valor Científico: Fornece doses intranasais consistentes por meio de bomba de seringa ou micropipeta para garantir exposição reprodutível ao composto em campanhas de triagem.
- Valor Operacional: Apoia a padronização de ensaios por meio de taxas controladas de administração e dissecação anatômica de regiões cerebrais para leituras precisas.
- Valor de Escalabilidade: Facilita a reutilização da plataforma em diferentes candidatos a fármacos mediante ajuste do comprimento da cânula e dos parâmetros de infusão conforme o peso do animal e a anatomia nasal.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Permite a avaliação da eficiência da entrega de moléculas grandes do nariz ao cérebro, orientando o alinhamento de biomarcadores translacionais com a exposição ao SNC.
- Valor Operacional: Minimiza os efeitos da depuração mucociliar por meio da cânula reversa, aumentando a retenção do fármaco e melhorando a detecção do sinal no tecido cerebral.
- Mitigação de Riscos: Reduz resultados falso-negativos em modelos pré-clínicos ao aprimorar a confiabilidade da entrega e a sensibilidade quantitativa.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na sequência de descobertas que vai da validação do alvo à identificação de compostos iniciais e à avaliação pré-clínica, fornecendo dados quantitativos sobre a entrega do fármaco do nariz ao cérebro que orientam decisões de prosseguir ou interromper o desenvolvimento.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos de transporte nasal e a elucidação de vias por meio da medição de radioatividade em regiões específicas.
- Triagem: Permite a preparação do ensaio por meio de administração padronizada e de baixo estresse, com detecção quantitativa da distribuição do traçador.
- Análises: Gera leituras de desintegrações por minuto (DPM) a partir da contagem por cintilação líquida para comparar regiões cerebrais e métodos de administração.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta à continuidade pré-clínica ao quantificar o transporte de macromoléculas relevante ao direcionamento de fármacos para o sistema nervoso central.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para avaliar diversos candidatos a fármacos por meio de entrega adaptável baseada em cânula sob anestesia inalatória.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na entrega de substâncias do nariz ao cérebro ao quantificar o acúmulo do traçador em regiões cerebrais-chave envolvidas na via.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e padronização por meio de protocolos de anestesia, posicionamento e controle da taxa de infusão.
- Valor Estratégico: Aprimora a tomada de decisões de avançar ou interromper o desenvolvimento ao reduzir a ambiguidade mecanicista no potencial de entrega ao sistema nervoso central.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em dados quantitativos de exposição cerebral.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cirurgia de roedores, manejo de anestesia e manipulação de traçadores radioativos.
- Depende do acesso a microscópios de dissecação, bombas de microsiringa, contadores de cintilação e instalações com radioisótopos.
- Necessita padronização entre equipes quanto à profundidade de inserção da cânula, tamanho da incisão e protocolos de dissecação cerebral.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes pesos animais e dimensões da cavidade nasal ao definir o comprimento da cânula.
- As limitações práticas incluem a invasividade cirúrgica da cânula reversa e a necessidade de treinamento especializado para manter a consistência.
