Visualização em tempo real e análise do condrócito prejuízo devido ao carregamento mecânico em explantes de cartilagem murino totalmente intacta

Este método permite a investigação dos efeitos de diferentes regimes mecânicos de carga, condições ambientais ou estágios de degeneração da cartilagem sobre a vulnerabilidade dos condrócitos in situ articular. As forças físicas. Ao contrário de outras técnicas, essas medidas são realizadas em tempo real e em cartilagem totalmente intacta sem comprometer as condições de fronteira nativa.

Outra vantagem dessa técnica é que ele usa um modelo de mouse, permitindo testes de como genes específicos afetam a suscetibilidade de condrócitos in situ em lesões mecânicas. Para dissecção do fêmur distal, coloque o rato na posição supina e faça uma incisão de pele de cinco milímetros na porção anterior do joelho. Estenda a incisão todo o caminho ao redor do joelho.

E puxe a pele para expor a articulação do joelho e os músculos das pernas. A partir da extremidade proximal do fêmur, use uma lâmina de bisturi número onze para cortar ao longo do osso na direção distal. Posicionando a lâmina entre a unidade do tendão muscular do quadríceps e o lado anterior do eixo femoral.

Estenda a incisão além da patela. Cortando o meio do tendão patelar para remover a unidade do tendão muscular do quadríceps. Em seguida, a partir da extremidade proximal do fêmur, posicione a lâmina do bisturi entre a unidade do tendão do músculo do tendão do tendão e o lado posterior do eixo femoral e corte ao longo do osso na direção distal.

Quando a incisão se aproximar da articulação do joelho, corte o tecido mole e finalize o corte após a articulação do joelho. Puxe os músculos quadríceps e isquiotibiais para expor o fêmur. E cortar qualquer excesso de músculo nos lados laterais e medial do osso.

Corte o músculo da panturrilha no lado posterior da tíbia proximal. E vire a perna para visualizar o lado posterior do fêmur. Remova o excesso de tecido ao redor da articulação do joelho para expor os condículos distais do fêmur e a superfície posterior da tíbia proximal.

Corte os ligamentos cruzados anterior e posterior dos condyles femorais. E puxe a tíbia para longe do fêmur, cortando todos os ligamentos para separar a perna inferior do fêmur. Utilizando uma tesoura de dissecção padrão, corte o fêmur na extremidade proximal do osso cerca de oito milímetros acima da articulação tibiofemoral do lado lateral.

E use fórceps de joalheiro para remover os tecidos moles circundantes do fêmur. Em seguida, exponha a cartilagem em ambos os condyles na extremidade distal do fêmur. Hidrate periodicamente a superfície articular com HBSS.

Para dissecção do úmero, coloque o mouse na posição supina. E use micro tesoura para fazer uma incisão de cinco milímetros no lado posterior do cotovelo. Estendendo a incisão ao redor do cotovelo e puxando para trás a pele para expor os músculos no braço e ombro.

A partir da extremidade proximal do úmero, posicione a lâmina de um bisturi número onze entre a unidade do tendão muscular tríceps e o lado posterior do úmero. E corte ao longo do osso na direção distal. Estenda a incisão em direção à extremidade distal do úmero, através do tendão tríceps e puxe os tríceps para a extremidade proximal do úmero até que a cabeça úmera seja exposta.

Corte o tecido conjuntivo ao redor da cabeça úmerca sem tocar na superfície articular. E remova o membro do corpo. Hidrate a superfície articular da cabeça úmerca com HBSS.

Para desconectar o úmero do braço, use fórceps para quebrar a extremidade proximal da ulna no lado posterior do braço. E corte o tecido conjuntivo ao redor da extremidade distal do úmero, removendo qualquer excesso de tecido no osso. Em seguida, use uma tesoura de dissecação padrão para remover a tuberosidade deltoide no lado posterior do úmero.

E coloque a amostra dissecada em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo HBSS. Para a coloração de Calcein AM das amostras, transfira os ossos para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitres de 10,05 micro molar Calcein no HBSS. E coloque o tubo em uma batedeira termo a 37 graus Celsius a 800 rpm, protegido da luz.

Depois de trinta minutos, lave o espécime em HBSS fresco por dez minutos. E transfira a amostra para o slide de vidro de um microscópio personalizado montado dispositivo de teste mecânico, de tal forma que a superfície articular dos condyles femorais posteriores ou a cabeça úmeral está sentada no vidro. Hidrate a amostra com HBSS e coloque o dispositivo com a amostra em um estágio de microscópio de fluorescência.

Imagem os condrocitos articular manchados com Calcein AM antes da aplicação de carga sob uma ampliação de 4x. Ajuste as configurações de aquisição para otimizar a qualidade da imagem. Para aplicar o carregamento mecânico estático, segure uma carga estática prescrita em cima da amostra de forma que a cartilagem articular seja comprimida contra o vidro de cobertura por cinco minutos antes de remover a carga.

Para aplicar uma carga mecânica de impacto, solte um impacto cilíndrico de peso conhecido na amostra a partir de uma altura prescrita, liberando a carga cinco segundos após o impacto. Imediatamente após a retirada de qualquer carga, incubar a amostra em 60 micro iodeto de propídio molar recém-preparado em um mililitro de HBSS. Durante cinco minutos à temperatura ambiente, depois reimagem os condrócitos articular por microscopia de fluorescência como apenas demonstrado.

Para quantificar a área de células feridas e mortas devido ao regime de carga mecânica aplicado, primeiro abra os micrografos da superfície articular adquiridos antes e depois da aplicação da carga mecânica no ImageJ. Combine as imagens em uma pilha. Defina a escala das imagens com base na resolução da imagem.

Em seguida, defina a área onde as células se tornaram Calcein negativa e PI positiva. Essas células são consideradas feridas ou mortas. Em seguida, determine a área de células mortas feridas usando a ferramenta de medição.

Pelo menos seis testes aplicaram os protocolos de carregamento reproduivelmente induzidos áreas localizadas de lesão celular em cartilagens femorais e úmerais obtidas de camundongos de oito a dez semanas de idade. Em todos os protocolos de carregamento testados, maiores magnitudes de carga e intensidades de impacto mais elevadas exacerbaram significativamente a extensão espacial da lesão celular nos fêmures e nos úmeros. Ao realizar as dissecções é importante lembrar-se de não entrar em contato com a cartilagem articular com as ferramentas cirúrgicas, pois isso pode comprometer a linha de base pela capacidade dos espécimes.

O uso desse modelo de espelhamento pode facilitar a pesquisa em osteoartrite, já que a doença é facilmente induzida em camundongos através de manipulações genéticas, dietéticas ou cirúrgicas. Nossa plataforma também fornece uma ferramenta para interrogar questões científicas básicas e para triagem de intervenções terapêuticas visando a vulnerabilidade mecânica dos condrócitos.