Name: Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 48 s
Description: Aprenda a avaliar a integridade da barreira hemato-testicular em camundongos C57Black/6 usando injeção de inulina-FITC in vivo. Este método permite estudar os efeitos de toxinas ambientais e fatores genéticos na fertilidade masculina.

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Este trabalho foi apoiado pela nacional chave R & D programa de China (2016YFA0500902), Nacional Natural Science Foundation da China (31471228, 31771653), a Fundação de ciência de Jiangsu para ilustres jovens estudiosos (BK20150047), a ciência Natural Fundação da província de Jiangsu (BK20140897, 14KJA180005) e o programa inovadora e empreendedorismo da província de Jiangsu para K.Z.

Todas as experiências em animais realizadas foram aprovadas pelo Comitê de Nanjing Medical University. Camundongos C57BL/6 machos foram mantidos em condições de fotoperíodo controlados e foram fornecidos com comida e água.
1. preparações
<ol><li>
Capilares de microinjeção
	<ol>
<li>Use os capilares microinjeção com um diâmetro exterior e interior Dímetro comprimento de 1,0 mm, 0.8 mm e 10,0 cm, respectivamente.</li>
		<li>Puxe os capilares de vidro com um puxador capilar (figura 1A). Testar e ajustar as configurações, dependendo da máquina de extrator capilar que está sendo usado.</li>
		<li>Quebre as pontas de pipeta com fórceps usar para obter os capilares de um diâmetro de 50 µm na ponta. Nota: As dicas podem ser muito longas para penetrar o testículo.</li>
		<li>Afie a ponta em um ângulo de 30° usando um chanfrador micropipeta (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagentes
	<ol>
<li>Prepare-se 1% de pentobarbital de sódio: dissolver pentobarbital de sódio 100 mg em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS) (etapa 2.3.3).</li>
		<li>Prepare-se 10 mg/mL inulina-FITC: dissolver inulina-FITC 1 mg em 100 µ l de PBS (etapa 2.1.6).</li>
		<li>Preparar o paraformaldeído 4%: dissolver paraformaldeído (PFA) 4 g em 100 mL de PBS (etapa 2.3.3).</li>
		<li>Prepare-se 30% de sacarose: dissolver 3 g em 10 mL de PBS (etapa 2.3.4) de sacarose.</li>
		<li>Prepare-se cloreto de cádmio de 0,1%: dissolver cloreto de cádmio 10 mg em 10 mL de PBS (etapa 2.1.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. métodos
<ol><li>
Preparação de anestesia e cirurgia
	<ol>
<li>Pesar de ratos masculinos de C57BL/6 de 8 semanas de idade e calcular a dose necessária de CdCl2. Tratar um grupo de ratos (n = 3) com CdCl2 (5 mg/kg de peso corporal, i.p.) para 3 d antes da cirurgia. Tratar de um outro grupo de camundongos machos de C57BL/6 de 8 semanas de idade (n = 3) com PBS como controle.</li>
		<li>Realizar a cirurgia sob condições assépticas usando seringa estéril, agulha, tesoura e pinça.</li>
		<li>Prepare a solução de trabalho de anestesia na hora. A dose necessária de anestesia é 70 mg de pentobarbital de sódio/kg de peso corporal. Em média, um rato adulto de C57BL/6 às 8 semanas de idade pesa ~ 25g, que corresponde a 175 μL de 1% pentobarbital de sódio (1,75 mg / rato). Nota: O pentobarbital de sódio é dissolvido em salina tampão fosfato (PBS). A solução é filtrada por 0.22 hum unidade de filtro antes de serem utilizados.</li>
		<li>Limpar a área para cirurgia com 75% de etanol e cobrir a área com uma toalha de tecido limpo.</li>
		<li>Ligar o aquecedor termostático e ajustar a temperatura a 37 ° C.</li>
		<li>Prepare a solução de trabalho de inulina-FITC (10 mg/mL) no dia da cirurgia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedimento cirúrgico
	<ol>
<li>Pesar de ratos masculinos de C57BL/6 de 8 semanas de idade e calcular a dose necessária de anestesia.</li>
		<li>Realize uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio utilizando a seringa de 1 mL estéril. Manter o mouse em uma gaiola limpa.</li>
		<li>Observe a resposta reflexa de olho e o padrão de respiração do rato para confirmar que é sob anestesia completa. Nota: Geralmente, 10-15 min são necessários até que o mouse é profundamente anestesiado, com manutenção de respiração lenta, constante e uma total falta de resposta de pitada de dedo do pé.</li>
		<li>Mova o mouse para a área de operação e cobrir a área dos olhos com um papel absorvente úmido para evitar o ressecamento durante a anestesia (Figura 2A).</li>
		<li>Raspar seu cabelo abdominal com uma máquina de barbear e desinfetar a área de cirurgia com 75% de etanol.</li>
		<li>Com uma tesoura afiada, faça uma incisão de 1 cm de pele acima as glândulas prepuciais para expor a parede abdominal. Levante a parede abdominal com pequenas pinças e faça uma incisão de 0,5 cm para expor a cavidade peritoneal (Figura 2B).</li>
		<li>Utilize pinças para pesquisar por almofadas de gordura ao redor do epidídimo e testículo. Puxe cuidadosamente as almofadas de gordura para expor o testículo anexado claramente (Figura 2 e 2D). Normalmente, operam em um testículo de cada vez. Nota: Evite tocar as almofadas de gordura e testículos com as mãos.</li>
		<li>Coloque um papel (9 cm de diâmetro), sob as almofadas de gordura e o testículo (Figura 2).</li>
		<li>Injetar uma pipeta de microinjeção de inulina-FITC e conectá-lo à unidade micromanipulador (Figura 1). Suavemente Insira a pipeta de microinjeção sob a túnica albugínea e carregar um total de 20 μL de inulina-FITC para o interstício do testículo (Figura 2E e 2F). Nota: Pressione cuidadosamente a pipeta de microinjeção para evitar movê-lo.</li>
		<li>Monitore a movimentação de inulina-FITC no testículo (Figura 2).</li>
		<li>Imediatamente devolva o testículo na cavidade abdominal após a conclusão da injeção.</li>
		<li>Repita o procedimento no testículo contralateral. Esse testículo é injetado com 20 μL de PBS como um controle.</li>
		<li>Fechar a pele com uma sutura cirúrgica e mover o mouse para uma almofada de calor de um aquecedor termostático (figura 1B). Administre uma dose de 1 mg de analgésico (buprenorfina) por 1 kg de peso corporal, via subcutânea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colhendo os testículos e preparação de seções congeladas
	<ol>
<li>40 min após a injeção, eutanásia o mouse destinatário por deslocamento cervical de acordo com cuidado animal e usar as diretrizes.</li>
		<li>Use um par de tesouras afiadas para coletar os testículos. Coloque os testículos em 1 mL de PBS gelado para remover qualquer contaminação de sangue.</li>
		<li>Corrigir os testículos em paraformaldeído 4% (PFA) a 4 ° C, durante 12-24 h.. descarte o 4% PFA e lave o tecido 3 x com 1,5 mL de PBS 1% à temperatura ambiente.</li>
		<li>Desidrate o tecido em 30% de sacarose durante a noite. Ponha o testículo no quadro de incorporação e cobrir o tecido com a temperatura ideal de corte composto (OCT). Depois a OCT é congelada, preencha o quadro de encastre com OCT, para que o testículo inteiro pode ser coberto com OCT.</li>
		<li>Corte 5 μm de espessura, congeladas seções transversais dos testículos em um criostato a-20 ° C e deixá-los a aderir às corrediças do microscópio. Nota: Recongelar tecidos incorporados em gelo seco pode aumentar a rigidez para o corte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Requisição de imagem
	<ol>
<li>Coloque os slides em uma caixa de umidificado. Aquecer as lâminas à temperatura ambiente por 10 min.</li>
		<li>Lave as seções 3 x com salino Tris (TBS) à temperatura ambiente.</li>
		<li>Secar ao ar por 5 min no escuro. Limpe qualquer TBS residual com papel livre de poeira.</li>
		<li>Cobrir as seções transversais com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Lamela em uma corrediça do microscópio invertida de lugar.</li>
		<li>Adquira imagens usando um microscópio confocal. Um total de ampliação de 20 X é geralmente suficiente para detectar o sinal fluorescente brilhantemente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli-Sertoli+and+Sertoli-germ+cell+interactions+and+their+significance+in+germ+cell+movement+in+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sertoli-Sertoli and Sertoli-germ cell interactions and their significance in germ cell movement in the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Endocrine Reviews. 25 (5), 747-806 (2004).</li>
<li>Wen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+germ+cells+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis-the+involvement+of+both+actin-+and+microtubule-based+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Transport of germ cells across the seminiferous epithelium during spermatogenesis-the involvement of both actin- and microtubule-based cytoskeletons.</a> Tissue Barriers. 4 (4), e1265042(2016).</li>
<li>Wang, C. Q., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+seamless+trespass%3A+germ+cell+migration+across+the+seminiferous+epithelium+during+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A seamless trespass: germ cell migration across the seminiferous epithelium during spermatogenesis.</a> Journal of Cell Biology. 178 (4), 549-556 (2007).</li>
<li>Fijak, M., Meinhardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+testis+in+immune+privilege%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The testis in immune privilege.</a> Immunological Reviews. 213, 66-81 (2006).</li>
<li>O'Bryan, M. K., Hedger, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Networks+in+the+Control+of+Spermatogenesis+Chronic+Inflammation+in+an+Immunologically+Privileged+Tissue%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Mechanisms+In+Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Networks in the Control of Spermatogenesis Chronic Inflammation in an Immunologically Privileged Tissue?</a> Molecular Mechanisms In Spermatogenesis. 636, 92-114 (2008).</li>
<li>Li, N., Wang, T., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+cellular+and+molecular+aspects+of+immune+privilege+in+the+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structural cellular and molecular aspects of immune privilege in the testis.</a> Frontiers in Immunology. 3, 152(2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mammalian+Blood-Testis+Barrier%3A+Its+Biology+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Review%22%5BJournal%5D)">The Mammalian Blood-Testis Barrier: Its Biology and Regulation.</a> Endocrine Review. 36 (5), 564-591 (2015).</li>
<li>Govero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+infection+damages+the+testes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Zika virus infection damages the testes in mice.</a> Nature. 540 (7633), 438-442 (2016).</li>
<li>Jenabian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+tolerance+properties+of+the+testicular+tissue+as+a+viral+sanctuary+site+in+ART-treated+HIV-infected+adults%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Immune tolerance properties of the testicular tissue as a viral sanctuary site in ART-treated HIV-infected adults.</a> AIDS. 30 (18), 2777-2786 (2016).</li>
<li>Holembowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAp73+is+essential+for+germ+cell+adhesion+and+maturation+in+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">TAp73 is essential for germ cell adhesion and maturation in testis.</a> Journal Of Cell Biology. 204 (7), 1173-1190 (2014).</li>
<li>Legendre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+engineered+3D+blood-testis+barrier+model+for+the+assessment+of+reproductive+toxicity+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">An engineered 3D blood-testis barrier model for the assessment of reproductive toxicity potential.</a> Biomaterials. 31 (16), 4492-4505 (2010).</li>
<li>Setchell, B. P., Waites, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+permeability+of+the+testicular+capillaries+and+of+the+%27blood-testis+barrier%27+after+injection+of+cadmium+chloride+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Changes in the permeability of the testicular capillaries and of the 'blood-testis barrier' after injection of cadmium chloride in the rat.</a> Journal of Endocrinology. 47 (1), 81-86 (1970).</li>
<li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+central+role+of+Sertoli+cells+in+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The central role of Sertoli cells in spermatogenesis.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 9 (4), 411-416 (1998).</li>
<li>Cheng, C. Y., Mruk, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-testis+barrier+and+its+implications+for+male+contraception%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The blood-testis barrier and its implications for male contraception.</a> Pharmacological Reviews. 64 (1), 16-64 (2012).</li>
<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+system+to+study+Sertoli+cell+blood-testis+barrier+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An in vitro system to study Sertoli cell blood-testis barrier dynamics.</a> Methods Molecular Biology. 763, 237-252 (2011).</li>
<li>Orth, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+Sertoli+cells+in+fetal+and+postnatal+rats%3A+a+quantitative+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Proliferation of Sertoli cells in fetal and postnatal rats: a quantitative autoradiographic study.</a> Anatomical Record. 203 (4), 485-492 (1982).</li>
<li>Lee, N. P. Y., Mruk, D., Lee, W. M., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+cadherin%2Fcatenin+complex+a+functional+unit+of+cell-cell+actin-based+adherens+junctions+in+the+rat+testis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Is the cadherin/catenin complex a functional unit of cell-cell actin-based adherens junctions in the rat testis?</a> Biology of Reproduction. 68 (2), 489-508 (2003).</li>
<li>Bai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Germline-Specific+Role+for+the+mTORC2+Component+Rictor+in+Maintaining+Spermatogonial+Differentiation+and+Intercellular+Adhesion+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Germline-Specific Role for the mTORC2 Component Rictor in Maintaining Spermatogonial Differentiation and Intercellular Adhesion in Mouse Testis.</a> Molecular Human Reproduction. 24 (5), 244-259 (2018).</li>
<li>Korhonen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DICER+Regulates+the+Formation+and+Maintenance+of+Cell-Cell+Junctions+in+the+Mouse+Seminiferous+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">DICER Regulates the Formation and Maintenance of Cell-Cell Junctions in the Mouse Seminiferous Epithelium.</a> Biology of Reproduction. 93 (6), 139(2015).</li>
<li>Loir, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trout+Sertoli+cells+and+germ+cells+in+primary+culture%3A+I.+Morphological+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gamete+Research%22%5BJournal%5D)">Trout Sertoli cells and germ cells in primary culture: I. Morphological and ultrastructural study.</a> Gamete Research. 24 (2), 151-169 (1989).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Integrity+of+the+Blood-Testis+Barrier+%28BTB%29%3A+An+In+Vivo+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Integrity of the Blood-Testis Barrier (BTB): An In Vivo Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1748, 245-252 (2018).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Espermatogênese ocorre no epitélio seminífero e é um processo altamente ordenado e dinâmico que é regido por células germinativas e células somáticas (por ex., células de Sertoli)13. A estrutura do BTB, que é construída pelas células de Sertoli, divide o epitélio seminífero em um basal e um compartimento apical. O desenvolvimento das células germinativas haploides e meióticas ocorre no compartimento apical que forma uma barreira imunológica14.
<p class...

Espermatogênese de mamíferos é considerado um processo altamente estruturado que engloba espermatogónias auto-renovação e diferenciação através de espermatócitos em espermatozoides haploides através de mitose e meiose acridina, durante o qual dramática ocorrem alterações bioquímicas e morfológicas. Desenvolvimento das células germinativas são progressivamente transportadas da base do túbulo seminífero em direção ao lúmen. Este processo é regulado pelo celular os contactos entre as células germinativas e células de Sertoli1,2. Células de Sertoli adjacentes formam o BTB que situa-se perto da base do túbulo seminífero. O BTB fisicamente divide o epitélio em um basal e um compartimento adluminal. Durante estágios VIII - IX do ciclo do epitélio, preleptotene/leptóteno espermatócitos de compartimentos do basais migram através do BTB, entrando o adluminal compartimentos3. Portanto, a função do BTB é fornecer um microambiente immunoprivileged a conclusão de meiose e acridina4,5,6. Ao contrário de outras sangue-tecido barreiras (por exemplo, barreira hemato - encefálica) que são compostas apenas de junções apertadas (TJs), o BTB é formado por quatro diferentes junções (TJs, especializações ectoplásmicas, junções e intermediário baseado no filamento desmossomas) entre Sertoli células1,7.
Muitos estudos utilizaram-se ratos geneticamente modificados, infecções por vírus e tóxicos ambientais para investigar mecanismos de BTB integridade7,8,9. O rompimento do BTB induz a espermatogênese prejudicada e Subfertilidade ou infertilidade. Desde a formação do BTB e integridade foram confirmados para ser afetado pelos contatos entre as células de Sertoli8, um modelo in vitro com base em cultura primária de células de Sertoli isoladas tem sido utilizado para o estudo do BTB. No entanto, este modelo exatamente não pode imitar BTB dinâmica em vivo. Além disso, não há tal co-cultura de células germinativas com células de Sertoli estabeleceu como capaz de refletir todos os componentes estruturais e funcionais relevantes do BTB10,11.
Em geral, ensaios de integridade em vivo BTB normalmente são baseados em pequenas moléculas, tais como o EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina e inulina conjugado FITC (inulina-FITC). Normalmente, a difusão da biotina ou inulina-FITC do compartimento basal é bloqueada pela estrutura do BTB. Portanto, somos capazes de usar esse método para avaliar a extensão do dano BTB em comparação com grupos de controle. Enquanto BTB pode ser comprometida com certos tipos de estímulos, tais como tratamento com cádmio cloreto (CdCl2)12, BTB torna-se acessível para pequenas moléculas, os quais acabaram por inserir o compartimento adluminal como indicadores.
Um início na vivo BTB integridade ensaio envolve a injeção de biotina ou inulina-FITC na veia jugular, que envolve a cirurgia e é invasiva, complicado e demorado. Além disso, como as substâncias repórter difundem por todo o corpo através da circulação, a concentração local de biotina ou inulina-FITC nos túbulos seminíferos é limitada. Além disso, a exposição sistémica pode induzir reações imunes. Aqui, apresentamos um simples e eficaz na vivo BTB integridade ensaio permitindo injeção direta de uma pequena alíquota de inulina-FITC para o interstício de um testículo. Usando o método de rotulagem fluorescente, o processo de coloração é conveniente, como anticorpos secundários não são necessários. Aqui, o processo de tintura fluorescente entrando o testículo é visualizado.

<table><tbody><tr><td>Extrator capilar</td><td>SUTTER INSTRUMENT (EUA)</td> <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Hyclone (EUA)</td> <td>SH30258.01</td><td>diluição para 1&times; em ddH2O</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td> <td>Sigma (EUA)</td> <td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio de adesão</td><td>CITOGLAS (China)</td> <td>80312-3161</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cádmio</td><td>Sigma (EUA)</td> <td>655198-5G</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss (Alemanha)</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Papel sem poeira</td><td>Kimberly-Clark (EUA)</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Inulin-FITC</td><td>Sigma (EUA)</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de microinjeção</td><td>Zhengtianyi (China)</td><td>BJ-40</td><td>1,0 mm &nbsp; 0,8 mm&nbsp; &vezes; 100 mm</td></tr><tr><td>Chanfrador de micropipeta</td><td>NARISHIGE (JAPÃO)</td><td>EG-400</td><td></td></tr><tr><td>OUT</td><td>SAKURA (JAPÃO)</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma (EUA)</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sódico</td><td>Merck (Alemanha)</td><td>P11011</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de barbear&nbsp;</td><td>Yashen (China)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Microscópio estéreo</td><td>Nikon (JAPÃO)</td> <td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sangon Biotech (China</td><td>)A610498</td><td></td></tr><tr><td>Instrumentos cirúrgicos</td><td>Mais forte (China)</td><td></td> <td>tesouras, pinças, porta-agulhas</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>KDL (China</td><td>)20163150518</td><td>0,45 mm e vezes; 0,16 mm RW LB</td></tr><tr><td>aquecedor termostático</td><td>KELL (Nanjing, China)</td> <td>KEL-2010</td><td></td></tr><tr><td><forte>10x TBS, pH 7,6</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 M Tris</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A600194</td><td></td></tr><tr><td>1,37 M Nacl</td><td>Sangon Biotech (China)</td><td>A610476</td><td></td></tr></tbody></table>

um método in vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Espermatogênese é o desenvolvimento das espermatogónias em espermatozoides maduros nos túbulos seminíferos do testículo. Este processo é suportado por junções de células de Sertoli na barreira sangue-testículo (BTB), que é a barreira de tecido mais apertada no corpo dos mamíferos e segrega o epitélio seminífero em dois compartimentos, um basal e um adluminal. O BTB cria um microambiente exclusivo para as células germinativas em meiose eu / II e para o desenvolvimento de postmeiotic espermátides em espermatozoides através de acridina. Aqui, descrevemos um ensaio confiável para monitorar a integridade do BTB do rato testículo na vivo. Uma intacta BTB bloqueia a difusão de inulina FITC-Conjugado da basal para o compartimento apical dos túbulos seminíferos. Esta técnica é apropriada para o estudo de genes candidatos, vírus ou tóxicos ambientais que podem afetar a função do BTB ou integridade, com um procedimento fácil e de um requisito mínimo de habilidades cirúrgicas em comparação com métodos alternativos.

A montagem experimental para a realização do ensaio de integridade BTB é mostrada na Figura 1. Puxe e aguçar os capilares microinjeção com um extrator capilar e chanfrador micropipeta, respectivamente (figura 1A e 1C). O aquecedor termostático e equipamentos para o microinjection estão ilustradas na figura 1B e 1D.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-...

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a integridade da barreira sangue-testículo injetando inulina-FITC em testículos. Este é um método eficiente na vivo para estudar a integridade de barreira sangue-testículo, que pode ser comprometida por elementos genéticos e ambientais.

Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na barreira de exames de sangue dos campos de biologia sobre candidatos a genes, vírus ou toxinas ambientais que podem afetar a função ou integridade da barreira do exame de sangue. Três dias antes da cirurgia, trate pelo menos três camundongos machos C57Black/6 de oito semanas diariamente com um cloreto de cádmio de peso corporal de cinco miligramas por quilograma por injeção intraperitoneal. No dia da cirurgia, coloque um tecido limpo sobre uma área cirúrgica esterilizada com etanol de 75% e coloque um aquecedor termostático a 37 graus Celsius.Coloque um rato anestesiado no tecido e confirme a falta de resposta ao aperto do dedo do dedo. Raspe o cabelo abdominal com uma máquina de barbear e desinfete a pele exposta com 75% de etanol. Faça uma incisão de pele de um centímetro acima das glândulas pré-procriais para expor a parede abdominal, e use pequenos fórceps para levantar a pele para fazer uma incisão de 0,5 centímetros no peritônio.Use os fórceps para procurar almofadas de gordura ao redor do epidídis e testis, puxando cuidadosamente as almofadas de gordura para fora para expor um testis anexado. Coloque um pedaço de papel de nove centímetros sob as almofadas de gordura e testis, e carregue uma pipeta de microinjeção com solução inulina-FITC recém-preparada. Conecte a pipeta a uma unidade de micromanipulador e use um microscópio de dissecação para inserir suavemente a ponta de pipeta de microinjeção sob a tunica albuginea.Gire lentamente a alavanca de operação para entregar 20 microlitadores da inulina-FITC no interstício do testífico. Se a entrega for bem sucedida, o testis vai virar uma cor verde-amarela brilhante. Retorne imediatamente o testío à cavidade abdominal, e injete o testífero contralateral com 20 microliters de PBS, depois feche a pele com uma sutura cirúrgica.E coloque o mouse na almofada de calor de um aquecedor termostático. 40 minutos após a injeção, use uma tesoura afiada para coletar os testículos de cada rato e lave os tecidos em um mililitro de PBS gelado. Em seguida, fixar os testículos em 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius por 12 a 24 horas seguido por três lavagens em 1,5 mililitros de 1%PBS por lavagem.Após 30% de desidratação de sacarose durante a noite, transfira as amostras para quadros individuais de incorporação e cubra os tecidos com o composto de temperatura de corte ideal. Defina a temperatura de um criostat para 20 graus Celsius negativos e coloque os quadros no criostat por cerca de 10 minutos até que o OCT esteja congelado. Em seguida, encha cada quadro de incorporação com OCT fresco até que todo o testis esteja coberto em cada molde.Quando a segunda camada de OCT tiver congelado, adquira uma seção transversal de cinco micrômetros de espessura de cada testímetro, capturando as seções teciduais em lâminas de microscópio de vidro à medida que são obtidas. Para a imagem das amostras, primeiro aqueça os slides em uma caixa umidificada à temperatura ambiente. Após 10 minutos, lave os slides três vezes em soro fisiológico fresco com tampo tris por lavagem e deixe as seções secarem por cinco minutos protegidas da luz.Use papel sem poeira para remover qualquer solução salina residual e monte as amostras com meio de montagem suplementado pelo DAPI. Em seguida, cubra cada amostra com um deslizamento de cobertura invertido e imagem as amostras sob o objetivo de 20X de um microscópio confocal. Três dias de tratamento de cloreto de cádmio causam danos à barreira de exames de sangue permitindo a difusão da inulina-FITC do compartimento basal para o compartimento apical do epitélio seminiferous.Em contraste, essa difusão é bloqueada no controle de testículos tratados com PBS. A extensão do dano da barreira do exame de sangue é determinada pelo cálculo da razão da distância da difusão inulina-FITC ao raio do mesmo túbulo seminifero. Além disso, a barreira intacta de exames de sangue no rictor heterozigosto blocou a difusão de inulina através da barreira no compartimento apical, enquanto os camundongos rictor condicional possuem uma barreira de exames de sangue comprometida que permite a difusão de inulina.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de entregar inulina-FITC preparada no dia do experimento e manter o tecido protegido da luz, já que o FITC é uma molécula sensível à luz. As implicações dessa técnica se estendem à terapia da espermatogênese prejudicada porque a função da barreira do exame de sangue é fornecer um microambiente imunoprivilegiado para a conclusão da meiose na espermatogênese. Após seu desenvolvimento, essa técnica fornece uma forma de pesquisadores do campo da medicina reprodutiva explorarem a subfertilidade e a infertilidade em camundongos.Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeíddedes pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de roupas e máscaras faciais devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio para ensaio de permeabilidade dos vasos sangüíneos

Este artigo descreve a microinjecção e a electroporação de testículo do rato in vivo, como uma técnica para a transfecção de células de testículo de rato para estudar os processos exclusivos da espermatogénese. O protocolo apresentado envolve os passos de preparação de capilar de vidro, através da conduta de microinjecção eferente, e transfecção por electroporação.

In Vivo microinjeção e Eletroporação de testículos de camundongo

Nós apresentamos um protocolo para estudar as interações endotelial-pericyte humanos no rato usando uma variação do ensaio plugue angiogênese gel matriz.

No estudo in vivo da Human Interaction Endotelial-pericyte usando o plug Ensaio Matrix Gel no mouse

Aqui são apresentados dois métodos para determinar a função de barreira intestinal. Um medidor epitelial (volts/ohms) é usado para a medição da resistência elétrica transepitelial de epitélios cultivadas diretamente nos poços de cultura de tecidos. Nos ratos, o método de gavage FITC-dextrano é usado para determinar a permeabilidade intestinal na vivo.

In Vitro e In Vivo de abordagens para determinar a permeabilidade da célula epitelial Intestinal

Aqui nós apresentamos um ensaio de permeabilidade vascular do cérebro de rato usando injeção intraperitoneal de traçadores fluorescentes, seguido de perfusão que é aplicável aos modelos animais de disfunção da barreira hemato - encefálica. Um hemi-cérebro é usado para avaliar quantitativamente a permeabilidade e o outro para visualização/imunocoloração de traçador. O procedimento leva 5-6 h por 10 ratos.

Na Vivo barreira hemato - encefálica permeabilidade ensaio nos ratos usando fluorescente etiquetado traçadores

Aqui, nós apresentamos um protocolo de eCLIP para determinar alvos principais do RNA de candidatos do RBP no testis.

Método avançado da imunoprecipitação da reticulação (eCLIP) para a identificação eficiente do RNA proteína-ligado no testis do rato

Aproveitando a microscopia intravital, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real do derramamento de células epiteliais intestinais em animais vivos. Portanto, a mucosa intestinal topicamente manchada (acriflavina e rhodamineB-dextran) de camundongos anesthetizados é imageda até a resolução unicelular usando microscopia confocal.

Uma abordagem baseada em microscopia intravital para avaliar a permeabilidade intestinal e o desempenho do derramamento de células epiteliais

Este protocolo descreve a microdisseção assistida pela transilação de segmentos de túbulos seminiferos adultos representando estágios específicos do ciclo epitelial seminiferante, e tipos de células, e posterior imunossuagem de preparações de abóbora e segmentos de tubulações intactas.

Dissecção assistida por transilluminação de etapas específicas do ciclo epitelial seminifero do rato para análises de imunostaining a jusante

Este artigo relata uma inibição in vivo do CENP-E através de cirurgia abdominal e injeção testicular de GSK923295, um modelo valioso para a divisão meiótica masculina. Usando os ensaios de imunofluorescência, citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão, mostramos que a inibição do CENP-E resulta em desalinhamento cromossômico e instabilidade do genoma em espermatócitos de camundongos.

Avaliação funcional da cinesina-7 CENP-E em espermatócitos utilizando inibição in vivo , imunofluorescência e citometria de fluxo

No presente protocolo, a função de barreira endotelial da glândula submandibular (SMG) foi avaliada por meio da injeção de diferentes marcadores fluorescentes de peso molecular nas veias angulares de modelos animais de teste in vivo sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons.

In vivo Detecção de Permeabilidade Vascular em Glândula Submandibular de Camundongo

No presente estudo, o dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato (FITC) é administrado a camundongos via gavagem oral para avaliar a permeabilidade intestinal tanto in vivo quanto em amostras plasmáticas e fecais. Como a função de barreira intestinal é afetada em muitos processos de doenças, este ensaio direto e quantitativo pode ser usado em diversas áreas de pesquisa.

Avaliação da integridade da barreira intestinal em camundongos usando Dextrano marcado com fluoresceína-isotiocianato

Aprenda a avaliar a integridade da barreira hemato-testicular em camundongos C57Black/6 usando injeção de inulina-FITC in vivo. Este método permite estudar os efeitos de toxinas ambientais e fatores genéticos na fertilidade masculina.

Um método In Vivo para estudar a integridade de barreira de sangue-testículo de rato

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