Name: Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Aprenda a técnica de crioseccionamento simultâneo de múltiplos cérebros de roedores para imunohistoquímica. Este método reduz a variabilidade entre amostras e otimiza a visualização de estruturas anatômicas e proteínas.

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Fundos de apoio de missão de PCH com suporte a pesquisa relatada neste manuscrito. Os autores gostaria de agradecer Daniel Griffiths as imagens usadas nas figuras.

A técnica de Megabrain foi otimizada usando o cérebro todo e hemisected de C57Bl6 ratos adultos machos5, ratos Sprague-Dawley jovens e adultos ratos Sprague Dawley que foram perfundido com solução salina tamponada fosfato (PBS) seguida de 1x de transcardially por de paraformaldeído 4%6. Resultados semelhantes podem ser realizados em outras cepas de camundongo e rato, em ambos os sexos e de diferentes faixas etárias. O estudo para gerar dados para este manuscrito usado juvenis ratos Sprague-Dawley e foi aprovado pelo Comitê de uso e cuidados com animais institucional Universidade do Arizona, e os animais experimentais foram cuidados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de laboratório Animais7.
1. Cryoprotection de cérebros perfundidos
<ol><li>Seguir bem sucedido transcardial perfusão6, recolher o cérebro cheio de6,8 de animais e fixar, colocando em um frasco de 25 mL de paraformaldeído 4% em PBS por 24 h. Cuidado: Paraformaldehyde é um fixador de tecidos tóxicos; Manuseie com cuidado. Transferir o paraformaldeído para um contentor de resíduos especificamente rotulado que identifica sua concentração e volume dentro uma coifa química e então a loja nos resíduos químicos do armário até descartado por segurança química ou devidamente treinados.</li>
	<li>Após decorrido 24 h, em uma coifa, retire os miolos paraformaldeído 4%, usando uma espátula. Transferi o cérebro para um tubo de aproximadamente 20 mL da solução de sacarose a 15% em 1x Tris salino (TBS) até o cérebro afunda até o fundo do frasco (aproximadamente 24 h).</li>
	<li>Em seguida, transferi o cérebro de um frasco de cerca de 20 mL de solução de 30% de sacarose em 1 x TBS, até o cérebro afunda até o fundo do frasco (aproximadamente 24-48 h).</li>
</ol>2. cérebro congelamento
<ol><li>Coloque um copo de vidro de 500 mL em uma cama de gelo seco em um balde de gelo. Despeje o copo de vidro, 300 – 400 mL de isopentano (2 metil-butano).</li>
	<li>Permitir que a temperatura do isopentano chegar entre-45 ° C e -50 ° C. Intimamente, monitorar e manter esta faixa de temperatura com um termómetro, mantendo-se constante durante todo o procedimento. Certifique-se de que as leituras de temperatura são tomadas a partir do meio da solução e enquanto não tocar a parte inferior ou lateral do copo.</li>
	<li>Sobre a bancada, preencher uma descartável incorporação molde (ver lista de materiais) cheio de aproximadamente 1/2 de temperatura de corte ideal (OCT; ver Tabela de materiais) composto. Certifique-se de que não há nenhuma bolha de ar na OCT. Se houver quaisquer bolhas de ar retire com uma espátula ou uma agulha.</li>
	<li>
Retire o primeiro cérebro do frasco de 30% de sacarose, com uma espátula. Neste ponto, ou congelar todo o cérebro ou hemisect, dependendo do projeto de estudo.
	<ol>
<li>Hemisected cérebro, use uma lâmina nova para fazer um corte limpo através do tecido para separar os hemisférios. Se não é necessário para o estudo, remova o cerebelo e os bulbos olfatórios nesta fase. Se o cerebelo é necessária para o estudo, sugere-se para cortar uma área plana na extremidade posterior do cérebro para auxiliar o cérebro no pé direto no molde. Se o estudo requer apenas o tecido de uma região localizada, uma matriz de cérebro de roedor pode ser usado para bloquear o cérebro com base nas coordenadas conhecidas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dar o cérebro um numérico nomeando o sistema. Desenhe um diagrama como mostrado na Figura 1. Escreva o número do primeiro cérebro para ser colocado no molde Megabrain na posição 2, deixando a posição 1 como um espaço em branco para ajudar na identificação rápida da orientação em que o cérebro foram congelado.</li>
	<li>Usando fórceps rombudo ou uma pinça, pegar o cérebro para ser colocado na posição 1. Oriente o cérebro com o lado a ser cortado primeiro virado para cima. Baixe o cérebro em OCT no local apropriado, usando a pinça para ajustar sua posição até que ela representa de forma independente.</li>
	<li>Repita as etapas de 2.3-2.5 para os cérebro/hemisférios restantes a serem congelados em posições 3 – 10. Evite os miolos/hemisférios de posicionamento em um layout simétrico.</li>
	<li>Revise todos os 9 cérebros no molde Megabrain. Uma vez que o cérebro está independente, ereto e corretamente orientado na OCT (como mostrado na Fig. 2B), adicione mais OCT no molde (até o topo dos cérebros são cobertas). Novamente, certifique-se que não há nenhuma bolha de ar visível na OCT.</li>
	<li>Use a pinça para segurar o canto do molde, assegurando que a pinça não tornar-se parcialmente submerso na OCT (Figura 3A). Tendo o cuidado de manter o nível do molde, baixe o molde para o isopentano (-45 ° C a-50 ° C) para que o fundo terceiro do molde está submersa. Segure aqui para permitir que quaisquer bolhas na OCT para subir à superfície e longe do tecido (Figura 3B).</li>
	<li>Após 30 s, menor o molde inteiro para o isopentano e lançamento da pinça, deixando o Megabrain submersa pelo menos 3 min (Figura 3). Certifique-se de que o molde é mantido nível, assim cérebro permanecem na posição vertical e equidistantes (Figura 3D).</li>
	<li>Após 3 min, uso a pinça para remover o molde contendo o congelado, OCT incorporado cérebros (Figura 3E) do isopentano.</li>
	<li>Imediatamente, embrulhe o molde e seu conteúdo em folha de alumínio e rotulá-la com o seu número de animais ou Megabrain. Toque o Megabrain congelado com moderação quanto possível para evitar descongelar o tecido.</li>
	<li>Este Megabrain agora pode ser transferida para um freezer-20 ° C e armazenado por um período mínimo de 24 h. Nota: Protocolo pode ser pausado aqui e o Megabrain pode ser armazenado congelados até cryosectioning tem lugar.</li>
</ol>3. preparar o Megabrain para secionar no criostato
<ol><li>Regule a temperatura do gabinete do criostato a-19 ° C. Certifique-se que esta temperatura é atingida antes de continuar. Em toda a corte, certifique-se de que a temperatura do gabinete permanece entre-18 ° C e -20 ° C.</li>
	<li>Pegue o Megabrain do congelador-20 ° C e coloque-o no criostato. Além disso, coloca um mandril das dimensões de tamanho apropriado e dois pincéis de ponta finas em criostato. Embora tanto o Megabrain e o chuck no criostato pelo menos 15 min vir para a temperatura do criostato.</li>
	<li>Adequadamente os slides de etiqueta com o número de identificação de Megabrain e o número do slide. Colocar esses slides em um slide mais quente (35 a 45 ° C).</li>
	<li>Desembrulhe o Megabrain partir da folha de alumínio. Use uma lâmina de barbear para cortar verticalmente os cantos do molde para permitir a fácil remoção do bloco de out do molde (Figura 4A).</li>
	<li>Dispense uma camada fina (aproximadamente 3 mm de espessura) de outubro para o chuck.</li>
	<li>Rapidamente, com contato mínimo entre os dedos e a OCT, coloque o Megabrain sobre o chuck, na orientação desejada. Pinça grande também pode ser usada para esta etapa para minimizar a descongelar. Antes de começar a seção, deixe o Megabrain montado chuck no criostato por 15 – 20 min permitir a OCT congelar completamente.</li>
	<li>Uma vez que a camada de base de PTU congelou, aplicar uma camada de 2 mm de espessura OCT em torno dos lados da Megabrain e permitir isto a descer dos lados para o chuck. Isso ajuda a proteger o Megabrain para o chuck. Mais uma vez, antes de continuar, deixe o chuck Megabrain montado em criostato por 15 – 20 min permitir a OCT congelar.</li>
	<li>Use uma lâmina de barbear para remover qualquer excesso OCT pelo lado ou fundo do mandril (Figura 4B).</li>
</ol>4. Cryosectioning o Megabrain
<ol><li>Antes de começar, certifique-se de que um copo contendo pelo menos 20 mL 1X PBS está acessível.</li>
	<li>Posicione o chuck, montado com o Megabrain, na cabeça do chuck no criostato (Figura 4B).</li>
	<li>Defina o criostato para cortar na espessura desejada. A metodologia atual foi otimizada para 10 µm a 50 µm de seções.</li>
	<li>Aparar a OCT e tecido conforme necessário para atingir a região do cérebro desejado para coleta de tecido (Figura 4).</li>
	<li>Quando estiver pronto para coletar o tecido, baixe a placa anti-roll até descansa no palco e girar o punho do criostato para tomar uma única seção. Lentamente levante a placa anti-roll, tendo o cuidado que o Megabrain seccionado não está associado a placa anti-roll e não cai fora do palco, Figura 4).</li>
	<li>Delicadamente, use os pincéis para Megabrain madeixa até ele é deitado de fase criostato (Figura 5A). (Se for necessário, mantenha a OCT plana usando os pincéis para impedir o rolamento).</li>
	<li>Remover do slide mais quente e focalizar o slide, o lado da etiqueta virado para baixo, sobre a seção de Megabrain no palco permitindo a seção grudar o slide.</li>
	<li>Rapidamente, aplicar uma gota de 1X PBS a cada secção de tecido no slide e não permita que estas secar até que eles tenham sido escovados lisos (consulte a etapa 4.9).</li>
	<li>Use um pincel com ponta fino mergulhado em 1X PBS para escovar fora quaisquer bolhas no tecido e desdobre o tecido, então ele está deitado de slide (Figura 5B). Tome cuidado para não alterar a posição das seções do cérebro e, assim, perder a posição relativa às outras seções de tecido. Manipule o tecido com cuidado para evitar as lágrimas. Manter as seções do cérebro longe das bordas do slide, como espaço periférico é necessário para uma lamela e aplicação de caneta PAP em alguns protocolos de coloração.</li>
	<li>Coloque o slide para o slide mais quente e seco durante 45 min. tampa conforme necessário para impedir que a poeira fixando-se sobre o tecido. Depois de seco, armazene os slides na-80 ° C até utilização posterior.</li>
</ol>

<ol><li>Lyck, L., Dalmau, I., Chemnitz, J., Finsen, B., Schroder, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+quantitative+studies+of+neurons+and+glia+in+human+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for quantitative studies of neurons and glia in human neocortex.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (3), 201-221 (2008).</li>
<li>Fritz, P., Wu, X., Tuczek, H., Multhaupt, H., Schwarzmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+in+immunohistochemistry.+A+research+method+or+a+diagnostic+tool+in+surgical+pathology%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pathologica%22%5BJournal%5D)">Quantitation in immunohistochemistry. A research method or a diagnostic tool in surgical pathology?</a> Pathologica. 87 (3), 300-309 (1995).</li>
<li>Walker, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+immunohistochemistry--issues+concerning+methods%2C+utility+and+semiquantitative+assessment+I%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I.</a> Histopathology. 49 (4), 406-410 (2006).</li>
<li>Evilsizor, M. N., Ray-Jones, H. F., Lifshitz, J., Ziebell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+for+immunohistochemistry+on+cryosectioned+rat+brain+tissue%3A+example+staining+for+microglia+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primer for immunohistochemistry on cryosectioned rat brain tissue: example staining for microglia and neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (99), (2015).</li>
<li>Harrison, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvins+AT-D1+and+E1+differentially+impact+functional+outcome%2C+post-traumatic+sleep%2C+and+microglial+activation+following+diffuse+brain+injury+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Resolvins AT-D1 and E1 differentially impact functional outcome, post-traumatic sleep, and microglial activation following diffuse brain injury in the mouse.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 47, 131-140 (2015).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLoS Biology. 8 (6), e1000412(2010).</li>
<li>Kennedy, H. S., Puth, F., Van Hoy, M., Le Pichon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+removing+the+brain+and+spinal+cord+as+one+unit+from+adult+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for removing the brain and spinal cord as one unit from adult mice and rats.</a> Lab Animal (NY). 40 (2), 53-57 (2011).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> CSH Protocols. 2008, pdb prot4986 (2008).</li>
<li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Repeated+Freeze-Thaw+Cycles+on+the+Quality+of+Biomolecules+in+Four+Different+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">The Impact of Repeated Freeze-Thaw Cycles on the Quality of Biomolecules in Four Different Tissues.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (5), 475-483 (2017).</li>
<li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+and+principles+of+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Reproductive+Medicine%22%5BJournal%5D)">The history and principles of cryopreservation.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 20 (1), 5-13 (2002).</li>
</ol>

Os autores têm sem divulgações.

É preciso considerar durante este procedimento que a temperatura da Megabrain e seus arredores deve ser constantemente monitorada para evitar descongelar e recongelar do tecido. O cérebro só pode ser removido do congelador-20 ° C acima de 3 vezes como cada vez é tocado e esquerda no criostato, com uma temperatura mais quente flutuante, o tecido derrete e refreezes, causando uma geleia como textura e tecido anormal integridade10. Portanto, é ideal para cortar o Megabrain tudo de uma vez.
<p cla...

Aqui, apresentamos o protocolo para um método novo, que chamamos de Megabrain, desenvolvido para cryosection vários roedores cérebros simultaneamente para procedimentos de imuno-histoquímica a jusante. Um Megabrain permite a produção de slides único contendo tecido de vários animais. Esta técnica foi otimizada para corte coronais seções de 9 hemisférios do rato adulto, ou 5 cérebros completo adultos, simultaneamente. Portanto, a técnica é mais aplicável em estudos imuno-histoquímicos grandes ou outras análises feitos no tecido cerebral slide-montado de uma grande coorte de animais.
Imuno-histoquímica envolve o uso de anticorpos específicos dirigidos contra proteínas de interesse para compreender e caracterizar a sua expressão e as mudanças celulares em tecido específico1,2,3. O uso de imuno-histoquímica é prevalente em pesquisas da neurociência, entre outras disciplinas científicas, auxiliando na compreensão do cérebro4celular e molecular. Estudos em grande escala envolvendo muitos animais e seções do cérebro podem ser tanto recurso e tempo intensivo. Como tal, há uma multifacetada lógica por trás do desenvolvimento da Megabrain: reduzir o tempo gasto cryosectioning, montagem e manchando o tecido, enquanto estiver usando, consequentemente, menos reagentes. Além disso, a capacidade de agilizar o processo e manchar o cérebro múltiplas na mesma rodada ajuda a aliviar um pouco a variabilidade entre lotes, uma limitação de imuno-histoquímica3a coloração. Além disso, um Megabrain de corte é uma alternativa de economia de tempo para secionar cérebros de roedores congelados individuais e permite a comparação rápida de tecido entre animais ou até mesmo grupos de tratamento por técnicas de microscopia.

<table><tbody><tr><td>Composto CRYO-OCT da Andwin scientific tissue-tek (caixa de 12)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Peel-A-Way Moldes de Embutir Descartáveis</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-41</td><td></td></tr><tr><td>Pinça/Fórceps de Ponta Forte Reta de Alta Precisão Fisherbrand</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-128</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de Cintilação HDPE de 20 mL da Fisherbrand com Tampa de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose, garrafa de polietileno 2,5 kg</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2-212</td><td>As concentrações de sacarose de 15% e 30% precisam ser compensadas.</td></tr><tr><td>2-Metilbutano (Certificado), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>PYREX Copos de Forma Alta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-546E</td><td></td></tr><tr><td>Termômetros de Imersão Parcial de Uso Geral em Vidro Fisherbrand (-50 a +50 &deg; C)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>13-201-642</td><td></td></tr><tr><td>Marca Fisher&nbsp; Espátula Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>STANLEY Lâmina de Barbear</td><td>Grainger</td><td>4A807</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo Edge-Rite</td> Lâminas de microscópio <td>Fisher Scientific</td><td>14-070-60</td><td></td></tr><tr><td>(1" frost) - branco</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-034-979</td><td></td></tr><tr><td>Gibco&nbsp; PBS (Phosphate Buffered Saline) 10x, pH 7.2</td><td>Fisher Scientific</td><td>70-013-032</td><td>Diluir para 1X&nbsp; antes de usar</td></tr><tr><td>15 peças de pincéis de pintura fina</td><td>Amazon</td><td>B079J12ZRV</td><td></td></tr><tr><td>caneta PAP</td><td>abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Chuck Mostrado na Figura 4 foi feito sob medida por um técnico de laboratório, no entanto, tamanhos semelhantes estão disponíveis para encomenda de outras empresas comercialmente.</td><td>Ciências de Microscopia Eletrônica</td><td>EMS065</td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histologia e imunohistoquímica são métodos de rotina de análise para visualizar a anatomia microscópica e localizar as proteínas dentro de tecidos biológicos. Em neurociência, bem como uma infinidade de outros campos científicos, estas técnicas são utilizadas. Imuno-histoquímica pode ser feito em tecido de slide montado ou seções flutuantes. Preparação de amostras de slides montados é um processo intensivo. O seguinte protocolo para uma técnica, chamada de Megabrain, reduziu o tempo levado para cryosection e montagem de tecido cerebral em até 90% combinando vários cérebros em um único bloco congelado. Além disso, esta técnica reduzida variabilidade vista entre rodadas, em um grande estudo histoquímico de coloração. A técnica atual foi otimizada para o uso de tecido cerebral de roedores em análises imuno-histoquímica a jusante; no entanto, pode ser aplicado a diferentes áreas científicas que usam cryosectioning.

Um resultado final positivo para este procedimento é um tecido que se encontra no slide, sem bolhas ou lágrimas, na orientação em que estavam congelados. Seções do tecido são espaçadas separados e facilmente identificável devido a boa colocação do cérebro na OCT e boa notação como demonstrado na Figura 1. Supondo que o tecido cerebral foi coletado de animais de idade semelhante, e que o tecido foi devidamente alinhado na OCT, seções coletadas em um slide deve...

Aqui, apresentamos um protocolo para congelar e secção de tecido cerebral de vários animais como uma alternativa economiza tempo de processamento único cérebro. Isto reduz a variabilidade de coloração durante a imuno-histoquímica e reduz o tempo cryosectioning e imagens.

Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...

Este método de economia de tempo reduz a variabilidade entre rodadas de procedimentos imunohistoquímicos em estudos de neurociência para otimizar a visualização da anatomia e proteínas e tecidos locais. A principal vantagem dessa técnica é que ela reduz o tempo necessário para criosecção e montagem de tecido cerebral, combinando múltiplos cérebros em um único bloco congelado. Embora esta técnica seja otimizada para seções coronais de cérebros de roedores, ela pode ser adaptada a seções sagitas ou transversais ou diferentes tipos de tecidos, como músculo ou fígado.Após a perfusão transcárquia bem sucedida, pós-fixar os cérebros dos animais em um frasco de 25 mililitros de 4% de paraformaldeído na PBS por 24 horas. Depois disso, use fórceps de ponta sem corte para remover os cérebros do paraformaldeído. Transfira o cérebro para um frasco com aproximadamente 20 mililitros de solução de 30% de sacarose em TBS.Mantenha os cérebros e a solução até que eles afundem no fundo do frasco. Em seguida, coloque um copo de vidro de 500 mililitros em uma cama de gelo seco em um balde de gelo. Em seguida, despeje 300 a 400 mililitros de isopentane no béquer.Mantenha a isopentane entre 45 negativos e 50 graus Celsius negativos. Na parte superior do banco, encha um molde descartável de incorporação aproximadamente meio cheio com temperatura de corte ideal ou composto OCT. Use uma agulha para remover quaisquer bolhas de ar do molde.Use os fórceps de ponta para remover o primeiro cérebro da solução de sacarose. Em seguida, use uma nova lâmina de barbear para remover o cerebelo e lâmpadas olfativas antes de separar os hemisférios. Em seguida, dê ao cérebro um sistema numérico de nomeação.Use fórceps contundentes, pegue o cérebro para ser colocado na posição dois, e oriente-o com o lado a ser cortado primeiro voltado para cima. Abaixe o cérebro para dentro do OCT e use a pinça para ajustar sua posição até que fique independente. Uma modificação fundamental desta técnica é o espaço em branco na posição um.Este espaço é designado para permitir fácil identificação da orientação do megacérebro e, portanto, identificar o animal associado a cada cérebro. Depois de todos os cérebros terem sido posicionados no molde, adicione OCT suficiente para cobrir os topos do cérebro, em seguida, use uma agulha para remover quaisquer bolhas de ar. Segure o canto do molde com fórceps garantindo que os fórceps não fiquem parcialmente submersos no OCT.Em seguida, abaixe o molde para dentro da isopia para que o terço inferior do molde fique submerso. Após 30 segundos, abaixe todo o molde na isopentane e solte-o dos fórceps. Após três minutos, use os fórceps para remover o molde da isopentane.Enrole imediatamente o molde e seu conteúdo em papel alumínio e rotule-o adequadamente. Transfira o megacérebro para um congelador negativo de 20 graus Celsius por um mínimo de 24 horas. Primeiro, coloque a temperatura do armário criostat para 19 graus Celsius negativo.Retire o megacérebro do congelador e coloque-o no criostat. Em seguida, coloque um mandril e dois pincéis finos no criostat. Depois disso, rotule os slides com o número de identificação do megacérebro e o número do slide e coloque os slides no aquecedor de slides.Em seguida, desembrulhe o megacérebro e use uma lâmina de barbear para cortar os cantos do molde. Distribua uma fina camada de OCT no mandril. Em seguida, rapidamente colocar o megacérebro no mandril.Depois que o OCT estiver completamente congelado, aplique uma camada de dois milímetros de OCT ao redor dos lados do megacérebro e deixe que ele corra pelos lados para o mandril. Use uma lâmina de barbear para remover qualquer excesso de OCT dos lados e parte inferior do mandril. Primeiro, posicione o mandril montado com o megacérebro na cabeça do criostat.Em seguida, coloque o criostat para a espessura desejada. Corte o OCT e o tecido conforme necessário para chegar à região cerebral desejada para coleta de tecidos. Em seguida, abaixe a placa anti-rolo até que ela repouse no palco e gire a alça criostat para tomar uma única seção.Retire lentamente a placa anti-rolo, tomando cuidado para que a seção do tecido não seja tocada. Use delicadamente as pincéis para desenrolar a seção de tecido até que esteja plana. Se necessário, segure o oct flat usando as pincéis para evitar o rolamento.Em seguida, remova o slide do aquecedor de slides e passe o lado da etiqueta de slides para baixo sobre a seção megacérebro e deixe-o grudar no slide. Aplique rapidamente uma gota de PBS na seção tecidual. Usando um pincel fino mergulhado na PBS, escove todas as bolhas na seção tecidual e desdobre o tecido para que ele fique deitado no escorregador.Por fim, coloque o slide no aquecedor para secar por 45 minutos e armazene o slide a 80 graus Celsius negativo. Neste protocolo, tecidos cerebrais de nove animais foram preparados e criosectionados simultaneamente. Após a crioseção, a coloração de H&E pode ser realizada para avaliar a qualidade da crioproteção.Resultados representativos da molécula adaptadora de ligação de cálcio ionizada uma ou Iba1 coloração de microglia mostram coloração consistente entre cada cérebro de estudo em um único megacérebro. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de monitorar constantemente a temperatura enquanto congela o megacérebro para evitar rachaduras ou descongelamento e, em seguida, recongelamento do tecido que leva à integridade anormal do tecido. Não é aconselhável segregar diferentes grupos de tratamento em megacérebros separados, pois isso pode criar variância entre os grupos durante a coloração e reduzir o viés e a subjetividade durante a imagem e análise.Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como usar PBE e trabalhar em um capuz devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O perfilamento da expressão de RNA em regiões discretas do cérebro de camundongos exige uma estratégia precisa e repetível de coleta de tecidos. Aqui é descrito um protocolo que utiliza o seccionamento coronal do cérebro e a microdissecação assistida por perfurador de tecidos. O rendimento e a qualidade do RNA total obtido a partir das amostras resultantes confirmam a utilidade do método descrito.

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

Nós descrevemos processos de preparação e de gravação electrofisiológico de fatias do cérebro que mantêm o eixo dorso-ventral do córtex entorrinal medial (MEC). Devido codificação neural da localização seguinte uma organização dorsal-ventral dentro do MEC, estes procedimentos facilitar a investigação dos mecanismos celulares importantes para navegação e de memória.

Preparação de fatias parassagital de Investigação de dorso-ventral Organização do Rodent córtex medial entorrinal

Este vídeo demonstra um protocolo passo a passo detalhado para preparar seções congeladas de tecido cerebral de camundongo para análises a jusante.

Processamento de um cérebro de camundongo para análise a jusante

Este protocolo descreve passos processuais básicas para a realização de célula inteira gravações de patch-clamp. Esta técnica permite o estudo do comportamento eléctrico de neurónios, e quando realizados em fatias do cérebro, permite a avaliação de várias funções neuronais a partir de neurónios que ainda estão integrados nos circuitos do cérebro relativamente bem conservadas.

Gravações de células inteiras de patch-clamp em Brain Slices

Consecutivos crio-secções são recolhidas para permitir que aplicações histológicas e enriquecimento do RNA para medições de expressão de genes usando regiões adjacentes a partir de um músculo esquelético único rato. RNA de alta qualidade é obtida a partir de 20 - 30 mg de criosecções e medições agrupados serão comparadas diretamente entre aplicativos.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

Aqui, nós fornecemos um método confiável e de baixo custo para gerar electroporated culturas do cérebro organotypic fatia de embriões do rato apropriados para microscopia confocal e técnicas de geração de imagens ao vivo.

Ex Utero Eletroporação e culturas Organotypic fatia do cérebro embrionário Mouse para imagens ao vivo de migração gabaérgica interneurônios

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

Apresentamos um protocolo prático, passo a passo, rápido para remoção do cérebro do rato e dissecção de regiões discretas de tecido cerebral fresco. A obtenção de regiões cerebrais para análise molecular tornou-se rotina em muitos laboratórios de neurociência. Essas regiões cerebrais são imediatamente congeladas para obter dados transcriômicos de alta qualidade para análise de nível de sistema.

Microdisseção do Cérebro de Camundongos em Regiões Funcional e Anatomicamente Diferentes

O presente protocolo descreve uma ressecção padronizada de tumores cerebrais em roedores através de uma abordagem minimamente invasiva com um sistema integrado de preservação de tecidos. Esta técnica tem implicações para espelhar com precisão o padrão de cuidado em roedores e outros modelos animais.

Implementação de ressecção de tumor cerebral minimamente invasiva em roedores para coleta de tecido de alta viabilidade

O presente protocolo descreve uma estratégia prática para agilizar a etapa de verificação das coordenadas de injeção estereotáxica antes de realizar o rastreamento viral usando corantes e seções congeladas.

Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento

As neurociências modernas precisam explorar as diferenças entre muitas espécies, incluindo roedores de laboratório e humanos. No entanto, surgem dificuldades técnicas quando mamíferos de cérebro grande estão envolvidos. Essa abordagem aborda a variação interespécies das populações neuronais em mamíferos amplamente diferentes, produzindo resultados comparáveis a serem mapeados para revelar padrões evolutivos.

Uma abordagem comparativa para estudos quantitativos de contagem celular em cérebros de mamíferos amplamente diferentes

Aprenda a técnica de crioseccionamento simultâneo de múltiplos cérebros de roedores para imunohistoquímica. Este método reduz a variabilidade entre amostras e otimiza a visualização de estruturas anatômicas e proteínas.

Cryosectioning simultânea de vários cérebros de roedores

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