Name: Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Aprenda a induzir e avaliar cruzes de endogamia em formigas Vollenhovia emeryi para estudos genéticos de determinação de sexo. Este protocolo permite mapeamento genético e análises moleculares em himenópteros.

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Agradecemos Sr. Taku Shimada, o delegado de AntRoom, Tóquio, Japão, fornecendo-nos com a sua fotografia de V. emeryi reproductives. Este projeto foi financiado pela sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) bolsa de pesquisa para jovens cientistas (16J00011) e concessão de auxílio para jovens cientistas (B)(16K18626).

1. coleta e manutenção de V. Emeryi colônias em laboratório de campo
Nota: Ninhos de V. emeryi são encontrados em logs e caído em decomposição árvore branchesin florestas secundárias em todo o Japão a apodrecer. Esta espécie mostra dois tipos de colônias, ou seja, (1) colônias produzindo apenas longimanus rainhas e (2) colônias produzindo principalmente rainhas-de-asa-curta, além do pequeno número de rainhas longimanus8,14. Neste protocolo, recolhemos o último tipo de colônias na província de Ishikawa, Japão.
<ol><li>Colete V. emeryi colônias durante o início do verão. Nota: Para obter um número suficiente de indivíduos sexuais durante a temporada reprodutiva, colônias contendo mais de 300 indivíduos são preferidas.</li>
	<li>Transferi os espécimes de formiga dos ramos coletados para um ninho de gesso artificial com uma tampa de vidro usando um aspirador (Figura 2, à esquerda).</li>
	<li>Manter colônias no ninho artificial a 25 ° C, sob um ciclo de luz/escuridão 16:8 h. Fornece água da torneira com um frasco de lavagem para molhar o gesso.<ol>
<li>Adicione cerca de 100 mg de pó de grilo seco envolvido em papel alumínio e açúcar mascavo cheio de água na ponta (ponta de 20 µ l) todos os dias até surgem reproductives novos (F1 alado-rainhas e machos de1 F).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cruzes de laboratório experimental
Nota: Reproductives novos começam a surgir do final do verão ao Outono (Figura 3). Longimanus rainhas são produzidas sexualmente, e damas-de-asa-curta são produzidas uma relação clonal e têm o genoma materno (Figura 1). Use longimanus rainhas e machos por consanguinidade cruzes.
<ol><li>Para parar os indivíduos de se mover, coloque colônias em uma sala de ambiente constante a 4 ° C por 15 min.</li>
	<li>Retire as pernas meados dos 30 trabalhadores usando fórceps sob um microscópio estereoscópico e transferi-los para o ninho novo em gesso menor (Figura 2, direita) por consanguinidade cruzes. Nota: As pernas são removidas para distinguir os trabalhadores presentes os trabalhadores que vão ser produzidos pelas cruzes de endogamia subsequentes.</li>
	<li>Adicione 3-4 larvas ou pupas em um ninho de gesso contendo os trabalhadores. Nota: Os trabalhadores mostram atividade exploratória na colônia de rainhas-menos F0 . Larvas ou pupas podem efetivamente atrair esses trabalhadores e reproductives novos no centro da colônia durante o teste de passagem. Como resultado, manter as condições da colônia experimental perto da colônia normal.</li>
	<li>Transferi uma rainha longimanus e um macho em um ninho de gesso preparado na etapa 2.3 para procriação consanguínea cruzes.</li>
	<li>Manter colônias a 25 ° C, sob um ciclo de luz/escuridão 16:8 h com comida e água fornecida conforme descrito no ponto 1.3, até a rainha perde as asas e pôr ovos. Nota: Isso leva uma semana para um mês.</li>
	<li>Verifica o cotidiano da colônia experimental sob um microscópio estereoscópico. Depois de executar a endogamia atravessa entre a prole de1 F, ovos podem ser observados sob um microscópio estereoscópico.</li>
	<li>Após a F1 rainha começa a postura dos ovos, remover os machos de1 F e larvas ou pupas adicionadas na etapa 2.3 do ninho para evitar misturar F2 geração (descendência e a geração de1 F (machos e fêmeas usadas por endogamia Cruzes) produzidos a partir de cruzamentos de consanguinidade). Nota: Se houver alguns machos na colônia, é possível induzir a endogamia cruzes usando um macho e 1 a 3 rainhas na mesma colônia experimental.</li>
	<li>Manter colônias sob a mesma conditionsas descrito no ponto 1.3, até descendentes de2 F emergem. Nota: Rainha de transferência F1 e F2 prole em ninho novo em gesso maior (Figura 2, à esquerda) para manutenção a longo prazo da colônia.</li>
</ol>3. avaliação do sucesso de consanguinidade
<ol><li>Extração de DNA e genotipagem da geração parental (F0)<ol>
<li>Remover uma perna de uma rainha de0 F usando fórceps e transferir a perna para um microtubo de 1,5 mL contendo 100 µ l de agente quelante.</li>
		<li>Sob um microscópio estereoscópico, dissecar um abdômen feminino em prato de vidro preenchido com 300 µ l de água ultrapura usando fórceps e isolar a espermateca contendo o esperma dos machos acasalados.</li>
		<li>Descascar o tecido da espermateca e isolar o esperma do tecido da fêmea utilizando pinos de insetos. Nota: Para facilitar a extração de esperma da espermateca, armazenar espécimes femininos em 100% EtOH por mais de um dia antes de dissecação.</li>
		<li>Utilizando uma micropipeta, transferi o esperma em um microtubo de 1,5 mL contendo 100 µ l de agente quelante.</li>
		<li>Incubar as amostras da rainha de F0 e espermatozoides preparados na etapa 3.1.1 e 3.1.3, respectivamente, a 95 ° C por 20 min. Flash microtubo de centrifugação e armazenam a 4 ° C.</li>
		<li>Genótipo todas amostras usando o método descrito em outra parte4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extração de DNA do par de formigas usadas por cruzes de endogamia (F1)<ol>
<li>Depois de confirmar a produção de ovos pela sib acasalado rainha de F1 , extrair o DNA da rainha usando suas asas galpão ou uma perna mid e genótipo usando o mesmo método descrito na secção 3.1 acima.</li>
		<li>Extraia o macho de DNA de F1 usando uma perna e genótipo-los usando o mesmo método descrito na secção 3.1 acima. Nota: As amostras podem ser armazenadas em 100% EtOH antes de extração de DNA e DNA em agente quelante podem ser armazenado durante dois meses a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avaliação da fertilidade masculina em machos produzidos a partir de consanguinidade cruzes Nota: Machos diploides, produzidos a partir de endogamia cruzes são muitas vezes estéril.<ol>
<li>Disse órgãos reprodutivos internos em um prato de vidro com 400 µ l de solução de PBS usando fórceps.</li>
		<li>Remover o PBS e adicionar 4% paraformaldeído (PFA) utilizando uma micropipeta.</li>
		<li>Fixe o tecido incubando em PFA por 30 min à temperatura ambiente (15-25 ° C).</li>
		<li>Lave o tecido 5 vezes com 400 µ l de PBS utilizando uma micropipeta.</li>
		<li>Dilua a 4', a solução de (DAPI) 6-diamidino-2-phenylindole 1 µ g/ml em PBS.</li>
		<li>PBS de remover e adicionar aproximadamente 300 µ l desta solução diluída de coloração DAPI para tecido.</li>
		<li>Incube 15 min sob condição de escura, à temperatura ambiente (15-25 ° C).</li>
		<li>Lave o tecido 5 vezes com 400 µ l de PBS e transferir o tecido no centro do vidro de slide usando fórceps.</li>
		<li>Monte o tecido na montagem média faloidina contendo diversos TRITC-conjugados.</li>
		<li>Observe as amostras por laser confocal microscópio usando 20 X ou 63 X objectivas.</li>
		<li>Use um laser de excitação 405 nm e um detector de híbrido em 410-530 nm para a deteção de DAPI.</li>
		<li>Use um laser de excitação 561 nm e um detector de híbrido em 565-650 nm para a deteção de TRITC.</li>
		<li>Use uma velocidade de varredura de 400 Hz (400 linhas/s) com uma resolução de 1024 × 1024 pixels.</li>
		<li>Capture imagens usando uma plataforma de software.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Mable, B. K., Otto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+life+cycles+with+haploid+and+diploid+phases%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">The evolution of life cycles with haploid and diploid phases.</a> BioEssays. 20 (6), 453-462 (1998).</li>
<li>Beye, M., Hasselmann, M., Fondrk, M. K., Page, R. E., Omholt, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+csd+is+the+primary+signal+for+sexual+development+in+the+honeybee+and+encodes+an+SR-type+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The gene csd is the primary signal for sexual development in the honeybee and encodes an SR-type protein.</a> Cell. 114 (4), 419-429 (2003).</li>
<li>Hasselmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+evolutionary+nascence+of+a+novel+sex+determination+pathway+in+honeybees%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evidence for the evolutionary nascence of a novel sex determination pathway in honeybees.</a> Nature. 454 (7203), 519-522 (2008).</li>
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<li>Schmieder, S., Colinet, D., Poirié, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracing+back+the+nascence+of+a+new+sex-determination+pathway+to+the+ancestor+of+bees+and+ants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tracing back the nascence of a new sex-determination pathway to the ancestor of bees and ants.</a> Nature Communications. 3, 895(2012).</li>
<li>Miyakawa, M. O., Mikheyev, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QTL+Mapping+of+Sex+Determination+Loci+Supports+an+Ancient+Pathway+in+Ants+and+Honey+Bees%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">QTL Mapping of Sex Determination Loci Supports an Ancient Pathway in Ants and Honey Bees.</a> PLoS Genetics. 11 (11), (2015).</li>
<li>Miyakawa, M. O., Tsuchida, K., Miyakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+doublesex+gene+integrates+multi-locus+complementary+sex+determination+signals+in+the+Japanese+ant%2C+Vollenhovia+emeryi%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The doublesex gene integrates multi-locus complementary sex determination signals in the Japanese ant, Vollenhovia emeryi.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 94, 42-49 (2018).</li>
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<li>Okamoto, M., Kobayashi, K., Hasegawa, E., Ohkawara, K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/280627935_Sexual_and_asexual_reproduction_of_queens_in_a_myrmicine_ant_Vollenhovia_emeryi_Hymenoptera_Formicidae">Sexual and asexual reproduction of queens in a myrmicine ant, Vollenhovia emeryi (Hymenoptera: Formicidae).</a> Myrmecological News. 21, 13-17 (2015).</li>
<li>Schrempf, A., Aron, S., Heinze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+and+inbreeding+depression+in+an+ant+with+regular+sib-mating%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating.</a> Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).</li>
<li>De Boer, J. G., Ode, P. J., Rendahl, A. K., Vet, L. E. M., Whitfield, J. B., Heimpel, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+support+for+Multiple-locus+complementary+sex+determination+in+the+parasitoid+Cotesia+vestalis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental support for Multiple-locus complementary sex determination in the parasitoid Cotesia vestalis.</a> Genetics. 180 (3), 1525-1535 (2008).</li>
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<li>Cowan, D. P., Stahlhut, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+reproductive+diploid+and+haploid+males+in+an+inbreeding+hymenopteran+with+complementary+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functionally reproductive diploid and haploid males in an inbreeding hymenopteran with complementary sex determination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (28), 10374-10379 (2004).</li>
<li>Armitage, S., Boomsma, J., Baer, B. <a target="_blank" href="https://research.ku.dk/search/?pure=en/publications/diploid-male-production-in-a-leafcutting-ant(99b05fe3-2eef-418e-82e6-9ae940a53b2c)/export.html">Diploid male production in a leaf-cutting ant.</a> Ecological Entomology. 35 (2), 175-182 (2010).</li>
<li>Krieger, M. J. B., Ross, K. G., Chang, C. W. Y., Keller, L. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/6884600">Frequency and origin of triploidy in the fire ant Solenopsis invicta.</a> Heredity. 82, February 1998 142-150 (1999).</li>
<li>Seeley, T. D., Mikheyev, A. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00040-003-0638-8">Reproductive decisions by honey bee colonies: Tuning investment in male production in relation to success in energy acquisition.</a> Insectes Sociaux. 50 (2), 134-138 (2003).</li>
<li>Hölldobler, B., Wilson, E. O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%B6lldobler%2C+B+%22The+Ants%22">The Ants</a>. , Harvard University Press. http://www.amazon.co.uk/Ants-Bert-H?lldobler/dp/3540520929 (1990).</li>
<li>da Souza, D. J., Marques Ramos Ribeiro, M., Mello, A., Lino-Neto, J., Cotta Dângelo, R. A., Della Lucia, T. M. C. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/11250003.2010.490567">A laboratory observation of nuptial flight and mating behaviour of the parasite ant Acromyrmex ameliae (Hymenoptera: Formicidae).</a> Italian Journal of Zoology. 78 (3), 405-408 (2011).</li>
<li>Woyke, J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/257472209_What_happens_to_diploid_drone_larvae_in_a_honeybee_colony--Ibid2_73-75">What happens to diploid drone larvae in a honeybee colony.</a> Journal of Apicultural Research. 2 (2), 73-75 (1963).</li>
<li>Schmidt, A. M., Linksvayer, T. A., Boomsma, J. J., Pedersen, J. S. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2311.2011.01325.x">No benefit in diversity? The effect of genetic variation on survival and disease resistance in a polygynous social insect.</a> Ecological Entomology. 36 (6), 751-759 (2011).</li>
<li>Schrempf, a, Aron, S., Heinze, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+and+inbreeding+depression+in+an+ant+with+regular+sib-mating%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Sex determination and inbreeding depression in an ant with regular sib-mating.</a> Heredity. 97 (1), 75-80 (2006).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este artigo demonstra os protocolos que podem ser usados para induzir a endogamia cruzes e avaliar a ocorrência de endogamia na formiga V. emeryi. Nos experimentos, genotipagem dos indivíduos utilizados para cruzes é necessária para garantir que a endogamia cruzes foram bem sucedidos. No entanto, a eficácia destes testes de cruzamento é evidente como os machos diploides podem ser produzidos durante todo o ano, enquanto os machos haploides só podem ser produzidos no outono em campo e o laboratório<sup class="xref...

Eusocial himenóptera táxons, como formigas e abelhas, desenvolveram um sistema de determinação do sexo do haplodiploid em que os indivíduos que são heterozigotos na determinação do sexo complementar um ou mais loci (CSD) tornar-se fêmeas, enquanto aqueles que são homo - ou heterozigotos tornar-se machos (Figura 1A)1.
Componentes genéticos e moleculares envolvidos na cascata da determinação de sexo têm sido bem estudados na abelha, Apis mellifera, um modelo himenóptera organismo2,3,4. Investigações recentes de genómica comparativa sugerem que as formigas e as abelhas compartilham muitos homologs putativos na via da determinação de sexo, tais como o gene de determinação de sexo inicial, csd5. No entanto, evidências de conservação funcional destes homologs ainda carece de formigas.
Para resolver este problema, linhas de endogamia precisam ser desenvolvida à medida que eles são essenciais para mapeamento genético e estudos moleculares. No entanto, é difícil manter e realizar cruzamentos experimentais entre estes organismos em laboratório devido à natureza complexa dos ciclos de vida que evoluíram.
Aqui, usamos Vollenhovia emeryi como um modelo para investigar a base genética e molecular do sistema de determinação de sexo em formigas6,7. As linhas de consanguinidade desta espécie foram desenvolvidas anteriormente para mapeamento de enlace dos loci de traço quantitativos (QTL) para os traços relacionados à determinação do sexo pela primeira vez em formigas6. Além disso, a cascata da sexo-determinação molecular tem sido investigadas7. Esta espécie tem evoluído de um sistema de reprodução incomum que emprega tanto ginogênese e androgenesis (Figura 1B)8,9. A maioria das novas rainhas e machos são uma relação clonal produzidos a partir de genomas maternos e paternos, respectivamente. Além disso, os trabalhadores e algumas rainhas são produzidas sexualmente8. Este sistema de reprodução é particularmente adequado para estudos genéticos, pois as cruzes de endogamia produzidas usando sexualmente produziram rainhas e machos são geneticamente equivalentes a um cruzamento clássico. Desde rainhas sexualmente produzidas diferem morfologicamente rainhas produzidas a partir de genomas maternos10 (Figura 1B), realização e avaliação de endogamia cruzes é bastante simplificada usando esse método.
Neste artigo, os métodos para o estabelecimento de colônias de laboratório para teste de passagem, aplicação da consanguinidade cruzes usando pares de cheia-sib e avaliar o sucesso dessas cruzes usando genotipagem de membros da colônia e dissecção de prole masculina genitália é descrita no V. emeryi.
Independentemente do sistema de reprodução empregado, aplicação de consanguinidade cruzes é frequentemente o primeiro passo essencial em qualquer investigação de sistemas de determinação do sexo na Hymenoptera. Por exemplo em Cardiocondyla obscurior, a quase total ausência de machos diploides após 10 gerações de acasalamento no laboratório completo-sib demonstra ausência de CSD locus11. É possível prever o número de loci CSD da proporção de machos produzidos em consanguinidade cruzes6,12,13.

<table><tbody><tr><td>Pó de gesso</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Carvão, Ativado, Pó</td><td>Wako</td><td>033-02117,037-02115</td><td></td></tr><tr><td>Vidro deslizante</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Dieta de grilo seco</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Marrom shuger&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Estojo Quadrado de Estireno</td><td>COMO UM</td><td>Qualquer tamanho</td> O <td>tamanho varia de acordo com o número de formigas</td></tr><tr><td>Incbator</td><td></td><td></td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Banho de bloco de alumínio Unidade térmica seca DTU-1B</td><td>TAITEC</td><td>0014035-000</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL Hyper Microtube, Clear, Fundo redondo</td><td>WATSON</td><td>131-715CS</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (99.5)</td> Microscópio estereoscópico <td>Wako</td><td>054-07225</td><td></td></tr><tr><td></td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Qualquer marca pode ser usada</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>DUMONT</td><td>0108-5-PO</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 forma de sódio</td><td>SIGMA</td><td>11139-85-8</td><td></td></tr><tr><td>Tampão de fosfato salino (PBS) comprimidos, pH7.4</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Wako</td><td>162-16065</td><td></td></tr><tr><td>-Cellstain- Solução DAPI</td><td>Dojindo Molecular Technologies</td><td>D523</td><td></td></tr><tr><td>ABI 3100xl Analisador Genético</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Entre em contato diretamente com o construtor para obter mais informações.</td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td></td><td>Entre em contato diretamente com o construtor para obter mais informações.</td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 20x/0.75 IMM</td><td>Leica</td><td></td><td>Entre em contato diretamente com o construtor para obter mais informações.</td></tr><tr><td>HC PL APO CS2 63x/1.20 ÁGUA</td><td>Leica</td><td></td><td>Entre em contato diretamente com o construtor para obter mais informações.</td></tr><tr><td>Leica HyDTM</td><td>Leica</td><td></td><td>Entre em contato diretamente com o construtor para obter mais informações.</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica</td><td></td><td>Entre em contato diretamente com o construtor para obter mais informações.</td></tr></tbody></table>

indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o ant, vollenhovia emeryi

Induction and Evaluation of Inbreeding Crosses Using the Ant, Vollenhovia Emeryi

Os componentes genéticos e moleculares da cascata determinação do sexo têm sido muito estudados na abelha, Apis mellifera, um organismo modelo himenóptera. No entanto, pouco é conhecido sobre os mecanismos de determinação do sexo encontrados em outros táxons himenóptera não do modelo, tais como formigas. Devido à natureza complexa dos ciclos de vida que evoluíram em espécies himenóptera, é difícil manter e realizar cruzamentos experimentais entre estes organismos em laboratório. Aqui, descrevemos os métodos para a realização de cruzamentos de endogamia e para avaliar o sucesso dessas cruzes em formiga Vollenhovia emeryi. Induzindo a consanguinidade no laboratório usando V. emeryi, é relativamente simples devido a única biologia das espécies. Especificamente, esta espécie produz machos de alopecia, e femininos reproductives exibem polimorfismo de asa, que simplifica a identificação dos fenótipos em cruzamentos genéticos. Além disso, avaliar o sucesso da endogamia é simples, como os machos podem ser produzidos continuamente por consanguinidade cruzes, enquanto os machos normais aparecem apenas durante uma temporada reprodutiva bem definida no campo. Nosso protocolo permitem usando V. emeryi como um modelo para investigar a base genética e molecular do sistema de determinação de sexo em espécies de formigas.

Resultados da análise de microssatélites usando F0 e F1 gerações mostraram que a consanguinidade cruzes foram produzidas com sucesso (Figura 4)6. Como resultado de cruzamentos de consanguinidade, rainhas acasaladas foram obtidas dentro de um mês de estabelecer colônias cruzamento experimental. Um quarto (27,1 ± 8,91% SD) de todos os descendentes (F2) de cruzamentos a endogamia era do sexo masculino, enq...

Neste protocolo, métodos para a realização de cruzamentos de consanguinidade e para avaliar o sucesso dessas cruzes, são descritos para a formiga Vollenhovia emeryi. Estes protocolos são importantes para as experiências que visa compreender a base genética dos sistemas de determinação do sexo em Hymenoptera.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

The genetic and molecular components of the sex-determination cascade have been extensively studied in the honeybee, Apis mellifera, a hymenopteran model ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na biologia molecular e esferas genéticas de Hymenoptera, como sistemas de determinação sexual. A principal vantagem dessa técnica é que podemos facilmente induzir linhas de endogamia sobre a formiga Vollenhovia Emery, que são essenciais para o mapeamento genético e o estado molecular. Assim, esta missão pode fornecer informações sobre o sistema de determinação sexual de uma formiga específica e também pode ser aplicada a outras formigas e outras espécies de Hymenoptera, como vespas.Para começar o protocolo, colete colônias V.Emeryi durante o início do verão. Transfira os espécimes de formigas dos ramos coletados para um ninho de gesso artificial com uma tampa de vidro, usando um aspirador. Mantenha as colônias no ninho artificial a 25 graus C, sob um ciclo claro-escuro de 16 a 8 horas.Forneça água da torneira com uma garrafa de lavagem para manter o gesso úmido dia sim, dia não, ao mesmo tempo. Em seguida, adicione cerca de 100 microgramas de pó de críquete seco embrulhados em papel alumínio e uma ponta cheia de água de açúcar mascavo para a colônia, usando uma ponta de 20 microliter a cada dois dias até que novas formigas reprodutivas surjam. É importante coletar micro colônias dos campos e fornecer-lhes comida suficiente para ganhar novas rainhas e machos.Primeiro, impedir que os indivíduos se movam colocando colônias em uma sala com um ambiente controlado definido em quatro graus Celsius por 15 minutos. Remova as pernas médias de 30 formigas operárias usando fórceps sob um estereoscópio para distinguir a geração F-zero dos trabalhadores produzidos em cruzes de endogamia subsequentes. Em seguida, transfira as formigas para um novo ninho de gesso menor para cruzes de endogamia.Em seguida, adicione três a quatro larvas ou pub em um ninho de gesso contendo trabalhadores. Transfira uma rainha de asas longas e um macho para um ninho de gesso previamente preparado para cruzes de endogamia. Para esta etapa, é importante manter colônia de travessia experimental no mesmo estado que a de uma colônia normal.É difícil induzir a endogamia apenas colocando machos e fêmeas juntos. Mantenha as colônias a 25 graus Celsius sob uma luz de 16 a oito horas, ciclo escuro com comida e água fornecidas até que a rainha perca suas asas e coloque ovos. Verifique a colônia experimental todos os dias sob um microscópio estéreo.Após a configuração das cruzes de endogamia entre a prole F-1, os ovos podem ser observados sob um estereoscópio. Depois que a rainha F-1 começar a colocar ovos, remova os machos F-um e larvas ou pube do ninho para evitar que a geração F-um e a geração F-dois se misturem. Mantenha as colônias sob as mesmas condições até que os F-dois prole emerjam.Remova uma perna de uma rainha F-zero usando fórceps. Transfira a perna para um micro tubo de 1,5 mililitro contendo 100 microliters de um agente de refrigeração. Sob um estereoscópio disseque um abdômen feminino em um prato de vidro cheio com 300 microlitros de água ultra pura usando fórceps.Desmempilar a espermatozástica contendo o esperma de machos acasalados. Retire o tecido da espermatica e isole o esperma do tecido da fêmea usando alfinetes de insetos. Usando uma micro torta, transfira o esperma para um micro tubo de 1,5 mililitro contendo 100 microliters de um agente de frio.Incubar as amostras da rainha F-zero e esperma a 95 graus Celsius por 20 minutos. Flash centro fundir o micro tubo e armazenar as amostras a quatro graus Celsius. Depois de confirmar a produção de ovos pela rainha F-1, extraia o DNA da rainha usando as asas do galpão ou uma perna média e genótipo.Em seguida, extrair o DNA de um f-um macho por genotipagem de uma perna. Para avaliar a fertilidade das formigas machos das cruzes de endogamia, disseque órgãos reprodutivos internos em uma antena de vidro com 400 microliters de solução PBS usando fórceps. Em seguida, remova o PBS e substitua-o por 4% de paraformalído usando uma micro torta.Fixar o tecido incubando as amostras em PFA por quarenta minutos em temperatura ambiente. Após a fixação, lave os tecidos cinco vezes com 400 microliters de PBS usando uma micro torta. Diluir a solução DAPI para um miligrama por mililitro em PBS.Remova o PBS e adicione aproximadamente 300 microliters da solução de coloração DAPI diluída ao tecido. Incubar o tecido por 15 minutos em condições escuras a temperatura ambiente. Após a incubação, lave o tecido cinco vezes com 400 microliters de PBS e transfira o tecido para o centro de uma lâmina de vidro usando fórceps.Em seguida, monte o tecido no meio de montagem contendo tetrametilarhodamina TRITC. Por fim, observe as amostras com um microscópio de varredura a laser confocal usando as lentes objetivas de 20 ou 60 3x. Imagens microscópicas de testículos de Haploid macho v Emeryi mostram tecido fibroso saudável ou espermatozoides que estão ausentes em Diploid macho v Emeryi, que não mostrou tecido fibroso saudável.Os órgãos reprodutivos masculinos de Diploid macho v Emeryi não produziram esperma e seus testículos não se desenvolveram, sugerindo que os machos produzidos em cruzes endogamias são estéreis. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu o caminho para explorarmos a miatony sexual em uma constante em Vollenhovia Emeryi para as espécies de formigas de tempo rápido.

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Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Indução neural é o primeiro passo na formação do cérebro. É um mecanismo pelo qual o nó de Hensen (organizador), instrui tecido adjacente a adotar um destino neural, ou seja, dar origem ao sistema nervoso. Este vídeo demonstra um ensaio para a indução neural no embrião de galinha.

Ensaio para Indução Neural no embrião de galinha

Nós desenvolvemos uma metodologia para a realização de cruzes em Setaria viridis (S. viridis). O método envolve a poda da panícula antes de um tratamento com água quente para matar pólen viável. Cruzes são executadas seguindo um regime de crescimento bem controlada e tipicamente resulta na recuperação de 1 a 7, a polinização cruzada de sementes / s por panícula.

Métodos para a realização Cruzes em<em&gt; Setaria viridis</em&gt;, Um novo sistema de modelo para as gramíneas

Diferencial esperma capacidade competitiva...

Avaliar as diferenças na capacidade competitiva do esperma em<em&gt; Drosophila</em

Sprays de fungicida em plantas de floração podem expor abelhas solitárias para altas concentrações de resíduos do fungicida transmitidas pelo pólen. Usando experimentos baseados em laboratório, envolvendo-se em vitro-larvas de abelha criados, este estudo investiga os efeitos interativos de consumir pólen tratada com fungicida derivado de host e host não plantas.

In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval

Este protocolo é projetado avaliar a viabilidade de Drosophila em cada estágio desenvolvente, do embrião ao adulto. O método pode ser utilizado para determinar e comparar a viabilidade de diferentes genótipos ou condições de crescimento.

Um método direto e simples para avaliar a viabilidade da Drosophila melanogasterdo embrião ao adulto

Apresentamos uma metodologia para estabelecer os requisitos de polinização das cultivares de damasco(Prunus armeniaca L.) combinando a determinação da auto-(in)compatibilidade por microscopia de fluorescência com a identificação do S-genótipo pela análise pcr.

Determinação das Relações de Auto e Inter-(in)compatibilidade em Damasco combinando polinização manual, microscopia e análises genéticas

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar a competitividade do Aedes aegypti masculino utilizando corante fluorescente como marcador. Mosquitos fêmeas são expostos a machos marcados e não marcados para cópula. Após o acasalamento, seus espermatozoides são examinados sob um microscópio de fluorescência para determinar seu parceiro de acasalamento.

Usando o Corante Fluorescente, Rhodamine B, para estudar competitividade do acasalamento em mosquitos Aedes aegypti masculinos

Aqui, apresentamos um método geral para determinar a viabilidade embrionária e o número total de embriões produzidos (ninhada) usando o organismo modelo C. elegans.

Mensuração da Viabilidade Embrionária e do Tamanho da Ninhada em Caenorhabditis elegans

Este estudo avaliou as atividades biológicas de extratos de Tithonia diversifolia usando métodos baseados em radicais e um ensaio de eclosão de ovos in vitro (EHA) para avaliar seus efeitos sobre nematóides gastrointestinais em pequenos ruminantes. A metodologia e os principais achados são descritos, destacando o potencial desses extratos para o controle de parasitas.

Avaliação das propriedades antioxidantes e anti-helmínticas de extratos de Tithonia diversifolia contra ovos de nematóides gastrointestinais usando ensaios in vitro

Este protocolo fornece um método para medir as frequências de cruzamento e distribuição durante a meiose em Caenorhabditis elegans. A genotipagem do polimorfismo de nucleotídeo único com PCR em tempo real foi usada para determinar a origem dos cromossomos. O mapeamento de 4 pontos permitiu determinar as distribuições cruzadas das regiões do braço esquerdo, centro e braço direito de cada cromossomo. ...

Frequência e distribuição de cruzamentos na meiose de Caenorhabditis elegans por genotipagem de SNP usando PCR em tempo real

Aprenda a induzir e avaliar cruzes de endogamia em formigas Vollenhovia emeryi para estudos genéticos de determinação de sexo. Este protocolo permite mapeamento genético e análises moleculares em himenópteros.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

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