Methionine Funcionalizou o bloco biocompatible copolímeros para a entrega alvejada do ADN do plasmid
6 de agosto de 2019
Este trabalho apresenta a preparação de copolímeros de blocos biocompatíveis (mBG) funcionalizados com metionina através do método de transferência reversível da cadeia de fragmentação de adição (RAFT). A habilidade complexantes do DNA do plasmídeo do MBG obtido e sua eficiência do transfection foram investigadas igualmente. O método da JANGADA é muito benéfico para os monómeros de polimerização que contêm grupos funcionais especiais.
Os portadores de drogas de polímero cationic têm as vantagens de boa estabilidade, baixa imunogenicidade e preparação e modificação fáceis. Aqui, oferecemos um método rápido e simples para sua síntese. O método de polimerização da cadeia de transferência de adição reversível é um método aplicável para produzir polímeros de bloco com peso molecular controlado e estrutura e carregando grupos funcionais.
Esses portadores de drogas podem transportar simultaneamente diferentes drogas para alcançar o tratamento colaboratório do câncer, inflamação e outras doenças. A polimerização IFT é um método clássico, e este protocolo dá um exemplo de sua aplicação na terapia genética. A chave para o sucesso para a síntese deste polímero é controlar precisamente a temperatura de reação.
É mais aconselhável usar um banho de óleo do que um banho de água. Para iniciar este procedimento, obtenha um frasco de fundo redondo com uma rolha de borracha e um agitador magnético para ser usado como garrafa de polimerização. Dissolva 1,87 gramas de bis-hidroxi HEMA em um mililitro de água destilada na garrafa de polimerização.
Em um béquer de cinco mililitros, dissolva 0,03 gramas de CTP e 0,02 gramas de ACVA em 0,5 mililitros de 1, 4-dioxano. Adicione essa mistura à garrafa de polimerização. Em seguida, use uma armadilha de condensado para congelar a solução na garrafa de polimerização.
Fixar a garrafa no suporte de ferro, e use um conduíte tropeçado com uma agulha para aspirar e injetar nitrogênio na mistura de reação. Em seguida, sele a garrafa de polimerização e descongele a solução à temperatura ambiente por 30 minutos. Repita este ciclo de congelamento da bomba três vezes.
Depois disso, coloque a garrafa em um banho de óleo a 70 graus Celsius e deixe a solução reagir por 24 horas sob a atmosfera de nitrogênio. No dia seguinte, esfrie a garrafa de polimerização a zero graus Celsius e abra a rolha de borracha para terminar a reação de polimerização. Em seguida, acetona pré-doença em uma geladeira a 20 graus Celsius negativos por duas horas, e misture-a com a solução de reação na garrafa de polimerização a uma proporção de 50 para um.
Centrifugar esta mistura a 8.200 vezes g por 10 minutos para remover a acetona e coletar o precipitado. Para purificar o HEMA poli-hidroxy sintetizado, dissolva o precipitado coletado em dois mililitros de água pura. Em seguida, misture-o com 100 mililitros de acetona pré-identificada em uma proporção de um a 50.
Centrifugar a solução a 8.200 vezes g por 10 minutos para coletar o precipitado. Repita este processo de purificação de dissolver, misturar e centrifugar o precipitado três vezes. Primeiro, dissolver 0,96 gramas de APMA e 0,93 gramas do purificado poly bis-hidroxy HEMA em cinco mililitros de água destilada em um béquer de 10 mililitros.
Dissolva 0,01 gramas de ACVA em 0,5 mililitros de 1, 4 dioxano, e adicione isso à solução APMA e poly bis-hidroxy HEMA. Transfira essa mistura para uma garrafa de polimerização e ventile com nitrogênio seco por uma hora. Em seguida, coloque a garrafa de polimerização em um banho de óleo a 70 graus Celsius, e deixe-a reagir por 24 horas sob a atmosfera de nitrogênio.
No dia seguinte, esfrie a garrafa de polimerização a zero graus Celsius e abra a rolha de borracha para terminar a solução do processo de polimerização. Para começar, as células de sementes MCF-7 nos poços de uma placa de seis poços a uma densidade de 20.000 células por poço. Cultue as células em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 12 horas.
Depois disso, substitua o meio de cultura por meio de cultura fresca contendo polímeros cônicos e poliplex pDNA de diferentes proporções de relações nitrogênio-fósforo. Cultue as células por seis horas e, em seguida, substitua o meio por dois mililitros de meio RPMI 1640 fresco. Continue a culminar por 48 horas.
Em seguida, colete as células e use um citômetro de fluxo para detectar a fluorescência verde. Neste estudo, copolímeros de blocos biocompatíveis biocompatíveis de methionina são preparados através do método reversível de transferência da cadeia de adição e fragmentação, e a capacidade de complexo de DNA plasmídeo do mBG obtido e sua eficiência de transfecção são investigadas. O tamanho médio das partículas e o potencial zeta dos poliplexes mBG/pDNA são de 124 nanômetros e mais 15,7 milivolts, respectivamente, em uma relação N-para-P de 16.
O retardo eletroforético revela que pDNA com uma relação N-para-P de zero pode mover-se sem contenção no gel de agarose e é observado como uma listra no imager gel. Quando o pDNA é complexo com mBG, o movimento do pDNA é retardado e, posteriormente, o brilho da banda é reduzido. Isso mostra que o mBG pode complexo completamente o pDNA quando o N a P é maior que quatro.
A citotoxicidade dos poliplexes mBG/pDNA é então medida usando o ensaio padrão MTT Estes resultados mostram que os poliplexes mBG/pDNA têm citotoxicidade superior aos poliplexes PEI/pDNA nas proporções N-to-P de quatro, oito, 16 e 32. Como também pode ser visto, a citotoxicidade dos poliplexes mBG/pDNA aumenta com o aumento da relação N-para-P. Este aumento da citotoxicidade é resultado do componente GPMA carregado positivamente.
A razão N-para-P utilizada no experimento de transfecção pDNA é selecionada de acordo com os resultados da citotoxicidade. As habilidades de transfecção de mBG1, mBG2 e mBG3 são comparadas medindo a intensidade de fluorescência GFP, e os resultados mostraram que o mBG3 é o portador do gene ideal. É importante esgotar o ar do frasco de fundo redondo e manter a temperatura de reação.
Os portadores de medicamentos polímeros obtidos podem ser aplicados à co-entrega de medicamentos quimioterápicos e medicamentos genéticos para tratar sinergicamente câncer resistente a medicamentos. O mecanismo molecular de combinação de drogas genéticas e quimioterapia pode ser ainda mais explorado para o tratamento de tumores resistentes a medicamentos. A acetona é classificada como baixa tóxica por sua toxicidade aguda.
As chaves, a inalação ou o contato com os olhos ou a pele devem ser evitados. Evite o risco de queimaduras durante o procedimento de aquecimento.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método rápido e simples para a síntese de carreadores poliméricos catiônicos de fármacos utilizando o método de polimerização por transferência de cadeia por adição-fragmentação reversível (RAFT). Os copolímeros em bloco biocompatíveis funcionalizados com metionina (mBG) sintetizados foram avaliados quanto à sua capacidade de complexar DNA plasmidial e sua eficiência de transfeção.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Química de Polímeros
- Terapia Gênica
- Sistemas de Liberação de Fármacos
Contexto
- Os transportadores catiônicos de fármacos baseados em polímeros oferecem estabilidade e baixa imunogenicidade.
- A polimerização RAFT permite controle preciso do peso molecular e da estrutura.
- Esses transportadores podem carregar múltiplos fármacos para tratamento colaborativo.
- O controle preciso da temperatura da reação é crucial para uma síntese bem-sucedida.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método para a síntese de copolímeros em bloco biocompatíveis.
- Investigar a capacidade dos polímeros sintetizados de formar complexos com DNA.
- Avaliar a eficiência de transfeção dos vetores terapêuticos.
Métodos Utilizados
- Polimerização por transferência de cadeia por adição-fragmentação reversível (RAFT).
- Síntese de copolímeros em bloco funcionalizados com metionina.
- Avaliação da capacidade de complexação de DNA plasmidial.
- Avaliação da eficiência de transfeção.
Resultados Principais
- O mBG sintetizado demonstrou complexação eficaz de DNA plasmidial.
- A eficiência de transfeção foi avaliada com sucesso.
- A polimerização RAFT mostrou-se benéfica para a síntese de polímeros funcionalizados.
- O método permite a entrega simultânea de múltiplas drogas.
Conclusões
- O estudo desenvolveu com sucesso um método para a síntese de mBG.
- Esses polímeros biocompatíveis mostram potencial para aplicações em terapia gênica.
- Pesquisas futuras poderiam aumentar sua eficácia na entrega de fármacos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este trabalho apresenta um método baseado na polimerização RAFT para a síntese de copolímeros em bloco biocompatíveis funcionalizados com metionina, capazes de complexar DNA plasmidial, oferecendo uma plataforma ajustável para o desenvolvimento de vetores de entrega gênica. A capacidade de controlar o peso molecular, a razão de cargas e o tamanho das partículas permite o design preditivo de transportadores não virais com citotoxicidade reduzida em comparação ao PEI, apoiando a redução de riscos em estágios iniciais de terapias com ácidos nucleicos. Tais sistemas atendem à necessidade de síntese polimérica escalonável e reprodutível em fluxos de trabalho de descoberta pré-clínica, onde a clareza mecanicista e a consistência da formulação influenciam decisões de continuidade ou interrupção.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação das interações entre polímeros e DNA por meio da complexação quantificável em razões N/P definidas, apoiando a validação de alvos por meio de entrega gênica controlada.
- Valor Operacional: Oferece uma rota de síntese reprodutível para copolímeros em bloco catiônicos com funcionalização ajustável de metionina e guanidina, reduzindo a variabilidade em ensaios de triagem iniciais.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera poliexos bem definidos com potencial zeta mensurável (+15,7 mV em N/P 16) e tamanho (124 nm), permitindo avaliação padronizada da eficiência de transfeção e citotoxicidade.
- Valor Operacional: Facilita a triagem em alto rendimento de variantes de polímeros (mBG1, mBG2, mBG3) ao associar o teor de APMA (21%, 37%, 52%) aos resultados funcionais em ensaios de transferência gênica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Demonstra a retardo completo do DNA plasmidial em N/P >4, indicando proteção confiável da carga — um marco pré-clínico essencial para a estabilidade do vetor.
- Valor Operacional: Permite a triagem de formulações em diferentes razões N/P (8, 16, 4) para identificar condições ideais de transfeção, ao mesmo tempo em que monitora tendências de citotoxicidade associadas ao teor de GPMA.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método insere-se na continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir a síntese de vetores gênicos definidos para a identificação de compostos promissores na entrega de ácidos nucleicos, em que as relações estrutura-função dos polímeros orientam as decisões de avanço.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a entrega gênica mediada por polímeros ao fornecer resultados quantificáveis (tamanho das partículas, potencial zeta, eficiência de transfeção) para correlacionar estrutura com atividade biológica.
- Triagem: Permite a produção de poliplexos prontos para ensaio com tamanho consistente (100–200 nm na razão N/P 16–32) e carga superficial, melhorando a reprodutibilidade entre campanhas de avaliação de compostos.
- Análises: Gera respostas biofísicas mensuráveis (razão N/P, potencial zeta, retardo eletroforético) que permitem análise comparativa de variantes poliméricas em condições padronizadas.
- Pesquisa Translacional: Conecta o design do polímero à relevância pré-clínica por meio da comprovação da complexação de pDNA e da redução da citotoxicidade em relação ao PEI, apoiando o avanço com ajuste de risco.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma plataforma modular baseada em RAFT adaptável a outros aminoácidos funcionais ou terapêuticos, promovendo padronização entre projetos na síntese de polímeros.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva no desempenho do vetor genético ao associar o design molecular (teor de metionina/guanidina) aos resultados de ligação ao DNA e transfeção.
- Valor Operacional: Oferece um protocolo de síntese escalonável e favorável à purificação, utilizando precipitação com acetona e controle por RAFT, melhorando a consistência entre lotes.
- Valor Estratégico: Reduz o risco biológico em estágios avançados ao fornecer uma alternativa com menor citotoxicidade em comparação ao PEI, permitindo decisões mais assertivas sobre continuidade ou interrupção no desenvolvimento de terapias com ácidos nucleicos.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de polímeros candidatos (por exemplo, mBG3 como vetor ideal) com base na eficiência de transfeção e perfis de segurança.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em polimerização RAFT, incluindo desgaseificação por congelamento-bombeamento-decongelamento e manipulação sob atmosfera inerte.
- Depende de controle preciso de temperatura (banho de óleo a 70 °C) e reagentes especializados (ACVA, CTP) para a síntese reprodutível de copolímeros em bloco.
- Requer infraestrutura analítica para GPC, potencial zeta, determinação de tamanho de partículas e ensaios de transfeção baseados em fluorescência para avaliar o desempenho dos poliex.
- A adaptação a outras linhagens celulares ou cargas pode exigir reotimização da razão N/P e avaliação de citotoxicidade devido aos efeitos variáveis mediados por GPMA.
- As limitações práticas incluem a necessidade de purificação em múltiplas etapas e a sensibilidade ao oxigênio durante a polimerização, o que deve ser mitigado por meio de protocolos rigorosos de desgaseificação.
