Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

A imunofluorescência é um método básico que pode ajudar a responder perguntas-chave no campo adrenal sobre zonação adrenal, identidade celular e função. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo de múltiplas proteínas, preservando a morfologia do tecido adrenal. Para remover a glândula suprarrenal murina, corte ao redor do tecido adiposo circundante e coloque a glândula em um poço de uma placa de 24 multiwell contendo PBS fresco no gelo.

Transfira a glândula para uma placa de Petri ou suporte de vidro sob um microscópio dissecando e use duas agulhas de calibre 25 para remover o tecido de gordura adjacente. Quando toda a gordura tiver sido removida, fixe o tecido em 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius com balanço por duas horas. No final da incubação, enxágue a glândula com três lavagens de 15 minutos a quatro graus Celsius em um a dois mililitros de PBS fresco por lavagem.

Após a última lavagem, desidratar a glândula em duas imersões sequenciais de etanol a quatro graus Celsius com balanço por duas horas por incubação. Para preparar o tecido adrenal para processamento, enrole a glândula em gaze e inclua a adrenal em um de incorporação de tecido. Em seguida, coloque o em um frasco cheio de 70% de etanol para quatro graus Celsius de armazenamento até o processamento.

Para processar o tecido, insira o no processador de tecido para processamento conforme indicado na tabela. No final do programa, transfira o para uma estação de incorporação cheia de parafina derretida de 65 graus e use um par de fórceps para desembrulhar a gaze. Transfira suavemente o adrenal na posição apropriada no centro da base do molde de incorporação e despeje a parafina derretida sobre a glândula.

Em seguida, mova cuidadosamente o molde de incorporação para uma bandeja de resfriamento para facilitar o endurecimento da parafina. Antes de se seccionar por microtome rotativo, rotule uma série de slides de microscópio e coloque os slides em um aquecedor de slides de 37 graus Celsius. Distribua cerca de 450 microlitros de água ultra pura autoclaved tipo um em cada lâmina e coloque a espessura de corte da seção do microtómetro para cinco micrômetros.

Carregue o tecido incorporado no bloco de corte e baixe o bloco de parafina até que a amostra esteja no nível facial com a borda da lâmina de microtome. Girando a roda da mão com um ritmo constante, realize um corte inicial para remover a parafina e exponha o tecido adrenal. Em seguida, adquira cinco seções de micrômetros até o final da glândula suprarrenal usando fórceps para transferir cada seção para a gotícula de água para um dos slides pré-rotulados à medida que é coletado.

Depois de confirmar a presença de tecido nas seções por microscopia, seque as lâminas na placa quente por cerca de duas horas e assá-las pelo menos durante a noite em uma bandeja de slides a 37 graus Celsius até que não haja mais água visível. Uma vez seco, armazene os slides em uma caixa de slides à temperatura ambiente. Para a recuperação de antígeno de imunofluorescência, desenfisem os slides com duas imersões de 100% xileno de cinco minutos, seguidas de reidratação em uma série descendente de etanol e imersão em água.

Após a imersão na água, transfira os slides para um suporte de lâmina metálica e coloque o suporte em um béquer de citrato molar de 0,01 em uma placa quente por 10 minutos. No final da incubação, retire o béquer da placa quente e deixe esfriar por 20 minutos, tomando cuidado para que todas as seções suprarrenais ainda estejam cobertas com tampão. Quando o béquer for resfriado, transfira os slides para um frasco de Coplin por três lavagens de 10 minutos em PBS fresco com balanço suave.

Após a última lavagem, limpe cuidadosamente a superfície de cada lâmina sem danificar as seções teciduais e use um marcador hidrofóbico para fazer um círculo em torno de cada seção. Coloque os slides em uma câmara umidificada e adicione rapidamente pelo menos 50 microliters de solução de bloqueio a cada seção para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. No final da incubação de bloqueio, lave os slides três vezes em PBS fresco por cinco minutos por lavagem com balanço e devolva slides para a câmara.

Em seguida, adicione o coquetel de anticorpos primário de interesse a cada seção para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave as amostras com três lavagens de 15 minutos em PBS fresco por lavagem e rotule os slides com a solução de anticorpos secundários apropriada por uma hora protegida da luz. No final da incubação, lave as amostras com três lavagens de 15 minutos em um roqueiro protegido da luz, rotulando os núcleos das seções com DAPI por sete minutos à temperatura ambiente protegidos da luz após a última lavagem.

Depois de três lavagens PBS de cinco minutos com balanço, adicione 60 microliters de agente de montagem adequado para imunofluorescência ao longo da superfície de um copo de cobertura por amostra e pressione levemente cada seção de tecido deslizante para baixo em um vidro de cobertura, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, coloque cada slide plano em um recipiente escuro para curar à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas antes da imagem. Durante o processo de remoção de gordura, é fundamental não deixar a glândula suprarrenal secar, pois a desidratação pode danificar a estrutura tecidual.

Após uma remoção bem sucedida do tecido adiposo circundante, a glândula suprarrenal deve ser facilmente detectável sem gordura visível extra. A imunostaining de seções de glândula suprarrenais como demonstrado revela fator esteroide nuclear uma coloração das células adrenocorticas, coloração de hidroxilase de tyrosina das células medulares, coloração da DAPI dos núcleos de células não esteroides da cápsula externa, e co-coloração com células adrenocorticas e medulares. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as suprarrenais do rato são pequenas e que suas posições são um pouco variáveis dificultando sua detecção.

Portanto, é fundamental ter uma visão clara da área durante a dissecação. Esses procedimentos são técnicas básicas para o estudo da glândula suprarrenal in vivo. Após estes, métodos adicionais de imunossuagem podem ser realizados para atender às necessidades científicas específicas.

Após seu desenvolvimento, a imunossuagem abriu caminho para pesquisadores das áreas de ciência biomédica explorarem a expressão proteica in situ, uma ferramenta útil em muitas disciplinas e campos.