Name: Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprenda a isolar, fixar e realizar imunofluorescência em glândulas supra-renais de camundongo. Esta técnica preserva a morfologia tecidual e permite estudar múltiplas proteínas simultaneamente para investigar zonação adrenal e identidade celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos o Dr. Mohamad Zubair por suas sugestões úteis e assistência técnica no estabelecimento do presente protocolo. Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e digestivo e doenças renais, institutos nacionais de saúde Research Grant 2R01-DK062027 (de Games).

Todos os métodos foram realizados em conformidade com protocolos institucionalmente aprovados sob o auspício da Comissão Universidade do uso e cuidar dos animais da Universidade de Michigan.
1. preparação para a cirurgia
<ol><li>No dia antes da cirurgia, preparar paraformaldeído 4% (PFA) / tampão fosfato salino (PBS). No caso de alíquotas congeladas, prossiga para descongelar um e armazenar a 4 ° C. Nota: 4% PFA não é estável por mais de 48 h. Cuidado: PFA é tóxico, evitar contato com pele e olhos e descarte em um recipiente apropriado.</li>
	<li>No dia da cirurgia, preparar os instrumentos cirúrgicos por esterilizar a tesoura e pinça com 70% de etanol (EtOH) e deixe-os secar sobre uma toalha de papel.</li>
	<li>Lugar cheio de uma placa de 24 com PBS 1x (1 mL/poço é suficiente) em um balde de gelo. Nota: As glândulas supra-renais serão mantidas neste prato de cultura multi bem após a cirurgia.</li>
</ol>2. adrenal dissecação
<ol><li>Eutanásia o mouse seguindo protocolos padrão aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC). Um método secundário de eutanásia para garantir a morte (por exemplo, decapitação) é necessário.<ol>
<li>Para eutanásia por overdose de isoflurano, coloque o mouse em uma câmara cheia de isoflurano vapores até que cesse a respiração e, em seguida, remover o mouse da câmara, coloque-o sobre uma superfície e realizar deslocamento cervical. Nota: a maioria dos métodos de eutanásia causar desconforto ao animal e não são adequados para estudos de stress, porque eles podem adicionar a variável de confundimento da ativação do eixo hipófise-adrenal e liberação de catecolaminas medulares. Nesta instância, decapitação é a técnica sugerida para adotar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque o mouse em decúbito dorsal, esterilizar a área de incisão no abdômen e flancos com 70% EtOH. Nota: Enquanto raspar o pelo irá aumentar a esterilidade, para esta aplicação específica não é necessário.</li>
	<li>Cortar a pele no meio do abdômen, usando uma tesoura, separar a pele do peritônio, mesa o mouse por beliscar a pele em volta do corte e puxando-o em duas direções opostas (caudal e rostral). Em seguida, corte o peritônio até atingir os flancos direito e esquerdos posteriores.</li>
	<li>Remover o corte de murino glândula adrenal em torno do tecido adiposo circundante e colocá-lo na placa 24-multiwell repleto de 1X PBS e mantidos no gelo.</li>
</ol>3. remoção de gordura Peri-adrenal
<ol><li>Sob um microscópio de dissecação, coloque a adrenal em um vidro base ou um prato de Petri na placa de palco, posicione a fonte de luz, selecione a ampliação e ajustar o foco para obter uma visão clara da adrenal todo. Nota: A ampliação usada pode variar dependendo das preferências pessoais. Uma ampliação total de 30 X com uma lente plano 1 X, zoom 3x, e ocular 10x permite para visualizar a glândula inteira com um bom campo de visão.</li>
	<li>Remova rapidamente o adiposo adjacente com duas agulhas de 25 G, evitando a desidratação da adrenal. Se isso acontecer, antes de toda a gordura é removida, mover a adrenal volta dentro do poço contendo 1X PBS por 1 – 2 min e depois continuar com o processo de remoção de gordura.</li>
	<li>Lave 2x por 2 min cada em 1X PBS.</li>
</ol>4. tecido processamento e incorporação
<ol><li>Corrigir os tecidos em 4% PFA/PBS a 4 ° C em uma plataforma oscilante para 2h.</li>
	<li>Remova os 4% PFA e lave os tecidos com PBS 1x, 3x por 15 min a 4 ° C. Cuidado: PFA é tóxico e é um resíduos perigosos; deve ser manuseado com cuidado, sob uma capa de química e descartado em um recipiente de resíduos perigosos.</li>
	<li>Incubar as supra-renais em 50% EtOH a 4 ° C em uma plataforma oscilante para 2h.</li>
	<li>Incubar as supra-renais em 70% EtOH a 4 ° C em uma plataforma oscilante para um mínimo de 2 h. Nota: Se não prosseguir com o tecido para a incorporação de processamento, as glândulas supra-renais podem ser armazenadas em 70% EtOH a 4 ° C. Evitando o armazenamento a longo prazo em 70% EtOH e prosseguir para tecido logo que possível processamento produz amostras de melhor qualidade.</li>
	<li>Prepare a adrenal para processamento por envolvê-lo em gaze e delimitador-lo em um tecido incorporação fita de tecido. Coloque a fita em um frasco enchido com 70% EtOH e loja a 4 ° C até que esteja pronto para passar para o processador de tecido. Insira a fita para o processador de tecido programado conforme relatado na tabela 1 e executar o programa.</li>
	<li>Transferir a fita em uma estação de encastre cheia de parafina derretida a 65 ° C. Se não houver uma estação de resfriamento, coloque uma bandeja de refrigeração fria ao lado dele.</li>
	<li>Rotular um molde de encastre e abra o tecido incorporação de gaveta. Usando um par de pinças, Desembrulhe a gaze e coloque as supra-renais suavemente na posição desejada no centro da base no molde incorporação. Despeje a parafina derretida sobre as supra-renais. Se necessário, segure a adrenal com fórceps para assegurar sua posição no molde caso contrário ele pode se mover dentro do molde.</li>
	<li>Suavemente move o molde de encastre a bandeja de arrefecimento e esperar até o endurecimento da parafina. Depois disso, para facilitar o corte, armazene encastre moldes em lugar fresco.</li>
</ol>5. corte com um micrótomo rotativo
<ol><li>Verifique se o micrótomo está limpo antes de começar, afastar todos os resíduos descartados parafina, certifique-se de que a faca (ou lâmina) é afiada, o mecanismo interno de óleo e retrai completamente o titular do bloco, se necessário.</li>
	<li>Rotular uma série de corrediças do microscópio (positivamente carregada ou revestidas para evitar a perda de tecido (ver Tabela de materiais)), coloque-os em um conjunto de slides aquecedor a 37 ° C e distribuir água ultrapura autoclavado tipo 1 no topo de cada slide.</li>
	<li>Definir a espessura de corte em 5 µm.</li>
	<li>Insira a lâmina de micrótomo em porta-lâmina, controlar o ângulo da lâmina, certifique-se de que a lâmina está firmemente preso no suporte e verific o afastamento do bloco de parafina e titular do bloco.</li>
	<li>Trazer o titular do bloco até sua posição mais alta e, se possível, tranque o manípulo operacional, remover o bloco de parafina do molde e coloque-o no suporte do bloco, prendendo-o firmemente com o grampo. O ângulo da linha de centro da lâmina com a superfície de revestimento do bloco deve ser cerca de 20°. Se necessário, reajuste o bloco de parafina. Atenção: A lâmina é afiada.</li>
	<li>Se anteriormente bloqueado, destravar a roda de mão e baixe o bloco de parafina até que seu rosto está nivelado com a borda da lâmina do micrótomo. Gire a roda de mão com um ritmo constante. Execute o corte inicial para remover a parafina e expor as supra-renais.</li>
	<li>Continue girando a roda de mão e a seção até o fim das supra-renais. Use um microscópio brightfield ou dissecação para verificar a presença de tecido nas seções. Retire a fita da lâmina e com a ajuda de outro par de pinças, coloque-o sobre a água, colocada sobre a lâmina de vidro. Pode ser útil colocar a fita sobre uma superfície, esticá-lo cuidadosamente e então montá-lo no slide.</li>
	<li>Seque os slides sobre a chapa. Em seguida, coloque-as sobre uma bandeja de slide e asse a 37 ° C durante a noite ou mais se a água ainda está presente. Depois de seco, armazene os slides em uma caixa de slides à temperatura ambiente.</li>
	<li>Guarde todos os equipamentos usados e limpar o micrótomo.</li>
</ol>6. imunofluorescência
<ol><li>Selecione os slides para imunocoloração e colocá-los em um suporte de slide.</li>
	<li>Em uma chapa quente, traga um copo cheio de 0,01 M citrato em pH 2,0 para ferver. O volume da reserva depende do tamanho do copo e deve ser suficiente para cobrir as seções sobre os slides durante a ebulição (alguns evaporação precisa ser levado em conta). Cubra o copo com folha de alumínio. Nota: Outros métodos para recuperação do antígeno estão disponíveis (ver discussão).</li>
	<li>Deparaffinize os slides em xilol 100% 2 x por 5 min cada. Hidratar os slides usando a seguinte série: 100% EtOH 2 x por 5 min, 70% EtOH 2 x por 5 min, digite 1 água ultrapura por 5 min. Nota: Após a deparaffinization, é importante não deixar as seções secar: cortes histologicos sempre devem ser cobertos com buffers ou soluções até ao final do procedimento ou a estrutura do tecido pode ser danificada.</li>
	<li>Para recuperação do antígeno, coloque slides em um suporte de metal slide e inseri-lo no copo com citrato sem a folha de alumínio a ferver. Deixe ferver por 10 min.</li>
	<li>Retirar o copo do prato quente e deixe esfriar por 20 min. Certifique-se de que as seções adrenais ainda são cobertas com o buffer.</li>
	<li>Prepare a solução de bloqueio. Se usando a coloração comercialmente disponível kit de empregados para o Representante resultados (ver a Tabela de materiais), em um tubo, adicione 1,25 mL de 1X PBS, 1 gota (o equivalente a cerca de 45 µ l) de reagente de bloqueio de Ig de Mouse e 5% de soro de cabra normal. Armazene a solução bloqueio a 4 ° C ou em gelo durante o trabalho. Nota: O soro usado depende de espécies de hospedeiros do anticorpo secundário. Aqui foram usados anticorpos secundários erguidos em cabra. Para outros anticorpos, concentrações séricas diferentes podem ser necessárias. Empiricamente, determine a concentração correta de soro testando várias concentrações.</li>
	<li>Transferi os slides em uma jarra de Coplin contendo PBS 1x e lavagem 3 x 10 min cada um basculante com balanço suave.</li>
	<li>Prepare uma câmara umidificada para a coloração.</li>
	<li>Agite suavemente, fora a PBS de um slide; Limpe a parte inferior do slide com uma limpeza de fiapos para remover a excesso PBS.</li>
	<li>Usando um marcador especial para slides com propriedades hidrofóbicas, desenhe um círculo ao redor de cada seção adrenal, certificando-se que a superfície de vidro é seca para evitar a propagação da solução de tinta para a seção. Se necessário, limpe cuidadosamente seca a superfície. Coloque o slide na câmara umidificada.</li>
	<li>Rapidamente, pipete 50 µ l (ou o suficiente para cobrir as seções) de bloqueio solução sobre cada seção. Encube por 1h à temperatura ambiente. Nota: Bloqueio de volume de solução necessário pode variar; é importante que as seções são bem cobertas com a solução.</li>
	<li>Preparar a solução diluente do kit comercialmente disponível com 7,5 mL de 1X PBS, 600 µ l de proteína concentrar ações solução e 5% de soro de cabra normal (ou qualquer outro soro e concentração utilizada na solução de bloqueio). Armazene a solução diluente a 4 ° C ou em gelo durante o trabalho.</li>
	<li>Prepare as soluções de anticorpo primário, diluindo os anticorpos primários nas concentrações adequadas na solução diluente. Para coloração de co, adicionar uma alíquota de cada anticorpo em um novo tubo e misture suavemente. Anticorpos de lugar e soluções de anticorpo no gelo até estar pronto para usar. Nota: Aqui usamos anticorpo anti-SF1 no coelho e um anticorpo anti-TH no mouse. Para preparar o anticorpo soluções de trabalho sigam as instruções.<ol>
<li>Para a solução de trabalho de SF1, em um tubo, adicione 1 µ l de anticorpo anti-SF1 a 999 µ l de solução diluente (concentração final de 1,5 µ g/mL). Para a solução de trabalho de TH, em um tubo, adicione 1 anticorpo anti-TH µ l 499 µ l de solução diluente (estima-se a concentração final de 2-6 µ g/mL).</li>
		<li>Para SF1 + TH mix de trabalho de anticorpo, em um tubo fresco, pipetar 250 µ l de solução de trabalho de SF1 e 250 µ l de solução de trabalho de TH. Misture suavemente pipetando. Armazenar no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferir os slides em uma jarra de Coplin contendo 1X PBS e lavar 3 x por 5 min cada um basculante com balanço suave.</li>
	<li>As lâminas de volta para a câmara umidificada depois limpando o excesso de PBS, pipeta o SF1 + TH anticorpo trabalho mix (ou outra solução de anticorpo primário) em cada seção, feche a câmara umidificada e deixá-lo durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>No dia seguinte, mova os slides em um Coplin jar contendo 1X PBS e lavagem 3x por 15 min em uma cadeira de balanço com balanço suave.</li>
	<li>Enquanto lavava os slides, prepare a solução de anticorpo secundário na solução diluente usando a concentração adequada. Se realizando co coloração, adicione uma quantidade igual de cada solução de anticorpo secundário em um tubo de novo. Misture suavemente pipetando. Armazenar no gelo. Proteger os tubos de luz e armazenar no gelo até estar pronto para usar. Nota: Aqui, os anticorpos secundários utilizados são 488 nm fluorescente tingir-etiquetados anti-rato gerado na cabra e 549 fluorescente tingir-etiquetados anticoelho erguido em cabra. A solução de anticorpo secundário foi preparada pela adição de 0,5 µ l de cada anticorpo secundário em 799 µ l de solução diluente (concentrações finais de 1,2 µ g/mL).</li>
	<li>Coloque os slides volta na câmara umidificada depois de retirar o excesso de PBS, rapidamente adicionar a solução de anticorpo secundário nas secções adrenais, feche a câmara umidificada e proteger da luz. Encube por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin com 1X PBS e lavar 3x por 15 min em uma cadeira de balanço com balanço suave, certificando-se de protegê-los de luz.</li>
	<li>Preparar a 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solução para coloração nuclear: 1 µ l de DAPI (20 mg/mL) em 1 mL de 1X PBS. Nota: Corante de contraste nuclear azul fluorescente pode também ser conseguido usando corante Hoechst.</li>
	<li>Adicionar solução de DAPI para as seções de adrenais, cobrir de luz e incubar a temperatura ambiente por 7 min.</li>
	<li>Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin com 1X PBS e lavar 3 x por 5 min em uma cadeira de balanço com balanço suave, protegendo os slides da luz.</li>
	<li>Em uma área protegida da luz directa, deite-se um vidro de tampa, e pipetar 60 µ l ou cerca de 3 gotas de agente de montagem apropriado para imunofluorescência ao longo da superfície do vidro tampa.</li>
	<li>Limpe cuidadosamente a parte de trás de um slide com uma limpeza de fiapos, posição do slide viradas para baixo em direção o tampa de vidro e paralelo a ele, então os cortes histologicos enfrentam o vidro de cobertura com o agente de montagem nele. Levemente pressione o slide sobre o vidro de cobertura e certifique-se de que nenhuma bolha de ar está preso entre o slide e o vidro de tampa.<ol>
<li>Se necessário, aplica mais pressão para remover as bolhas de ar e o excesso de agente de montagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Estabelecer o slide em um recipiente escuro e cura à temperatura ambiente durante um período mínimo de 24 h (ou o tempo indicado na folha de informações do agente de montagem usado) e vá para a imagem.</li>
</ol>7. imagem latente
Nota: Um microscópio de fluorescência, conectado a uma câmera é necessário para detectar e capturar a fluorescência emitida por tecidos após a excitação em determinados comprimentos de onda. Embora óbvio, é importante lembrar-se de escolher o secundário anticorpo conjugado com fluorochromes cuja excitação e espectros de emissão são compatíveis com os equipamentos disponíveis. Configurações de imagem variam de acordo com o microscópio e o software usado para captura de imagens. Existem algumas regras básicas que se aplicam para seções adrenais de imagem, tais como ter certeza de que o tempo de exposição, câmera obter configurações e intensidade da fonte de luz são mantidos constantes.
<ol><li>Ligue a fonte de luz e a câmera, lançar o software de imagem seguindo as instruções do fabricante. Nota: A ordem dessas ações pode diferir dependendo do equipamento utilizado.</li>
	<li>Fixe o slide no palco, abrir o obturador e olhando pelas oculares do microscópio usar coloração nuclear (DAPI) canal e ampliação baixa (4x) para identificar o tecido no slide: seções adrenais são pequenas, e sua visualização pode exigir algum tempo.</li>
	<li>Mude para uma maior ampliação (10x), foco e fechar o obturador. Nota: É importante evitar desnecessariamente longa exposição à luz que podem causar o fotobranqueamento, resultando em perda de sinal.</li>
	<li>Usando os comandos do software, selecione o objetivo (10 X) e o canal em uso (DAPI), ajustar o tempo de exposição (1 s, pode ser ajustado se o sinal for muito forte ou fraco). Se disponível, defina binning para geração de imagens ao vivo (não aquisição) '2 X 2' conversão ganhar a 'médio', velocidade de leitura de 20 MHz'. Se o software utilizado não exibe a barra de escala no final da imagem, selecione a opção barra de escala do menu e posicionar o bar onde desejar.</li>
	<li>Abrir o obturador, re-ajustar o foco, se necessário e mudar de canal (FITC, TRITC, DAPI). Se o microscópio não é automatizado, tirar uma foto da adrenal em cada canal sem mover o palco e certifique-se de ajustar a seleção do canal em uso. Feche o botão do obturador uma vez terminado. Nota: Anote as definições empregadas no caso o software não automaticamente salva-los.</li>
	<li>Salve as fotos. Nota: Fotos mescladas podem ser muitas vezes criadas usando software do microscópio ou outros pacotes de software de editor de gráficos.</li>
	<li>Repita a imagem para outras áreas da seção e/ou com uma maior ampliação. Nota: Uma ampliação de 20 X muitas vezes requer um menor tempo de exposição (ou seja, 800 ms).</li>
	<li>No final da imagem, desligue todos os equipamentos na ordem correta.</li>
</ol>

<ol><li>Brandtzaeg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increasing+power+of+immunohistochemistry+and+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).</li>
<li>Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+as+an+important+tool+in+biomarkers+detection+and+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Insights%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice.</a> Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/10.3181/00379727-47-13084P">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Stem%2F+Progenitor+Cell+Maintenance+in+the+Adrenal+Cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex.</a> Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).</li>
<li>Yates, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+Development%2C+Maintenance%2C+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Gland+Development+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease.</a> Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).</li>
<li>Jones, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+the+Mouse+Adrenal+Cortex+with+Special+Reference+to+the+Zona+Reticularis+and+to+Brown+Degeneration%2C+Together+with+a+Discussion+of+the+Cell+Migration+Theory%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Journal+of+Microscopical+Science%22%5BJournal%5D)">Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory.</a> Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53(1948).</li>
<li>Sucheston, M. E. C., Samuel, M. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/e6f2/ef2e1761e7eb22ceeca818610ff152539fbe.pdf">The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland.</a> The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).</li>
<li>Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Sonic+hedgehog+secreting+and+receiving+cells+in+the+developing+and+adult+rat+adrenal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).</li>
<li>Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+zonation%2C+renewal%2C+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling.</a> Frontiers in Endocrinology. 6, 27(2015).</li>
<li>Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Droplets+Finally+Get+a+Little+R-E-S-P-E-C-T%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T.</a> Cell. 139 (5), 855-860 (2009).</li>
<li>Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26639173">Lipid droplets and steroidogenic cells.</a> Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).</li>
<li>Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25668018">Hedgehog signaling and steroidogenesis.</a> Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Lowe, J., Anderson, P. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/stevens-and-lowes-human-histology-fourth-edition/9780723435020">Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition</a>. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).</li>
<li>Nagatsu, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1684650">Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes.</a> Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).</li>
<li>Berthon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+effects+of+Armc5+haploinsufficiency+on+adrenocortical+function%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Geneticst%22%5BJournal%5D)">Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function.</a> Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).</li>
<li>Brown, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9864103">Antigen retrieval methods for immunohistochemistry.</a> Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).</li>
<li>Billinton, N., Knight, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+a+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).</li>
<li>Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+fluorometric+determination+of+the+stable+state+of+aggregation+in+hemoglobins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins.</a> Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Red+Blood+Cell+Autofluorescence+for+Immunocytochemistry+on+Fixed+Embryonic+Mouse+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81, 28(2017).</li>
<li>Watson, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21391776">Suppressing autofluorescence of erythrocytes.</a> Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207(2011).</li>
<li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs.</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve um método para o isolamento de rato glândulas supra-renais juntamente com a preparação e coloração de glândulas supra-renais secionado rato de parafina.
Em comparação com outros protocolos que testamos, este protocolo de imunofluorescência revelou-se adequado para a maioria dos anticorpos utilizados em nosso laboratório. No entanto, em certos casos pode exigir alguns ajustes para melhorar os resultados da coloração. Uma variável que pode ser facilmente modificada e test...

Imuno-histoquímica é uma técnica para a detecção de componentes de tecido com o uso de anticorpos contra moléculas celulares específicas e técnicas de coloração subsequentes para detectar os anticorpos conjugados1. Este procedimento de imuno-histoquímica requer fixação específica e processamento de tecidos que são frequentemente empiricamente determinados para o antígeno específico, tecido e anticorpo utilizaram2. A fixação é crucial para preservar o estado "original" de tecido e, mantendo intacta celular e subcellular estruturas e padrões de expressão. Mais processamento e incorporação de procedimentos são necessários para preparar o tecido para corte em fatias finas que são usadas para estudos histológicos, envolvendo a imuno-histoquímica.
Immunostaining pode ser executada com deteção fluorescente ou cromogênica. A detecção cromogênica exige a utilização de uma enzima para converter um substrato solúvel em um produto colorido insolúvel. Enquanto esta enzima pode ser conjugada com o anticorpo reconhecer o antígeno (anticorpo primário), é mais frequentemente conjugado ao anticorpo reconhecendo o anticorpo primário (ou seja, o anticorpo secundário). Esta técnica é altamente sensível; o produto colorido resultante da reação enzimática é fotoestável e requer apenas um microscópio brightfield para a imagem latente. No entanto, cromogênico immunostaining pode não ser adequado ao tentar visualizar duas proteínas que co localizar, uma vez que a deposição de uma cor pode mascarar a deposição do outro. No caso de co coloração, imunofluorescência tem provado para ser mais vantajoso. O advento da imunofluorescência é atribuído a Albert Coons e colegas, que desenvolveram um sistema para identificar o tecido antígenos com anticorpos marcados com fluoresceína e visualizá-las nos tecidos sob luz ultravioleta3seccionados. Detecção de fluorescência é baseado em um anticorpo conjugado com um fluoróforo que emite luz após a excitação. Porque existem vários fluorophores com emissões em diferentes comprimentos de onda (com pouca ou nenhuma sobreposição), esse método de deteção é ideal para os estudos de várias proteínas.
A glândula adrenal é um órgão emparelhado localizada acima do rim e caracterizado por dois componentes distintos embryologically rodeadas por uma cápsula mesenquimal. O córtex adrenal exterior, derivado da mesoderma intermediária mesonéfricos, segrega hormonas esteroides, enquanto a medula interna, derivada da crista neural, produz catecolaminas, incluindo adrenalina, noradrenalina e dopamina. O córtex adrenal é histologicamente e funcionalmente dividido em três zonas concêntricas, com cada zona secretoras de classes diferentes de hormônios esteroides: o exterior zona glomerulosa (zG) produz mineralocorticoides que regulam a homeostase do eletrólito e volume intravascular; a médio zona fasciculada (zF), diretamente abaixo do zG, segrega glicocorticoides que medeiam a resposta ao estresse através da mobilização das lojas da energia para aumentar a glicose do plasma; e o interior zona reticular (zR), que sintetiza sexo precursores esteroides (ou seja, Dehidroepiandrosterona (DHEAS))4.
Alguma variação no zoneamento adrenocortical está presente entre as espécies: por exemplo, Mus musculus carece da zR. A única zona X pós-natal de M. musculus é um remanescente do córtex fetal, caracterizado por pequenas células de lipídios-pobres com acidofílicas cytoplasms5. A X-zone desaparece na puberdade em ratos do sexo masculinos e após a primeira gravidez em ratos fêmeas, ou gradualmente degenera em fêmeas de raça não6,7. Além disso, a tortuosidade e a espessura das exposições zG marcada variação entre espécies como organização de células tronco e progenitoras periféricas em e adjacente para o zG. O rato, ao contrário de outros roedores, tem uma zona de indiferenciadas visível (zU) entre o zG e zF que funciona como uma zona de células-tronco e/ou uma zona de transiente amplificando progenitores. Se o zU é exclusivo para ratos, ou simplesmente uma forma mais organizada com destaque aglomerado de células é desconhecido8,9.
Células do córtex adrenal contêm gotículas lipídicas que armazenam os ésteres de colesterol que servem como o precursor de todos os hormônios esteroides10,11.  O termo "esteroidogênese" define o processo de produção de hormônios esteroides de colesterol através de uma série de reações enzimáticas que envolvem a atividade esteroidogênica fator 1 (SF1), cuja expressão é um marcador de potencial esteroidogênica. Na glândula adrenal, Sf1 expressão está presente apenas em células do córtex12. Um interessante estudo encontrou a expressão de biotina endógena adrenocortical células com potencial esteroidogênica13. Enquanto esta pode ser a causa da maior experiência em biotina/estreptavidina-com base em métodos de coloração, devido a detecção de biotina endógena pelo anticorpo conjugado com estreptavidina, esta característica pode ser também empregada para distinguir o esteroidogênica células de outras populações dentro da glândula adrenal, ou seja, endoteliais, capsular e células da medula.
Inervados pelo simpáticos neurônios preganglionic, a medula adrenal é caracterizada por basophilic células com uma citoplasma granular contendo epinefrina e norepinefrina. Células da medula são denominadas "cromafim" devido ao alto teor de catecolaminas que formam um pigmento marrom após oxidação14. Tirosina Hidroxilase (TH) é a enzima que catalisa a etapa limitante na síntese de catecolaminas e, na glândula adrenal, é expressa apenas na medula15.
Aqui nós apresentamos um protocolo para a isolação do rato as glândulas supra-renais, seu processamento para incorporação em parafina e corte e um método para realizar a mancha na adrenais seções a fim de identificar os tipos celulares que constituem o córtex adrenal e medula. Este protocolo é um padrão em nosso laboratório de imunocoloração com múltiplos anticorpos usados rotineiramente em nossa pesquisa.

<table><tbody><tr><td>Placa de cultura de células de 24 poços</td><td>Nest Biotechnology Co.</td><td>0412B</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas descartáveis 25 G x 5/8"</td><td>Exel International</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast plus&nbsp;</td><td>McCormik scientific</td><td>39502004</td><td>Parafina para incorporação de tecidos</td></tr><tr><td>de biópsia Shandon II com tampa anexada</td> <td>de 1001097</td><td>Thermo scientific</td><td>para processamento de tecidos</td></tr><tr><td>Lâminas de micrótomo de alto perfil</td><td>Accu-Edge</td><td>4685</td><td>Lâminas descartáveis de aço inoxidável</td></tr><tr><td>Moldes de incorporação de tecido plástico descartável Peel-a-way</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986</td><td>Lâminas de microscópio Superfrost Plus truncadas, 22 mm quadradas no topo afilado para 12 mm</td></tr><tr><td></td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X5P1GAL&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol de 200 provas</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almofadas de gaze Certi-Pad&nbsp;</td><td>Certified Safety Mfg, Inc</td><td>231-210</td><td>3" x 3. Almofadas de gaze sem látex estéril</td></tr><tr><td>M.O.M kit&nbsp;</td><td>Vector laboratories</td><td>BMK-2202</td><td>Para detectar anticorpos primários de camundongo em tecido de camundongo</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td>Toalhetes 4.4 polegadas x 8.4 polegadas</td></tr><tr><td>Super PAP PEN</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>00-8899</td><td>Caneta para desenhar em lâminas</td></tr><tr><td>Tampa de vidro do microscópio</td><td>Fisherbrand</td><td>12-544-D</td><td>Tamanho: 22 x 50 x 1.5</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542&nbsp;</td><td>(Preparado em estoque de 20 mg / mL)</td></tr><tr><td>ProLong Gold antifade reagente</td><td>Molecular Probes</td><td>P36930</td><td>Agente de montagem para imunofluorescência</td></tr><tr><td>X-cite series 120Q</td><td>Lumen Dynamics</td><td></td><td>Fonte de luz</td></tr><tr><td>Coolsnap Myo</td><td>Photometrics</td><td></td><td>Camera</td></tr><tr><td>Optiphot-2&nbsp;</td><td>Microscópio Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micrótomo</td><td>American Optical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue embedder</td><td>Leica</td><td>EG1150 H&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Processador de tecidos&nbsp;</td><td>Leica</td><td>ASP300S</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra normal</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Camundongo anti-TH</td><td>Millipore</td><td>MAB318</td><td>Anticorpo primário</td></tr><tr><td>Coelho anti-SF1</td><td>Ab proteintech group (PTGlabs)</td><td>&nbsp; anticorpo</td><td>primário</td>personalizado</tr><tr><td>Alexa-488 IgG de camundongo</td> Jackson <td>ImmunoResearch</td><td>115-545-003</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Dylight-549 Coelho IgG cabra criada</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-505-003</td><td>Anticorpo secundário</td></tr><tr><td>Citrato ácido anidro</td><td>Fisher Chemical</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Basic Research&nbsp;</td><td>Software Nikon</td><td></td><td>para imagem</td></tr></tbody></table>

isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de mouse

Isolation, Fixation, and Immunofluorescence Imaging of Mouse Adrenal Glands

Imunofluorescência é uma técnica bem estabelecida para a detecção de antígenos nos tecidos com o emprego de anticorpos conjugados a fluorocromo e tem um amplo espectro de aplicações. Deteção de antígenos permite a caracterização e identificação de vários tipos de células. Situada acima dos rins e encapsulado por uma camada de células mesenquimais, a glândula adrenal é um órgão endócrino, composto por dois tecidos diferentes, com diferentes origens embriológicos, o córtex exterior derivados mesoderme intermediário mesonéfricos e o neural crista-derivado de medula interna. O córtex adrenal secreta esteroides (ou seja, mineralocorticoides, glicocorticoides, hormônios sexuais), enquanto a medula adrenal produz catecolaminas (i.e., adrenalina, noradrenalina). Durante a realização de pesquisa de adrenal, é importante ser capaz de distinguir células únicas com funções diferentes. Aqui nós fornecemos um protocolo desenvolvido em nosso laboratório que descreve uma série de etapas sequenciais, necessários para a obtenção de mancha da imunofluorescência para caracterizar os tipos de células da glândula adrenal. Nós focamos primeiro a dissecação das glândulas supra-renais do mouse, a remoção microscópica de gordura periadrenal, seguida da fixação, processamento e incorporação de parafina do tecido. Descrevemos em seguida com um micrótomo rotativo de corte dos blocos de tecido. Por último, detalhamos um protocolo para coloração imunofluorescente de glândulas supra-renais que temos desenvolvido para minimizar tanto a ligação de anticorpos inespecíficos e autofluorescência para alcançar uma óptima do sinal.

A Figura 1 representa um diagrama esquemático do todo protocolo descrito acima. As glândulas adrenais são colhidas de ratos, tecido adiposo adjacente é removido sob um microscópio de dissecação e a adrenal são então fixado em 4% PFA. Após esta etapa, supra-renais são processadas incorporadas em parafina e seccionadas com um micrótomo para corte o órgão em fatias finas depositadas em corrediças do microscópio. Após a secagem das seções, imunofluorescência é ef...

Aqui nós apresentamos um método para isolar as glândulas adrenal de ratos, corrigir os tecidos, seção-los e executar a mancha da imunofluorescência.

Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

Immunofluorescence is a well-established technique for detection of antigens in tissues with the employment of fluorochrome-conjugated antibodies and has ...

A imunofluorescência é um método básico que pode ajudar a responder perguntas-chave no campo adrenal sobre zonação adrenal, identidade celular e função. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o estudo de múltiplas proteínas, preservando a morfologia do tecido adrenal. Para remover a glândula suprarrenal murina, corte ao redor do tecido adiposo circundante e coloque a glândula em um poço de uma placa de 24 multiwell contendo PBS fresco no gelo.Transfira a glândula para uma placa de Petri ou suporte de vidro sob um microscópio dissecando e use duas agulhas de calibre 25 para remover o tecido de gordura adjacente. Quando toda a gordura tiver sido removida, fixe o tecido em 4% de paraformaldeído a quatro graus Celsius com balanço por duas horas. No final da incubação, enxágue a glândula com três lavagens de 15 minutos a quatro graus Celsius em um a dois mililitros de PBS fresco por lavagem.Após a última lavagem, desidratar a glândula em duas imersões sequenciais de etanol a quatro graus Celsius com balanço por duas horas por incubação. Para preparar o tecido adrenal para processamento, enrole a glândula em gaze e inclua a adrenal em um de incorporação de tecido. Em seguida, coloque o em um frasco cheio de 70% de etanol para quatro graus Celsius de armazenamento até o processamento.Para processar o tecido, insira o no processador de tecido para processamento conforme indicado na tabela. No final do programa, transfira o para uma estação de incorporação cheia de parafina derretida de 65 graus e use um par de fórceps para desembrulhar a gaze. Transfira suavemente o adrenal na posição apropriada no centro da base do molde de incorporação e despeje a parafina derretida sobre a glândula.Em seguida, mova cuidadosamente o molde de incorporação para uma bandeja de resfriamento para facilitar o endurecimento da parafina. Antes de se seccionar por microtome rotativo, rotule uma série de slides de microscópio e coloque os slides em um aquecedor de slides de 37 graus Celsius. Distribua cerca de 450 microlitros de água ultra pura autoclaved tipo um em cada lâmina e coloque a espessura de corte da seção do microtómetro para cinco micrômetros.Carregue o tecido incorporado no bloco de corte e baixe o bloco de parafina até que a amostra esteja no nível facial com a borda da lâmina de microtome. Girando a roda da mão com um ritmo constante, realize um corte inicial para remover a parafina e exponha o tecido adrenal. Em seguida, adquira cinco seções de micrômetros até o final da glândula suprarrenal usando fórceps para transferir cada seção para a gotícula de água para um dos slides pré-rotulados à medida que é coletado.Depois de confirmar a presença de tecido nas seções por microscopia, seque as lâminas na placa quente por cerca de duas horas e assá-las pelo menos durante a noite em uma bandeja de slides a 37 graus Celsius até que não haja mais água visível. Uma vez seco, armazene os slides em uma caixa de slides à temperatura ambiente. Para a recuperação de antígeno de imunofluorescência, desenfisem os slides com duas imersões de 100% xileno de cinco minutos, seguidas de reidratação em uma série descendente de etanol e imersão em água.Após a imersão na água, transfira os slides para um suporte de lâmina metálica e coloque o suporte em um béquer de citrato molar de 0,01 em uma placa quente por 10 minutos. No final da incubação, retire o béquer da placa quente e deixe esfriar por 20 minutos, tomando cuidado para que todas as seções suprarrenais ainda estejam cobertas com tampão. Quando o béquer for resfriado, transfira os slides para um frasco de Coplin por três lavagens de 10 minutos em PBS fresco com balanço suave.Após a última lavagem, limpe cuidadosamente a superfície de cada lâmina sem danificar as seções teciduais e use um marcador hidrofóbico para fazer um círculo em torno de cada seção. Coloque os slides em uma câmara umidificada e adicione rapidamente pelo menos 50 microliters de solução de bloqueio a cada seção para uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. No final da incubação de bloqueio, lave os slides três vezes em PBS fresco por cinco minutos por lavagem com balanço e devolva slides para a câmara.Em seguida, adicione o coquetel de anticorpos primário de interesse a cada seção para uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, lave as amostras com três lavagens de 15 minutos em PBS fresco por lavagem e rotule os slides com a solução de anticorpos secundários apropriada por uma hora protegida da luz. No final da incubação, lave as amostras com três lavagens de 15 minutos em um roqueiro protegido da luz, rotulando os núcleos das seções com DAPI por sete minutos à temperatura ambiente protegidos da luz após a última lavagem.Depois de três lavagens PBS de cinco minutos com balanço, adicione 60 microliters de agente de montagem adequado para imunofluorescência ao longo da superfície de um copo de cobertura por amostra e pressione levemente cada seção de tecido deslizante para baixo em um vidro de cobertura, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, coloque cada slide plano em um recipiente escuro para curar à temperatura ambiente por pelo menos 24 horas antes da imagem. Durante o processo de remoção de gordura, é fundamental não deixar a glândula suprarrenal secar, pois a desidratação pode danificar a estrutura tecidual.Após uma remoção bem sucedida do tecido adiposo circundante, a glândula suprarrenal deve ser facilmente detectável sem gordura visível extra. A imunostaining de seções de glândula suprarrenais como demonstrado revela fator esteroide nuclear uma coloração das células adrenocorticas, coloração de hidroxilase de tyrosina das células medulares, coloração da DAPI dos núcleos de células não esteroides da cápsula externa, e co-coloração com células adrenocorticas e medulares. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as suprarrenais do rato são pequenas e que suas posições são um pouco variáveis dificultando sua detecção.Portanto, é fundamental ter uma visão clara da área durante a dissecação. Esses procedimentos são técnicas básicas para o estudo da glândula suprarrenal in vivo. Após estes, métodos adicionais de imunossuagem podem ser realizados para atender às necessidades científicas específicas.Após seu desenvolvimento, a imunossuagem abriu caminho para pesquisadores das áreas de ciência biomédica explorarem a expressão proteica in situ, uma ferramenta útil em muitas disciplinas e campos.

isolation-fixation-immunofluorescence-imaging-mouse-adrenal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Adrenal medular cromafins sistemas de cultura de células são extremamente úteis para o estudo da secreção de excitação de acoplamento em uma configuração em vitro. Este protocolo ilustra o método utilizado para dissecar as supra-renais e, em seguida, isolar a região medular, removendo o córtex adrenal. A digestão da medula em células cromafins único é então demonstrada.

Rato de isolamento de células Adrenal Cromafim

Este vídeo demonstra um ensaio para realizar imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira. Neste método, uma seção de tecido adrenal passa por um processo de imunocoloração em duas etapas. Inicialmente, a seção é corada com anticorpos específicos para marcadores no córtex, seguida pela remoção do anticorpo ligado e recoloração com anticorpos específicos para marcadores na medula.

Um método de imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira

De alta resolução de imagem intravital com melhor contraste de até 120 mM profundidade em linfonodos de camundongos adultos é conseguido através espacialmente modular o padrão de excitação de um multi-focal microscópio de dois fotões. Em 100 microns de dimensão medimos resoluções de 487 nm (laterais) e 551 nm (axial), evitando, assim, os limites de espalhamento e difração.

Altamente Resolvido Microscopia intravital Striped-iluminação dos centros germinativos

Após a exocitose, a membrana plasmática fundida é recuperada por meio de um processo conhecido como endocitose. Esse mecanismo reforma novas vesículas sinápticas para a próxima rodada de liberação. Eventos endocíticos individuais são capturados e analisados por meio do uso de registros de capacitância ligados a células em células cromafins adrenais de camundongos.

Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

O protocolo de imunofluorescência indirecta descrito neste artigo permite a detecção e a localização de proteínas na glândula mamaria do rato. Um método completo é dada para preparar amostras da glândula mamaria, a efectuar imuno-histoquímica, para as secções de tecido imagem por microscopia de fluorescência, e para reconstruir imagens.

Imunofluorescência Indireta em cortes congelados de Rato glândula mamária

Nós apresentamos um método para isolamento e cultura do duto de Wolff rato (WD). Também demonstramos um procedimento detalhado para toda a imunocoloração monte da cultura / WDs recentemente isolados com anticorpos marcados fluorescentes. Em conjunto, estas técnicas permitem o estudo do desenvolvimento WD, de enrolamento, e a diferenciação.

Órgão Cultura e Whole Mount Imunofluorescência Coloração de rato Wolff Dutos

Apresentamos um protocolo para dissecar as glândulas pituitárias e preparar na hipófise coronais seções de desenvolvimento de ratos.

Dissecação e preparação Coronal fatia de desenvolver Mouse hipófise

Vários métodos diferentes foram estabelecidos para a imunocoloração multiplex usando anticorpos primários da mesma espécie hospedeira. Aqui, descrevemos o uso de anticorpos mediados por micro-ondas e de fluoroforre-tyramida para bloquear a reatividade cruzada de anticorpos durante a imunocoloração multiplex em seções adrenal de camundongos forjadas fixadas em formalina.

Microwaving e Fluorophore-Tyramide para Imunocoloração Multiplex em Adrenals de camundongos − Usando Anticorpos primários conjugados da mesma espécie hospedeira

Este protocolo descreve uma técnica de imagem confocal para detectar três modos de fusão em células adrenals de chromaffin bovinas. Esses modos de fusão incluem 1) close-fusion (também chamado de kiss-and-run), envolvendo abertura e fechamento de poros de fusão, 2) stay-fusion, envolvendo abertura de poros de fusão e manutenção do poro aberto, e 3) redução de fusão, envolvendo encolhimento vesícula fundido.

Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin

Este protocolo descreve o isolamento de progenitores fibroadipogênicos (FAPs) do músculo esquelético e cardíaco de camundongos espinhosos (Acomys) por meio de dissociação enzimática e classificação de células ativadas por fluorescência. As FAPs obtidas a partir deste protocolo podem ser efetivamente expandidas e diferenciadas para miofibroblastos e adipócitos.

Isolamento, expansão e diferenciação de progenitores fibroadipogênicos do modelo de camundongo espinhoso

Uma abordagem robusta e reprodutível para estabelecer culturas primárias 2D de células enriquecidas com zona glomerulosa e zona fasciculata foi desenvolvida para o córtex adrenal do camundongo. Esse sistema preserva características moleculares e funcionais chave de cada zona, permitindo uma investigação focada das vias de sinalização, produção de hormônios e comportamento das células corticais adrenais ex vivo.

Estabelecimento de Culturas Primárias Enriquecidas em Zona a partir do córtex adrenal do camundongo

Aprenda a isolar, fixar e realizar imunofluorescência em glândulas supra-renais de camundongo. Esta técnica preserva a morfologia tecidual e permite estudar múltiplas proteínas simultaneamente para investigar zonação adrenal e identidade celular.

Isolamento, fixação e imagem de imunofluorescência de glândulas supra-renais de Mouse

Explorar mais vídeos