Purificação da afinidade do cloroplasto Translocon proteínas complexos usando a marca de torneira
1 de novembro de 2018
Aqui apresentamos um protocolo testado e comprovado para a purificação do cloroplasto complexos de importação de proteínas (complexo de TIC-TOC) usando a torneira-tag. O protocolo de afinidade-isolamento de uma etapa potencialmente pode ser aplicado a qualquer proteína e ser usado para identificar novos parceiros de interação por espectrometria de massa.
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do cloroplasto, por exemplo, a composição do maquinário de importação de proteínas cloroplastas. É essencial para o esverdeamento e fotossíntese e, portanto, para a produção de alimentos no planeta. A máquina molecular consiste em dois complexos separados no membro externo e interno do cloroplasto chamado TOC e TIC, mas a composição não é totalmente conhecida.
A principal vantagem desta técnica é que a purificação do complexo Arabidopsis TOC/TIC pode ser realizada em um método de purificação de uma única etapa, purificação tap-toc. É um método específico e eficiente. Geralmente, pesquisadores novos neste método podem lutar porque não estão familiarizados com o isolamento de frações de membrana de cloroplasto, detergente, solubilização ou purificação de afinidade.
Depois de preparar as plantas arabidopsis, triture 10 gramas de mudas de três semanas de idade em nitrogênio líquido, usando uma argamassa fria e pilão com areia. Adicione 20 mililitros de tampão de moagem a frio aos tecidos moído. Misture bem e deixe a mistura descongelar no gelo.
Em seguida, mergulhe duas camadas de material de filtragem rápida com tampão de moagem. Filtre o homogeneizar através das duas camadas de material de filtragem em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros. Centrifugar o filtrado a 1.500 vezes g em quatro graus Celsius por 10 minutos e transferir o supernasal para um tubo de centrífuga córica fresco de 50 mililitros.
Repita a centrifugação mais uma vez nas mesmas condições. Transfira o supernatante para um tubo de ultracentrifuge frio de 38,50 mililitros e cubra-o até 35 mililitros com tampão de moagem a frio. Use uma ultracentrifugação para centrifugar a amostra a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius durante uma hora.
Usando um homogeneizador de Teflon de vidro, resuspenque a pelota verde no tampão de moagem. Centrifugar a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius por uma hora e descartar o supernaspe. Use o homogeneizador de teflon de vidro para resuspensar a pelota verde em 18,75 mililitros de um x tampão de moagem.
Em seguida, adicione outros 9.375 mililitros de um x buffer de moagem. Adicione 9.375 mililitros de quatro x solução de solubilização para trazer o volume final para 37,5 mililitros e incubar em um agitador rotativo a quatro graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, use uma ultracentrifugação para centrifugar a amostra a 100.000 vezes g e quatro graus Celsius por uma hora.
Transfira o supernatante contendo as membranas solubilizadas para um tubo de centrífuga cônica fresco de 50 mililitros. Depois de preparar a resina de agarose IGG, transfira a resina de agarose IGG anteriormente lavada para o tubo cônico de 50 mililitros contendo os 37,5 mililitros de membranas solubilizadas anteriormente lavadas. Incubar durante a noite em um shaker rotativo a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, sedimente a resina IGG agarose a 100 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos. Use uma pipeta para remover o supernatante. Foi a resina de agarose IGG em 37,5 mililitros de tampão A e incubar em um shaker rotativo à temperatura ambiente por 10 minutos.
Continue sedimentando e lavando a resina conforme descrito no protocolo de texto. Depois disso, transfira a resina de agarose IGG para uma coluna de giro de 500 microliter com um filtro de 35 mícrons. Lave as contas duas vezes com 300 microliters de tampão de eluição TEV para equilíbrio.
Em seguida, adicione 300 microliters de tampão de eluição TEV contêm 10 microliters de protease TEV. Incubar a coluna de giro com contas em um Thermomixer a 16 graus Celsius e 350 rpm por duas horas. Em seguida, abra a coluna de giro e coloque-a em um tubo novo, limpo, de 1,5 mililitro.
Gire este tubo a 100 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para coletar o elunato. Neste estudo, um complexo proteico de envelope de cloroplasto da TAP das plantas transgênicas A.thaliana é purificado. A análise do imunoblot confirma que o isolar o TAP-TOC159 interage com TOC75 e TOC33 do complexo TOC.
A quinase da membrana externa do cloroplasto, KOC1, que é conhecida por fosforilato TOC159 também é co-isolada. A presença do TIC110 revela que o complexo isolado TAP-TOC159 também contém os componentes do complexo TIC. O anticorpo FBN1A não reconheceu o complexo TAP-TOC159, indicando a ausência de contaminações.
No controle negativo, a proteína NTAP imunoprecipitada não co-isolou com nenhuma das proteínas TOC, TIC e confirma a especificidade da purificação TAP-TOC159. Embora este método possa fornecer informações sobre a importação de proteínas de cloroplasto, ele pode potencialmente ser aplicado a qualquer outro complexo no sistema de garrafas Arabidopsis thaliana. Após este procedimento, outros métodos podem ser aplicados, como manchas ocidentais ou espectrometria de massa para demonstrar a presença de componentes conhecidos ou identificar novos componentes dos complexos TOC e TIC.
Esta técnica abriu caminho para a pesquisa no campo de importação de proteínas cloroplásticas para explorar a função de novos componentes dos complexos TOC e TIC.
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo de isolamento por afinidade de um passo para purificar complexos de importação de proteínas de cloroplasto (complexo TOC-TIC) usando a etiqueta TAP. Este método pode identificar novos parceiros de interação por espectrometria de massa e é crucial para entender a função do cloroplasto.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia do cloroplasto
- Purificação de proteínas
- Espectrometria de massa
Fundo
- A maquinaria de importação de proteínas do cloroplasto é essencial para a fotossíntese e produção de alimentos.
- Os complexos TOC e TIC estão envolvidos na importação de proteínas, mas sua composição completa não é bem compreendida.
- Os métodos atuais para isolar esses complexos podem ser complexos e demorados.
- Este estudo visa simplificar o processo de purificação.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um protocolo simples para purificar o complexo TOC-TIC.
- Facilitar a identificação de novos componentes envolvidos na importação de proteínas do cloroplasto.
- Fornecer um método que possa ser aplicado a outros complexos de proteínas em Arabidopsis thaliana.
Métodos Utilizados
- Preparação de plântulas de Arabidopsis e moagem em nitrogênio líquido.
- Centrifugação sequencial para isolar membranas de cloroplasto.
- Purificação por afinidade usando resina de agarose IGG.
- Análise de immunoblot para confirmar a presença de proteínas específicas.
Principais Resultados
- O complexo TAP-TOC159 foi purificado com sucesso e mostrado para interagir com TOC75 e TOC33.
- O co-isolamento de TIC110 indicou a presença de componentes TIC no complexo purificado.
- O método demonstrou especificidade, pois controles negativos não mostraram co-isolamento com proteínas TOC e TIC.
- Esta técnica permite uma exploração adicional dos mecanismos de importação de proteínas do cloroplasto.
Conclusões
- O método de purificação TAP-tag é eficiente e específico para isolar complexos de proteínas de cloroplasto.
- Esta abordagem pode aprimorar a pesquisa sobre o sistema de importação de proteínas do cloroplasto.
- Estudos futuros podem aproveitar este método para identificar novos componentes dos complexos TOC e TIC.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Understanding the composition of chloroplast protein import complexes is critical for advancing plant biotechnology and improving crop yield. The TAP-TOC159 purification method enables efficient isolation of membrane protein complexes, supporting target validation and mechanistic de-risking in chloroplast-related research. This approach enhances predictive confidence in identifying novel components of the TOC and TIC complexes, with implications for synthetic biology and metabolic engineering in biopharma-relevant plant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of the chloroplast protein import machinery by isolating TOC159-containing complexes for functional analysis.
- Operational Value: Provides a specific and efficient one-step purification strategy that reduces experimental variability in complex isolation.
- Strategic Value: Supports hypothesis-driven target validation by confirming interactions with known components like TOC75, TOC33, TIC110, and KOC1.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified complexes suitable for downstream applications such as mass spectrometry to identify novel interactors.
- Operational Value: Produces reproducible isolations amenable to standardized workflows for complex profiling.
- Strategic Value: Facilitates assay readiness by delivering enriched complexes that improve detection sensitivity in screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains complex integrity through gentle TEV protease elution, preserving native interactions for functional follow-up.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to validation by providing material suitable for immunoblot and mass spectrometry analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement by confirming specificity through negative controls, reducing false-positive risks.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, enabling isolation of native complexes to inform target identification and pathway elucidation before progressing to functional assays or engineering efforts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating TOC-TIC complexes to study protein import mechanisms.
- Screening: Delivers solubilized membrane complexes that are amenable to affinity capture and downstream analytical readouts.
- Analytics: Enables quantitative and qualitative analysis via immunoblot and mass spectrometry to compare complex composition across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to validation by providing biochemically defined complexes that reflect native chloroplast membrane environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable affinity purification platform applicable to other membrane-bound complexes in Arabidopsis thaliana.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by enabling specific isolation of TOC159-associated complexes.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized affinity purification and gentle elution conditions.
- Strategic Value: Enhances decision-making by providing reliable data on complex composition to guide target prioritization.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in chloroplast-targeted traits by de-risking target identification through specific complex isolation.
Implementation Considerations
- Expertise in chloroplast membrane isolation and detergent-based solubilization is required.
- Access to ultracentrifugation equipment and affinity resins (IgG agarose) is necessary for membrane preparation and complex capture.
- Standardization of washing and elution conditions across labs is critical to ensure reproducibility of complex isolation.
- Adaptation to other model systems may require optimization of tag accessibility and complex stability.
- Practical limitations include the need for transgenic lines expressing TAP-tagged constructs and potential tag interference with native function.
