Name: Crescimento de bactérias de Magnetotactic do género Magnetospirillum magnetotacticum: cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1 (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Aprenda a cultivar Magnetospirillum magnetotacticum, MSR-1, AMB-1 e MS-1 em meios líquido e semi-sólido com controle rigoroso de oxigênio. Este protocolo garante crescimento reprodutível para pesquisas em microbiologia ambiental.

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Agradecemos a ajuda com culturas MTB, Adam P. Hitchcock e Xiaohui Zhu pelo seu apoio ao estabelecimento das culturas MTB na McMaster University e Marcia Reid para formação e acesso ao centro de microscopia eletrônica (McMaster University, Richard B. Frankel Faculdade de Ciências da saúde). Este trabalho foi apoiado por ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC) e nos National Science Foundation.

1. instalação da estação2 N
Nota: Escolha o diâmetro interno do tubo de modo que ele pode ser conectado ao tanque com vazamento mínimo e para que o cilindro de uma seringa de plástico de 1 mL se encaixa firmemente esta tubulação. Uma ilustração da completa N2 gaseamento estação é fornecida na Figura 1.
<ol><li>Com segurança, instale um tanque de gasolina de2 N perto de um banco em que não há espaço suficiente para configurar a estação de2 N (um comprimento de aproximadamente 50 cm).</li>
	<li>Ligue para o tanque de um pedaço de tubo de tempo suficiente para chegar à área onde será construída a estação. Se for necessário, aplique fita Teflon na saída do tanque para evitar qualquer vazamento.</li>
	<li>Para construir uma estação capaz de subida cinco garrafas de meio ao mesmo tempo, corte quatro pedaços de tubos de aproximadamente 5 cm de comprimento.</li>
	<li>Monte os pedaços de tubos em linha com três três vias em forma de T encaixes plásticos. Conecte uma extremidade desta linha para o pedaço de tubo na saída do tanque através de um encaixe extra em forma de T2 N. Adicione um cotovelo de 90° encaixe na outra extremidade.</li>
	<li>Uso de fita para anexar a estrutura de uma haste de metal horizontal colocados cerca de 30 cm acima do banco.</li>
	<li>Conectar-se cinco peças de tubo (aproximadamente 20 cm de comprimento) para as saídas livre dos acessórios instalados na etapa 1.4.</li>
	<li>Remover os pistões de cinco seringas de plástico de 1,0 mL e corte a extremidade maior dessas seringas (i. e., o outro lado para a agulha), mantendo apenas a parte graduada. Preencha essas seringas com algodão, não demasiado firmemente.</li>
	<li>Inserir as seringas nas peças 20cm longo vertical da tubulação e use água e sabão para garantir que não há nenhum escapamento quando N2 está fluindo.</li>
	<li>Remova as tampas de cinco agulhas 25g (0,5 x 25 mm) e introduza os pedaços de 10 cm de tubo fino essas agulhas. Certifique-se de que as agulhas se encaixar firmemente o tubo. Cuidado: Há um risco de esfaqueamento durante esta etapa. Fazê-lo devagar e com cuidado.</li>
	<li>Anexe as agulhas preparadas no passo 1.9 para as seringas da estação2 N. Certifique-se de que N2 está a fluir através de todas as cinco linhas e manter a estação em stand-by.</li>
</ol>2. crescimento médio preparação
Nota: É possível regular a quantidade de meio preparado, conforme explicado nos passos 2.1.2 e 2.2.2 2.3.8. A quantidade de água e produtos químicos usados apenas necessidades para ser ajustado proporcionalmente. O papel de todos os componentes de médio é descrito na tabela complementar 1.
<ol><li>Preparação de meio de cultura líquido para MSR-1<ol>
<li>Prepare uma solução de citrato férrico de 10mm, acrescentando 0,245 g de citrato férrico para 100 mL de água destilada deionizada. Aqueça e mexa até para dissolver, até um amarelo ao laranja claro a solução é obtida. Autoclave a solução utilizando um padrão de ciclo (pelo menos 15 min de exposição a 121 ° C) e em seguida armazenar desta solução à temperatura ambiente no escuro. Nota: Descarte a solução de citrato férrico quando um precipitado torna-se óbvio.</li>
		<li>Em um béquer contendo 1 L de água destilada deionizada, adicionar o seguinte em ordem, agitando: 1,0 mL do mineral rastreamento suplemento solução, 0,1 g de KH2PO4, 0,15 g de MgSO4.7 H2O, 2,38 g de HEPES, 0,34 g de NaNO3 , extrato de 0,1 g de levedura, 3,0 g de peptona de feijão de soja, 4,35 mL de lactato de potássio (solução de 60% w/w) e 5 mL de 10 milímetros III solução de citrato. Nota: Ajuste as quantidades proporcionalmente... se for necessária uma menor quantidade de meio de crescimento. Para uma estação de2 N capaz de subida cinco garrafas ao mesmo tempo, como aquele construído na etapa 1 do presente protocolo, prepare 300 mL de meio. Cuidado: Rastrear mineral e estoque de citrato III soluções precisam ser mantidos estéril. Para evitar contaminação, usar técnica estéril padrão quando usá-los (flama aberta topos de garrafas usando um bico de Bunsen) e utilizar pontas de pipetas estéreis para distribuição. Armazenar a solução mineral no frigorífico a 4 ° C.</li>
		<li>Após a adição de todos os produtos químicos, ajuste o pH a 7,0 com solução de NaOH 1 M. Dispense o meio preparado em frascos de soro de 125 mL. Despeje 60 mL do meio em cada garrafa.</li>
		<li>Bolha N2 entram no meio, por 30 min remover o dissolvido O2, usar o pequeno tubo ligado à estação de2 N, descrita na etapa 1. Coloque uma rolha de borracha butílica em cima de cada garrafa, deixando uma pequena abertura para permitir que o excesso de gás sair da garrafa. Cuidado: Espuma pode formar enquanto borbulhando com N2. Ajuste o fluxo de gás de acordo para evitar a produção de espuma.</li>
		<li>Friso selar cada garrafa com a rolha preparada e um selo de alumínio. O selo de alumínio garante que a garrafa permanecerá fechada durante o resto do protocolo.</li>
		<li>Desconectar as agulhas e o tubo fino da estação2 N e substituí-los por agulhas limpas (1 polegada, ≤ 23 G). Ajuste as válvulas do tanque2 N para que um fluxo suave e contínuo de gás sai do tanque (aproximadamente 50 mL/min). Nota: Agulhas maiores que 23G podem deixar buracos unsealable permanentes no batoque.</li>
		<li>Inserir uma das agulhas conectadas ao tanque N2 dentro de uma garrafa de médio porte, a rolha de borracha. Imediatamente, insira outra agulha limpa da mesma garrafa. Repita este passo para as outras garrafas e deixar fluir de2 N por cerca de 30 min substituir o ar nas garrafas por N2.</li>
		<li>Desconecte uma garrafa da estação2 N de retirar a agulha correspondente. Aguarde alguns segundos até que a pressão na garrafa do meio diminui a pressão atmosférica e remover a segunda agulha. Repita este passo para todos os frascos restantes. Cuidado: Para evitar O2 digitando novamente as garrafas do meio de crescimento após a etapa 2.1.4, execute etapas 2.1.4 - 2.1.8 em rápida sucessão. Se todas as garrafas não podem ser conectadas à estação N2 ao mesmo tempo, prosseguir com passos 2.1.4-2.1.8 para o primeiro conjunto de garrafas e em seguida, repita essas etapas para as garrafas restantes.</li>
		<li>Autoclave as garrafas. Deixe esfriar até a temperatura de quarto durante a noite e armazená-los em temperatura ambiente depois.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de meio de cultura líquido para AMB-1 e MS-1<ol>
<li>Prepare uma solução quinate férrico de 10 mM. Primeiro dissolver 0,19 g de ácido quinic em 100 mL de água destilada deionizada e, em seguida, adicione a 0,27 g de FeCl3.6h2O. mexa para dissolver, até à obtenção de uma solução clara, vermelha escura. Autoclave a solução usando um ciclo padrão (pelo menos 15 min de exposição a 121 ° C). Nota: Guarde a solução quinate férrico à temperatura ambiente no escuro como uma solução estéril. Descarte a solução quando um precipitado torna-se óbvio.</li>
		<li>Em um béquer contendo 1 L de água destilada deionizada, adicionar o seguinte em ordem, agitando: 10,0 mL da solução de suplemento de vitamina, 5,0 mL da solução de rastreamento de suplemento mineral, 0,68 g de KH2PO4, 0,848 g de succinato de sódio dibásico hexa-hidratado, 0,575 g de tartarato dissódico di-hidratado, 0,083 g de trihidrato de acetato de sódio, 0,45 mL de 0.1% aquosa resazurina, 0,17 g de NaNO3, 0,04 g de ácido ascórbico e 3,0 mL de 10 milímetros quinate solução III. Nota: Ajuste as quantidades proporcionalmente... se for necessária uma menor quantidade de meio de crescimento. Para uma estação de2 N capaz de subida cinco garrafas ao mesmo tempo, como aquele construído na etapa 1 do presente protocolo, prepare 300 mL de meio. Cuidado: Vitamina, mineral de rastreamento e III quinate soluções estoque precisam ser mantidos estéril. Para evitar contaminação, use padrão técnica estéril e pontas de pipetas estéreis quando dispensar. Armazenar as soluções de vitamina e minerais em uma geladeira a 4 ° C.</li>
		<li>Após a adição de todos os produtos químicos, ajuste o pH a 6,75 usando solução de NaOH 1 M.</li>
		<li>Consulte a 2.1.3-2.1.9 passos para o resto do protocolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de meio de cultura semi-sólido para MSR-1<ol>
<li>Prepare um 0,5 M tampão fosfato solução pH 7.0 dissolvendo 3,362 g de K2HPO4 e 4,178 g de KH2PO4 em 100 mL de água destilada deionizada. Verificar se o pH é de 7.0 e ajustar o pH ligeiramente com KH2PO4 ou NaOH se necessário. Armazene a solução num frasco de vidro selado (preferível plástico para evitar a troca de oxigênio).</li>
		<li>Prepare 100 mL de uma solução de clorídrico 0,02 M. Adicionar 0,2 g de FeCl2.4h2O a esta solução e agitar para dissolver a fim de obter uma solução de cloreto de ferro 10 mM. Armazene a solução no escuro em um frasco de vidro fechado.</li>
		<li>Prepare uma solução de bicarbonato de sódio de 0,8 M, dissolvendo 6,72 g de NaHCO3 em 100 mL de água destilada deionizada. Armazene a solução num frasco de vidro selado.</li>
		<li>Autoclave as soluções preparadas em passos 2.2.1 - 2.2.3 usando um ciclo padrão (pelo menos 15 min de exposição a 121 ° C). Armazená-los como estéril soluções estoque no escuro.</li>
		<li>Em um béquer contendo 1 L de água destilada deionizada, adicionar o seguinte em ordem, agitando: 5 mL da solução de rastreamento de suplemento mineral, 0,2 mL de solução aquosa resazurina de 1%, 0,4 g de NaCl, 0,3 g de NH4Cl, 0,1 g de MgSO4.7h2 O, 0,05 g de CaCl2.2h2O, 1G de succinato de sódio, 0,5 g de acetato de sódio, 0,2 g de levedura extrato e 1,6 g de ágar-ágar.</li>
		<li>Cubra o copo com folha de alumínio e autoclave a solução preparada no passo 2.3.5.</li>
		<li>Pouco antes do fim do ciclo da autoclave, preparar um fresco 4% L-cysteine· HCl· Solução de H2O dissolvendo-se 0,8 g de L-cysteine· HCl· H2O em 20 mL de água destilada deionizada. Neutralize a solução com pH 7,0 com solução de NaOH 5m. Atenção: é importante que a solução de cisteína é preparada fresco para evitar a oxidação da cisteína. Armazenar a solução mineral no frigorífico a 4 ° C.</li>
		<li>Após a autoclavagem, deixe arrefecer até 50-60 ° C, o médio e trazer o copo sob a chama de um bico de Bunsen. Retire o papel alumínio e adicionar rapidamente a seguir em ordem agitando suavemente: 0,5 mL da solução de vitamina, 2,8 mL da solução 3 mL da solução 1,8 mL da unidade populacional de estéril de bicarbonato de sódio, ferro estéril cloreto, fosfato estéril reserva solução e 10 mL de solução de cisteína filtro esterilizado. Nota: Ajuste as quantidades proporcionalmente... se for necessária uma menor quantidade de meio de crescimento. É geralmente conveniente preparar um lote de 120 mL de meio. Atenção: Todas as soluções devem permanecer estéril para uso futuro. Executar etapa 2.3.8 usando uma técnica asséptica padrão e pipeta estéril dicas quando dispensar.</li>
		<li>Após a adição de todos os produtos químicos, transferi o meio quente para 16 mL tampa de rosca estéril Hungate tubos. Transferir 12 mL do meio em cada tubo e selar os tubos. Cuidado: Para evitar contaminação, realize etapa 2.3.9 sob a chama de um bico de Bunsen. Realizá-lo antes que o ágar solidifies, enquanto o meio é a 40 ° C ou acima.</li>
		<li>Deixe os tubos intacta por várias horas até que o ágar solidifies e o OAI torna-se aparente, materializando-se como uma rosa para incolor interface, aproximadamente de 1 a 3 cm abaixo da superfície do meio. Nota: O médio deve girar lentamente incolor no tubo. A quantidade de tempo necessário para esta transição é variável e depende da quantidade de O2 inicialmente dissolvido no meio.</li>
	</ol></li>
</ol>3. inoculação de MTB
Nota: As culturas de cepas AMB-1, MS-1 e MSR-1 podem ser obtidas comercialmente (Tabela de materiais).
Atenção: Execute todas as etapas a seguir em condições estéreis, sob a chama de um bico de Bunsen.
<ol><li>Inoculação de estirpes MSR-1, AMB-1 e MS-1 em meio líquido<ol>
<li>Sele um frasco de soro vazio 125ml com uma rolha de borracha butílica e um selo de friso de alumínio. Insira duas agulhas na garrafa com a rolha e conecte uma seringa preparada como passo 1.7 para um deles. Conecte a seringa de um cilindro de O2 através do mesmo tipo de tubulação usada para a estação de2 N.</li>
		<li>Deixe fluir de2 O através da garrafa por cerca de 30 min, para garantir que todo o ar na garrafa é substituído pelo2. Retire as duas agulhas, permitindo uma ligeira sobrepressão na garrafa e em seguida autoclave. Permitir que a garrafa arrefecer à temperatura ambiente antes do uso. Nota: Para poupar tempo, execute etapas 3.1.1 e 3.1.2 durante a preparação média e autoclave a garrafa junto com o meio ou as soluções estoque.</li>
		<li>Esterilize os topos das rolhas de frasco médio fresco e a garrafa de2 O aplicando algumas gotas de solução de etanol 70% em cima deles e eles passando a chama de um bico de Bunsen.</li>
		<li>Usando uma seringa estéril e uma agulha, extrair a 1 mL de O2 da garrafa2 O e transferi-lo para o frasco médio fresco. Certifique-se que a agulha firmemente se encaixa na seringa durante esta etapa para evitar qualquer ar na seringa.</li>
		<li>Se usando o inóculo de outra cultura cultivada em um frasco de vidro, esterilize as tampas do frasco médio fresco e o frasco de cultura mais antigo, aplicando algumas gotas de solução de etanol 70% em cima deles e eles passando a chama de um bico de Bunsen. Se usando o inóculo de um tubo de cultura congelada, deixe aquecer a temperatura com o tubo selado sob a chama de um bico de Bunsen.</li>
		<li>Se usando o inóculo de outra cultura cultivada em um frasco de vidro, inocule 1 mL da cultura mais velha no meio de fresco. Se usando o inóculo de um estoque congelado, inocule apenas 0,1 mL para diluir o glicerol ou dimetil sulfóxido (DMSO) utilizado no processo de congelamento. Em ambos os casos, use uma agulha estéril e uma seringa estéril.</li>
		<li>Incubar a cultura a 32 ° C e -inocular em meio fresco depois de 4 a 7 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculação do MSR-1 em meio semi-sólido gradiente de O2<ol>
<li>Verifique se o tubo de meio fresco exibe um OAI bem-definidos, materializado por uma rosa para incolor interface.</li>
		<li>Se o inóculo é proveniente de outra cultura semi-sólido2 O de gradiente de concentração, recolher as bactérias por pipetagem 50 μL da cultura com uma ponta de pipeta estéril colocada sobre a banda foi formada pelas bactérias. Inocule lentamente estas bactérias no OAI a fresco médio (interface rosa/incolor), evitando perturbar a interface. Se o inóculo é proveniente de uma cultura congelada, proceda da mesma forma com 100 µ l de inóculo em vez disso.</li>
		<li>Fechar o tubo e deixar que as bactérias crescem entre 25 ° C e 30 ° C. Transferência em meio fresco, usando o mesmo procedimento antes da banda de bactérias atinge a superfície do meio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. observação das bactérias
<ol><li>Esterilize a rolha da garrafa cultura aplicando solução de etanol 70% em cima dela e passá-la através da chama de um bico de Bunsen. Para o meio semi-sólido, abra o tubo sob a chama de um bico de Bunsen. Use uma seringa estéril e uma agulha para extrair as bactérias.</li>
	<li>Uso o enforcamento drop método8 para garantir que as bactérias são magnéticos e motile. Nota: Microscopia de contraste de fase dá grandes resultados, mas não é obrigatória. Ampliações que variam de 10 X a 60 X são adequadas.</li>
	<li>Use a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para observar a estrutura celular e as magnetossomas no detalhe8.</li>
</ol>

<ol><li>Blakemore, R. P. <a target="_blank" href="https://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.mi.36.100182.001245">Magnetotactic bacteria.</a> Annual Reviews in Microbiology. 36 (1), 217-238 (1982).</li>
<li>Uebe, R., Schüler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosome+biogenesis+in+magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Magnetosome biogenesis in magnetotactic bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (10), 621(2016).</li>
<li>Faivre, D., Schuler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetotactic+bacteria+and+magnetosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Magnetotactic bacteria and magnetosomes.</a> Chemical Reviews. 108 (11), 4875-4898 (2008).</li>
<li>Bazylinski, D. A., et al. <a target="_blank" href="https://works.bepress.com/rfrankel/88/">Controlled biomineralization of magnetite (Fe3O4) and greigite (Fe3S4) in a magnetotactic bacterium.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61 (9), 3232-3239 (1995).</li>
<li>Lefèvre, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+magneto-aerotactic+behaviors+and+oxygen+sensing+mechanisms+in+cultured+magnetotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Diversity of magneto-aerotactic behaviors and oxygen sensing mechanisms in cultured magnetotactic bacteria.</a> Biophysical Journal. 107 (2), 527-538 (2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os requisitos específicos O2 concentração de MTB torná-los não-trivial para crescer no laboratório. Uma etapa chave do protocolo para o meio líquido é a remoção inicial de todos O2 do meio a fim de controlar a concentração final, adicionando um volume determinado de O2, só antes da inoculação. Tem sido demonstrado que MSR-1 cresce sob condições aeróbias quase totalmente, no entanto, o magnetismo das células é drasticamente reduzido. Os resultados do mesmo estudo mostraram que as estirpes ...

Bactérias de magnetotactic (MTB) representam uma ampla gama de bactérias Gram-negativas procariontes onipresentes em habitats aquáticos de água doce e Marinha1. Estas bactérias compartilham a capacidade de produzir cristais magnéticos feitos de magnetita (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4), que são na maioria dos casos, montados em cadeias dentro das células. Este motivo estrutural particular é devido à presença de várias proteínas específicas, atuando tanto no citoplasma das bactérias e na membrana lipídica que envolve cada cristal2. Cada cristal individual e suas vesículas de membrana circundante é chamado um magnetosome e está variando em tamanho de cerca de 30 a 50 nm no Magnetospirillum magnetotacticum espécie3. Por causa do arranjo de cadeia de magnetossomas, estas bactérias possuem um momento de dipolo magnético permanente que lhes faz alinhar passivamente aplicados externamente campos magnéticos. Portanto, estas bactérias nadam ativamente ao longo das linhas de campo magnético, atuando como microbússolas automotoras presumivelmente a mais efetivamente localizar as condições mais favoráveis (EG., concentração de O2 ) para o crescimento.
Uma propriedade interessante de MTB é sua capacidade de regular tanto a química e a cristalografia de seus cristais de magnetosome. Maioria das cepas produzem cristais relativamente alta pureza de magnetita ou greigite, embora alguns biomineralizar ambos minerais4. Em todos os casos, as bactérias são capazes de controlar com precisão o tamanho e a forma de seus cristais de único domínio magnético. Isto explica por que uma grande quantidade de pesquisa é realizada para desenvolver um melhor entendimento de como MTB executar esse processo de biomineralização. Compreender esse processo pode permitir que os pesquisadores costurar-fazer nanocristais magnéticos para muitas aplicações comerciais e médicas.
Um obstáculo substancial à extensa pesquisa sobre MTB tem sido a dificuldade de fazê-los crescer em laboratório. A maioria das espécies, incluindo as estirpes utilizadas neste trabalho, são anaeróbias microaerofílicas quando crescido com O2 como um aceitador terminal de electrões. Isto explica por que essas bactérias são mais frequentemente encontradas na zona de transição entre as condições oxic e anóxica (a interface oxic-anóxica, OAI). Isto mostra claramente que MTB têm requisitos de concentração precisos de2 de O que obviamente precisa ser levado em conta quando planear meios de crescimento para esses organismos. Além disso, a grande diversidade existente de MTB implica que vão precisar de diferentes estirpes diferentes tipos de gradientes químicos e nutrientes para alcançar o crescimento ideal.
Neste trabalho, descrevemos os métodos para o cultivo de três o mais extensamente estudada MTB: magneticum Magnetospirillum magnetotacticum (estirpe AMB-1), M. magnetotacticum (MS-1) e M. gryphiswaldense (MSR-1). Estas espécies filogeneticamente pertencem à classe do filo Proteobacteria Alphaproteobacteria , são helicoidais em morfologia e possuem um flagelo polar em cada extremidade da célula. Nós fornecemos os protocolos para o cultivo de estirpe MSR-1 em líquido e O gradiente de concentração semi-sólido mídia2 , com base em receitas médias publicados anteriormente5,6. Também apresentamos um protocolo detalhado para o cultivo de cepas AMB-1 e MS-1 em modificados magnético Spirillum crescimento médio (MGSM)7.

<table><tbody><tr><td>Coleção de Cultura de Tipo Americano AMB-1</td><td>(ATCC)</td><td>ATCC 700264</td><td></td></tr><tr><td>MS-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC 31632&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MSR-1</td><td>Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)</td><td>DSM 6361</td><td></td></tr><tr><td>Citrato férrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3388-250G</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de oligoelementos</td><td>ATCC</td><td>MD-TMS</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD</td><td>PX1565-1</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4,7 H2O</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop Canada Inc</td><td>HEP001.250</td><td></td></tr><tr><td>NaNO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5506-250G</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Fischer scientific</td><td>DF210929</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Fischer scientific</td><td>DF0436-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Solução de L-lactato de potássio (60%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60389-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)-Ácido quínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>138622</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3.6H2O</td><td>Fischer scientific</td><td>I88-100</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento vitamínico</td><td>ATCC</td><td>MD-VS</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de sódio hexahidratado</td><td>Fischer scientific</td><td>S413-500</td><td></td></tr><tr><td>L-tartarato de sódio di-hidrato dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228729-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sódio tri-hidratado</td><td>EMD</td><td>SX0255-1</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Difco</td><td>0704-13</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-25G</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Caledon</td><td>6620-1-65</td><td></td></tr><tr><td>FeCl2 .4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44939-250G</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sódio</td><td>EMD</td><td>SX0320-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td></td><td>EMD 1011450500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>EMD</td><td>1023820500</td><td></td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>FB0010</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína.HCl.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>Seringas de 1,0 mL</td><td>Fischer scientific</td><td>B309659</td><td></td></tr><tr><td>25G&nbsp; x 1 agulhas</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>frascos de soro de 125 mL</td><td>Selos de alumínio Wheaton</td><td>223748</td><td></td></tr><tr><td>20 mm</td><td>Wheaton</td><td>224223-01</td><td></td></tr><tr><td>Crimpador E-Z</td><td>Wheaton</td><td>W225303</td><td></td></tr><tr><td>Rolhas de borracha butílica</td> de 20 mm <td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2048-11800</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Hungate</td><td>Chemglass (VWR)</td><td>CLS-4208-01</td><td></td></tr><tr><td>Rolha de septo, 13mm, Hungate</td><td>Bellco Glass, Inc.</td><td>2047-11600</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultura de vidro</td><td>Corning (VWR)</td><td>9826-16X</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico 36,5-38%, BioReagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>11,6 - 12 N</td></tr></tbody></table>

crescimento de bactérias de magnetotactic do género magnetospirillum magnetotacticum: cepas msr-1, amb-1 e ms-1

Growing Magnetotactic Bacteria of the Genus Magnetospirillum: Strains MSR-1, AMB-1 and MS-1

Bactérias de magnetotactic são Gram-negativas, motile, principalmente aquáticos procariontes onipresentes em habitats de água doce e marinhos. Eles são caracterizados pela sua capacidade de biomineralizar magnetossomas, que são magnéticos nanômetros de tamanho cristais de magnetita (Fe3O4) ou greigite (Fe3S4) rodeados por uma membrana de bicamada lipídica, dentro deles citoplasma. Para a maioria das bactérias de magnetotactic conhecido, magnetossomas são montadas em correntes dentro do citoplasma, desse modo, conferindo um momento de dipolo magnético permanente para as células e levando-os a alinhar passivamente com campos magnéticos externos. Devido a estas características específicas, bactérias de magnetotactic tem um grande potencial para aplicações comerciais e médicos. No entanto, a maioria das espécies são microaerófila e ter O2 concentração requisitos específicos, tornando-os mais difíceis de crescer, rotineiramente, do que muitas outras bactérias tais como Escherichia coli. Aqui nós apresentamos protocolos detalhados para o cultivo de três das estirpes de bactérias de magnetotactic, todas pertencentes ao gênero Magnetospirillum magnetotacticummais amplamente estudadas. Estes métodos permitem o controle preciso da concentração2 O disponibilizado para as bactérias, a fim de assegurar que eles crescem normalmente e sintetizam magnetossomas. Crescimento de bactérias de magnetotactic para estudos adicionais usando estes procedimentos não exige o experimentalista deve ser um especialista em microbiologia. Os métodos gerais apresentados neste artigo também podem ser usados para isolar e cultura a outras bactérias de magnetotactic, embora seja provável que a composição química de mídia de crescimento precisará ser modificado.

Preparação de sucesso da mídia crescimento pode ser avaliada como segue. No final do processo, desmarque soluções (i. e., livre de qualquer precipitado) deve ser obtida (isto é verdade para o meio líquido e o meio O2 gradiente semi-sólido). Uma foto mostrando o aspecto esperado de meio líquido MSR-1 antes de inoculação pode ser vista na Figura 2a. Sucesso O2 gradiente de concentração semi meio sólido é sinalizado pela formação d...

Apresentamos um procedimento para o cultivo de várias estirpes de Magnetospirillum magnetotacticum em dois tipos diferentes de meios de crescimento. Magnetospirillum magnetotacticum gryphiswaldense estirpe MSR-1 é cultivado em líquido e O gradiente de concentração de2 meios semi-sólidos enquanto cepa de M. magneticum AMB-1 e M. magnetotacticum cepa MS-1 são cultivadas em meio líquido.

Crescimento de bactérias de Magnetotactic do género Magnetospirillum magnetotacticum: cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1

Magnetotactic bacteria are Gram-negative, motile, mainly aquatic prokaryotes ubiquitous in freshwater and marine habitats. They are characterized by their ...

Este método permite o cultivo de três espécies diferentes de bactérias magnetotacticas chamadas MSR-1, AMB-1 e MS-1. Todas as espécies de água doce, e todas do gênero magnetospirillum. É um primeiro passo essencial para qualquer tipo de pesquisa reprodutível envolvendo esses organismos.As bactérias magnetotacticas têm requisitos de oxigênio muito específicos, e é por isso que desenvolveram um sistema de navegação magnética. Por isso, é muito importante controlar a quantidade de oxigênio disponível para eles. Todo este protocolo foi otimizado para algumas cepas específicas de magnetospirilla de água doce.Seus detalhes podem ser otimizados para acomodar os requisitos de oxigênio e nutrientes de outras bactérias magnetotacticas. Instale com segurança um tanque de gás nitrogênio perto de um banco no qual há espaço suficiente para configurar a estação de nitrogênio. Conecte um pedaço de tubo ao tanque que é tempo suficiente para chegar à área onde a estação será construída.Se necessário, aplique fita Teflon na saída do tanque para evitar qualquer vazamento. Para construir uma estação capaz de borbulhar cinco garrafas de meio ao mesmo tempo, corte quatro pedaços de tubulação de aproximadamente cinco centímetros de comprimento. Monte os pedaços de tubo em uma linha com três encaixes plásticos em forma de T de 3 vias.Conecte uma extremidade desta linha ao pedaço de tubo na saída do tanque de nitrogênio através de um encaixe extra em forma de T. Adicione um encaixe de cotovelo de 90 graus na outra extremidade. Use fita adesiva para anexar a estrutura a uma haste metálica horizontal colocada aproximadamente 30 centímetros acima do banco.Conecte cinco pedaços de tubulação de aproximadamente 20 centímetros de comprimento às três saídas dos encaixes instalados. Remova os pistões de cinco seringas plásticas de um mililitro e corte a extremidade maior dessas seringas, mantendo apenas a parte graduada. Encha essas seringas com algodão, tomando cuidado para não embalar muito bem.Insira as seringas nos pedaços verticais de tubo de 20 centímetros de comprimento. Ligue o gás e use água com sabão para garantir que não haja vazamento quando o nitrogênio estiver fluindo. Remova as tampas de cinco agulhas de calibre 25 e insira essas agulhas em pedaços de 10 centímetros de tubulação fina.Coloque as agulhas preparadas nas seringas da estação de nitrogênio. Certifique-se de que o nitrogênio está fluindo através das cinco linhas, e mantenha a estação em espera. Prepare uma solução de citrato ferrico de 10 mililitros adicionando 0,245 gramas de citrato férrico a 100 mililitros de água destilada desionizada.Aqueça e mexa para dissolver até obter uma solução laranja clara. Autoclave a solução usando um ciclo padrão de pelo menos 15 minutos de exposição a 121 graus Celsius antes de armazenar a solução de estoque esterilizada à temperatura ambiente no escuro. Para preparar cinco garrafas de meio de crescimento líquido para MSR-1, adicione os produtos químicos listados em um protocolo de texto a um béquer contendo 300 mililitros de água destilada desofilada.A adição do citrato estéril e das soluções minerais deve ser realizada sob a chama de um queimador Bunsen usando técnicas estéreis. Condições estéreis são essenciais para evitar a contaminação da cultura por outras espécies bacterianas. Após a adição de todos os produtos químicos, ajuste o pH para 7.0 com uma solução de hidróxido de sódio molar.Distribua o meio recém-preparado em garrafas de soro de 125 mililitros, despejando 60 mililitros de meio em cada garrafa. Bolha de nitrogênio no meio por 30 minutos para remover o oxigênio dissolvido usando o pequeno tubo conectado à estação de nitrogênio. Coloque uma rolha de borracha de butyl em cima de cada garrafa, deixando uma pequena abertura para permitir que o excesso de gás saia da garrafa.Após 30 minutos, sele cada garrafa com a rolha preparada e um selo de alumínio. O selo de alumínio garante que a garrafa permaneça selada durante o resto do protocolo. Desconecte as agulhas e o tubo fino da estação de nitrogênio e substitua-as por agulhas limpas.Ajuste as válvulas do tanque de nitrogênio para que um fluxo suave e contínuo de gás saia do tanque. Agora, insira uma das agulhas conectadas ao tanque de nitrogênio em uma garrafa de meio através da rolha de borracha. Insira imediatamente outra agulha limpa na mesma garrafa.Repita este passo para as outras garrafas e deixe o nitrogênio fluir por cerca de 30 minutos para substituir o ar nas garrafas por nitrogênio. Após 30 minutos, desconecte uma garrafa da estação de nitrogênio removendo a agulha correspondente. Aguarde alguns segundos até que a pressão na garrafa de médio diminua para pressão atmosférica e remova a segunda agulha.Repita este passo para todas as garrafas restantes. Para preparar 120 mililitros de meio de crescimento semisólida para MSR-1, cubra o béquer com papel alumínio e autoclave a solução preparada conforme descrito no protocolo de texto. Pouco antes do fim do ciclo da autoclave, prepare uma nova solução de cisteína de 4% e ajuste o pH para 7.0 com uma solução de hidróxido de sódio molar de cinco molares, conforme descrito no protocolo de texto.Depois de autoclaving, deixe o meio esfriar até 50 a 60 graus Celsius, e leve o béquer sob a chama de um queimador bunsen. Remova a folha de alumínio e adicione rapidamente os produtos químicos listados no protocolo de texto usando técnicas estéreis enquanto mexe suavemente. Adicione 1,2 mililitros de solução de cisteína esterilizada por filtro.Após a adição de todos os produtos químicos, transfira o meio quente para tubos de chave estéril de 16 mililitros. Transfira 12 mililitros do meio para cada tubo e sele os tubos. Para inocular as cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1 em meio líquido, inflama os topos do oxigênio e garrafas médias frescas aplicando etanol nas rolhas e passando-os através da chama de um queimador Bunsen.Usando uma seringa estéril e uma agulha, extraia um mililitro de oxigênio da garrafa de oxigênio e transfira-o para a garrafa média fresca. Se usar o inóculo de outra cultura cultivada em uma garrafa de vidro, inflama as duas garrafas. Em seguida, inocular um mililitro da cultura mais antiga para o meio fresco.Incubar a cultura a 32 graus Celsius, e inocula-a em meio fresco após quatro a sete dias. Para inocular o MSR-1 no gradiente de oxigênio, meio semisólido, verifique se o tubo de meio fresco exibe um OAI bem definido, materializado por uma interface rosa a incolor cerca de um a três centímetros abaixo da superfície do meio. Se o inóculo vem de outra cultura semisódica gradiente de concentração de oxigênio, colmeia as bactérias aspirando 50 microliters da cultura com uma ponta de pipeta estéril colocada na faixa formada pela bactéria.Inocular lentamente essas bactérias no OAI no meio fresco, evitando perturbar a interface. Sele o tubo e deixe as bactérias crescerem entre 25 graus Celsius e 30 graus Celsius. Para garantir que as bactérias sejam magnéticas e modais, coloque uma gota de cultura no deslizamento da tampa do microscópio.Gire o deslizamento da tampa e instale-o em um anel O descansando em um slide de vidro. Certifique-se de que a gota não toque no slide inferior. Coloque a gota pendurada sob um microscópio e concentre-se em uma borda da gota.Coloque o polo sul de um ímã perto dessa borda, e observe as bactérias nadarem em direção à borda. Vire o ímã para fazê-los nadar na direção oposta. Aqui são mostradas as garrafas de mídia líquida antes da inoculação e após o crescimento bacteriano.A turbidez na segunda garrafa indica que as bactérias estão crescendo. Este filme duas vezes acelerado mostra o resultado esperado de um experimento de queda suspensa para uma cultura de bactérias magnetotacticas modais e magnéticas. As bactérias inicialmente nadaram em direção à borda da gotícula quando um campo magnético é aplicado.Quando a direção do campo do ímã é invertida, as bactérias nadaram para longe da borda onde o campo magnético é aplicado. Aqui são mostrados tubos de meio semisólido antes da inoculação e após o crescimento bacteriano. Como esperado, um grupo de bactérias se forma na interface oxico-anoxic e migra ao longo do tempo à medida que o oxigênio é consumido e a interface se move para cima.Mostrado aqui é um micrografo eletrônico representativo de um espi trilhão magnético. A flagela é indicada pelas setas negras, enquanto as setas vermelhas mostram os magnetosmos. Ao tentar este procedimento, é muito importante lembrar que as bactérias magnetotacticas têm requisitos muito específicos de nível de oxigênio, a fim de crescer adequadamente e produzir magnetosome.Este protocolo mostra como controlar e monitorar os níveis de oxigênio na mídia de crescimento, a fim de alcançar as micro condições preferidas por esses organismos. Seguindo este método, altas concentrações de células saudáveis e altamente magnéticas podem ser obtidas. Dessa forma, podem ser realizados experimentos que requerem grandes quantidades de bactérias, como extração magnetômica, estudos genômicos e genéticos, ou observação do movimento coletivo por microscopia.A possibilidade de cultivar bactérias magnetotacticas em laboratório é realmente o que permitiu aos cientistas explorar de forma sistemática as fascinantes propriedades bioquímicas e físicas desses organismos.

growing-magnetotactic-bacteria-genus-magnetospirillum-strains-msr-1

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Fonte: Le Nagard, L., et al. Bactérias magnetotáticas em crescimento do gênero Magnetospirillum: Cepas MSR-1, AMB-1 e MS-1. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra como cultivar bactérias Magnetospirillum em condições microaeróbicas usando meios líquidos e semissólidos. Ele destaca a formação de uma banda bacteriana visível na interface óxico-anóxica e sua migração ascendente à medida que o oxigênio se esgota. O vídeo também mostra como avaliar o comportamento magnetotático observando a...

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