Name: Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a caracterizar interações proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e termoforese de microescala (MST). Este protocolo eficiente permite analisar dinâmicas moleculares e afinidades de ligação em nível atômico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este projecto foi apoiado pelo RGPIN NSERC-2018-04994, programa de inovação Campus Alberta (RCP-12-002 C) e Alberta prião Research Institute / Alberta inova Bio soluções (201600018), atribuído a Otávio e genoma Canadá e Fundação do Canadá para Subsídios de inovação atribuídos para o centro de inovação de Metabolomics (TMIC) e NANUC.

<ol><li>Vinogradova, O., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+unique+tool+in+assessment+and+complex+determination+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NMR as a unique tool in assessment and complex determination of weak protein-protein interactions.</a> Topics in Current Chemistry. 326, 35-45 (2012).</li>
<li>McKercher, M. A., Wuttke, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+Chemical+Shift+Mapping+of+SH2+Peptide+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">NMR Chemical Shift Mapping of SH2 Peptide Interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 1555, Clifton, N.J. 269-290 (2017).</li>
<li>Al-Jassar, C., Bikker, H., Overduin, M., Chidgey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Basis+of+Desmosome-Targeted+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Basis of Desmosome-Targeted Diseases.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (21), 4006-4022 (2013).</li>
<li>Fogl, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intermediate+filament+recognition+by+plakin+repeat+domains+revealed+by+envoplakin+targeting+of+vimentin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intermediate filament recognition by plakin repeat domains revealed by envoplakin targeting of vimentin.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. Walker, J. M. , 2nd ed, Humana Press. (2002).</li>
<li>Wishart, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H%2C+13C+and+15N+chemical+shift+referencing+in+biomolecular+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">1H, 13C and 15N chemical shift referencing in biomolecular NMR.</a> J. Biomol. NMR. 6, 135-140 (1995).</li>
<li>Casali, N. Escherichia coli Host Strains. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCasali%2C+N+%22E.+coli+Plasmid+Vectors%22">E. coli Plasmid Vectors</a>. , Humana Press. 27-48 (2003).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).</li>
<li>Kozak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+samples+for+NMR+using+thermal+shift+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Nmr%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays.</a> Journal of Biomolecular Nmr. 64, 281-289 (2016).</li>
<li>Burgess, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+practical+review+of+size+exclusion+chromatography%3A+Rules+of+thumb%2C+limitations%2C+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting.</a> Protein Expression and Purification. , In Press (2018).</li>
<li>Kunji, E. R. S., Harding, M., Butler, P. J. G., Akamine, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+molecular+mass+and+dimensions+of+membrane+proteins+by+size+exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determination of the molecular mass and dimensions of membrane proteins by size exclusion chromatography.</a> Methods. 46 (2), 62-72 (2008).</li>
<li>Stetefeld, J., McKenna, S. A., Patel, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+light+scattering%3A+a+practical+guide+and+applications+in+biomedical+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Dynamic light scattering: a practical guide and applications in biomedical sciences.</a> Biophysical Reviews. 8 (4), 409-427 (2016).</li>
<li>Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+ultracentrifugation%3A+A+versatile+tool+for+the+characterisation+of+macromolecular+complexes+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution.</a> Methods. 95, 55-61 (2016).</li>
<li>Pearson, J. Z., et al. Chapter One - Next-Generation AUC Adds a Spectral Dimension: Development of Multiwavelength Detectors for the Analytical Ultracentrifuge. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915003936">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 1-26 (2015).</li>
<li>Gorbet, G. E., Pearson, J. Z., Demeler, A. K., Cölfen, H., Demeler, B. Chapter Two - Next-Generation AUC: Analysis of Multiwavelength Analytical Ultracentrifugation Data. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687915002980">Methods in Enzymology</a>. Cole, J. L. 562, Academic Press. 27-47 (2015).</li>
<li>Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-binding+assays+in+biological+liquids+using+microscale+thermophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis.</a> Nature Communications. 1, 100(2010).</li>
<li>Jerabek-Willemsen, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022286014002750">MicroScale Thermophoresis: Interaction analysis and beyond.</a> Journal of Molecular Structure. 1077, 101-113 (2014).</li>
</ol>

Os autores divulgar sem conflitos de interesse.

O 2D 15experiência NMR N-resolvido é um dos mais amplamente utilizados métodos para mostrar como duas moléculas interagem. É o método mais ricos em informação que permite que os sinais de ambos os parceiros a serem monitorados continuamente ao longo de uma experiência de titulação no estado de solução. Embora normalmente qualitativa no caso de grandes complexos, o método também pode ser usado em casos favoráveis para medir afinidades de ligação onde sinais NMR podem ser rastreados em espectros de alta resolução. Onde as atribuições podem ser feitas convenientemente, como no caso de muitas proteínas sob 20 kDa em tamanho, os sítios de ligação também podem ser mapeados. Ensaios complementares tais como MST fornecem informações quantitativas sobre interações em solução e requerem menos proteína nos Estados sem rótulo. Comparação de mutante de ligação de dados é útil para fornecer controles para garantir que interações evidenciadas pela linha NMR alargamento são genuínas e não artefatos de, por exemplo, alterações de agregação ou viscosidade.
Expressão da proteína
Agilizando o processo de expressão reduz a quantidade de produção de proteína intensivo de mão de obra. Parte deste processo de otimização envolve a identificação de uma tensão adequada de e. coli para a expressão recombinante da proteína. Preferência de tensão depende de elementos, incluindo a natureza do vetor em uso e, mais especificamente, a estabilidade final da proteína recombinante está sendo expresso7. O risco de degradação da proteína heteróloga por endógena Escherichia coli proteases podem ser reduzidos pelo uso de protease deficiente Escherichia coli como a estirpe BL21. Para genes contendo códons raros, uma estirpe como RIPL BL21-CodonPlus (DE3) pode ser preferida. Esta estirpe combina a natureza de protease deficiente da estirpe BL21 com cópias adicionais de endógenas de tRNAs códon rara de leucina, isoleucina, prolina e arginina. Alternativamente, códons raros que podem comprometer a superexpressão podem ser evitadas por encomendar uma construção códon otimizado de uma fonte comercial. Muitas cepas de e. coli estão disponíveis para a expressão do gene recombinante, cada um otimizado para evasão de um problema específico durante a expressão7. No caso deste estudo, a estirpe de padrão protease deficiente BL21(DE3) produzido quantidades adequadas de proteína solúvel para purificação subsequente e análise.
Purificação de proteínas
O protocolo de purificação para uma proteína dada frequentemente é único no sentido de que cada proteína permanece estável e solúvel em diferentes condições como temperatura, concentração de sal ou pH. A eficácia global da purificação por cromatografia de afinidade também é sensível à concentração de eluição espécies como imidazol em várias etapas durante o processo de purificação. Neste trabalho, condições de reserva crítica para IMAC foram pH para o E-PRD e concentração de imidazol para o VimRod. Um pH de 7,5 foi necessário para evitar a precipitação do PRD-E após eluição inicial da coluna IMAC. Para a purificação do IMAC de VimRod, aumentando a concentração de imidazole de 30 a 50 mM durante a etapa de lavagem da coluna foi encontrado para ter uma melhoria substancial na pureza das frações eluição final. Para a etapa de eluição, também aumentando a concentração de imidazole de 250 a 350 mM foi encontrado para melhorar o rendimento da eluição final. Tentativas iniciais para eluir proteína usando imidazol 250mm levaram a eluição incompleta de VimRod como revelado por uma tira de imidazol 1m final da coluna (dados não mostrados). Aumentando a concentração de imidazol para 350 mM para a eluição foi suficiente para recuperar toda a proteína associada à coluna. S pode servir a um propósito duplo porque actua como uma etapa de polimento para purificação de proteínas, enquanto simultaneamente, realizando troca de amortecedor. Troca de amortecedor é um passo crítico para análise posterior ligação desde que ele remove o imidazol usada para eluir a proteína His6-tag. Serve também como uma oportunidade para alterar condições tais como a concentração de sal ou pH, que pode afetar a eficácia de certas técnicas de jusante ou ensaios. Proteína térmico turno (PTS) pode ser usado para identificar buffers ideais para ensaios a jusante, especialmente para aqueles que exigem uma proteína estável para prolongados períodos de tempo em temperatura ambiente8,9.
Análise de ligação
Proteína que é preparada é fundamental para os ensaios de ligação exata, embora congelada proteína também pode ser usada desde que os resultados são comparados. Proteínas filamentosas como vimentina multimerize forma um sal e pH dependentes, e, portanto, a solução condição precisa ser otimizado e oligoméricos estado estimado por um método como SEC10,11, dinâmica de espalhamento de luz 12 ou ultracentrifugação analítica13,14,15. Espectroscopia RMN é adequada para medir as interações ligante de pequenas proteínas em resolução atômica. No entanto, quando uma proteína interage com a molécula maior, segue-se o tombo mais lento, e isso resulta em perda de sinais, que pode confirmar a vinculação, embora isso não necessariamente permitem mapeamento de binding sites, que também exigiria a atribuição pelo menos espinha dorsal ressonâncias. Neste cenário, experiências NMR não permitir a identificação do site da interação. Daí o local dirigido mutagênese é aplicado para identificar os resíduos críticos necessários para a ligação. Tais mutantes, portanto, não apresentam perda de sinal. Neste protocolo, uma forma mutante com uma substituição na posição 1914 retém as intensidades de pico na presença de VimRod e, por conseguinte, confirma o rompimento da interação do E-PRD e VimRod. Atribuição de espinha dorsal e sidechain ressonâncias gostaria de acrescentar valor a esta abordagem, particularmente como a estrutura para o livre E-PRD foi resolvida por cristalografia de raios x4. Futuras aplicações de NMR incluem caracterização de interações complexas entre moléculas maiores e beneficiarão de ultra altos ímãs de campo e o uso de outros grupos observáveis como 13C-etiquetadas e trifluoro metil grupos como repórteres.
MST tem uma série de vantagens para o estudo de interações de ligação16. Os parceiros de ligação são livres em solução e não imobilizado. Análise da qualidade das amostras é incorporado o software com controle de qualidade, relatórios de agregação, adsorção aos capilares ou rotulagem fluorescente insuficiente da molécula alvo. Pequenas quantidades do alvo são normalmente utilizadas, a concentração do alvo etiquetado é geralmente entre 20-50 nM em 10-20 μL volume/reação. Este protocolo utiliza volumes de reação muito pequeno (10 μL) para maximizar a concentração de ligante que pode ser alcançado nas titulações permitindo interações fraca ligação ser caracterizada. Isto necessita de pipetagem precisos e cuidado para evitar a introdução de bolhas enquanto ainda completamente a mistura. Mistura adequada é fundamental para a medição de fluorescência exata, consistente ao longo do conjunto de diluições em série. A quantidade de Tween-20 nas experiências de MST foi reduzida de um padrão de 0,05% a 0,015% para reduzir a tendência para criar bolhas e melhorar a mistura.
O corante vermelho-Tris-NTA fornece uma maneira rápida, fácil e conveniente de fluorescente rotular qualquer proteína que tem a sua marca. A rotulagem é efetivamente completo em apenas 30 minutos e é muito apertado para que nenhum procedimento de remoção do corante é necessário. Sem modificações são feitas para resíduos de aminoácidos na proteína que podem alterar as propriedades de ligação do ligante. Uma ressalva é que apenas a proteína a ser rotulado deve ter uma marca de His6. Isto exigiu a clivagem da marca desde a proteína ligante, E-PRD e a remoção da marca e E-PRD uncleaved com uma segunda etapa de coluna do IMAC. Se possível, a proteína ligante deve ser preparada sem o uso de uma sua marca. Alternativamente, as proteínas podem ser rotuladas covalentemente com um fluoróforo através de amina acoplamento de resíduos de lisina ou tiol acoplamento a resíduos de cisteína. No entanto, deve ter cuidado quando se utilizam esses sistemas desde a ligação covalente de um fluoróforo pode afetar as interações de ligação eletrostática ou polar confiando em resíduos de lisina ou a cisteína. A quantificação de vinculação afinidade entre o VimRod e E-PRD pelo MST foi extraordinariamente sensível à concentração de sal. Este problema foi atenuado pelo dializando inicialmente o alvo e ligante no mesmo lote do buffer de ensaio. Não obstante, saturação da curva de ligação do MST não poderia ser alcançada, ao realizar o ensaio de MST na presença de 150 mM de NaCl devido ao comportamento de complexo de VimRod. Confiáveis e completos de dados obteve-se uma vez que a concentração de NaCl foi reduzida a 10 mM, permitindo o cálculo exacto do KD. Portanto, cuidadosa otimização das condições de solução e comparação com ensaios complementares são recomendados para alcançar resultados robustos. Além disso, o MST pode ser utilizado para quantificar a dependência de sal para uma determinada interação, quantificar Propriedades estequiométricas de interações da proteína, monitor do enrolamento de proteínas e sonda em cinética de enzima17.

Interações entre proteínas permitem a formação de máquinas moleculares que criam ordem dentro das células. As interações individuais muitas vezes são fracas, mas geralmente contribuem para multivalentes complexos que podem ser dinamicamente regulamentado e cooperativo. Ensaios sensíveis que fornecem resolução atômica e informações quantitativas sobre tais interações complexas são necessários para deduzir os mecanismos e projetar intervenções como droga-como moléculas. Espectroscopia RMN é um método eficiente para a obtenção de tais informações sobre as interações da proteína e também é usada para o rastreio rápido para ligantes, incluindo aqueles que se ligam fracamente1. Os métodos NMR usados podem ser categorizados em aqueles que são proteínas observar ou ligante observar. Este manuscrito usa a primeira abordagem, em que é adquirido um espectro de um isótopo estável-rotulado de proteína que é comparativamente pequena (geralmente sob 20 kDa) e o ligante sem rótulo é titulado. Isto permitir que os resíduos rotulados envolvidos na interação a serem mapeados em casos favoráveis. Uma vez as formas complexas, há mudanças na forma de seus sinais NMR e os ambientes químicos de resíduos de interação que se manifestam como alterações na mudança química. A extensão de tais mudanças se correlaciona com o grau de envolvimento destes grupos na interação. Perturbações de deslocamento químico (CSPs) podem ser medidas comparando uma série de espectros NMR da proteína coletados na ausência e presença de quantidades variáveis do ligante. Para maiores ligantes ou interações complexas, a mudança na forma de pico ou intensidade pode ser medida para deduzir as interações.
O experimento 2D mais comum usado para detectar interações ligante é a 15N-heteronuclear quântica única correlação (HSQC) experimento2. Isso requer que uma proteína uniformemente ser rotulado com 15N, que é normalmente conseguida expressá-los como versões de afinidade-tag em Escherichia coli culturas bacterianas crescidas em 15N-enriquecido de mídia. Vinculação é aparente quando os espectros HSQC coletados durante a titulação são sobrepostos, revelando mudanças de pico para um subconjunto dos resíduos envolvidos na formação da complexa. A interação pode ocorrer no regime de troca rápida, onde os sinais de estado livre e ligante saturada colapsam em uma população média de pico. Como alternativa, no caso de troca lenta entre os Estados, ambos os sinais são observados com integrais que representam suas quantidades relativas. Enquanto NMR lineshape análise pode ser usada para estimar as afinidades de ligação, em alguns casos, métodos tais como o MST também provaram ser convenientes e fornecem validação cruzada das interações genuínas.
O exemplo fornecido é de duas proteínas encontradas dentro desmossomas. Eles mediam as junções entre as superfícies da célula e o citoesqueleto e mediam multivalentes interações entre máquinas de adesão celular e filamentos intermediários para manter a integridade da pele e tecidos do coração e resistindo de forças de cisalhamento. Doenças podem resultar quando desmosomal proteínas tais como desmoplakin ou vimentina estão comprometidas por mutações ou auto-anticorpos, levando a desestabilização das junções célula-célula, e, portanto, suas interações são de importância crítica3. A base estrutural de ligação do ligante por proteínas de desmosomal pode ser caracterizada por espectroscopia de RMN, enquanto as interações podem ser quantificadas pelo MST. Métodos aqui foram usados para caracterizar as interações entre domínios repetição plakin (PRDs) que muitas vezes estão presentes como conjuntos em tandem que oferecem básicos sulcos e vimentina, um filamento intermediário que interage através de uma superfície ácida oferecida pela sua helicoidal pacote4. Estes complexos são formados na membrana da célula onde eles de ancoragem para os filamentos intermediários do citoesqueleto celular para desmossomas que conectam células adjacentes, formando assim uma rede de ligações adesivas que irradia ao longo de um tecido.

<table><tbody><tr><td>Monolith NT.115, inclui software de controle e análise</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-G008</td><td>Instrumento para termoforese microscal</td></tr><tr><td>Kit de Rotulagem His-Tag RED-Tris-NTA</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-L008</td><td>Corante RED-tris-NTA para MST</td></tr><tr><td>Capilares padrão</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>MO-K022</td><td>capilares para MST</td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17524801</td><td>coluna IMAC</td></tr><tr><td>Resina HisPur Ni-NTA, 100 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88222</td><td>Resina IMAC</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28989333</td><td>coluna SEC</td></tr><tr><td>TEV protease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4455</td><td>clivagem de sua etiqueta de E-PRD</td></tr><tr><td>BL21(DE3) Competente E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527H</td><td>células para expressão de proteínas</td></tr><tr><td>comprimidos de cocktail de inibidores de protease completos Sigma</td><td>Aldrich</td><td>11873580001</td><td>inibidores de protease para purificação de proteínas por IMAC</td></tr><tr><td>TCEP, cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706</td><td>agente redutor para purificação de proteínas</td></tr><tr><td>Reagentes (HEPES, NaCl, etc)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>vários</td><td>Preparação de meios e tampões</td></tr><tr><td>Cloreto de amônio (15N, 99%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>NLM-467</td><td>marcação de isótopos para RMN</td></tr><tr><td>D2O, óxido de deutério (D, 99,8%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-2259</td><td>preparação de amostra de RMN</td></tr><tr><td>DSS, 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato-D6 de sódio (D,98%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-8206</td><td>referência para Precisão de RMN</td></tr><tr><td>Tubos de RMN de 5 mm, tubos</td><td>SJM/Deuterotubes</td> de 7" de comprimento <td>BOROECO-5-7</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de RMN (14,1 Tesla)</td><td>Bruker</td><td></td><td>aquisição de dados de RMN</td></tr><tr><td>Sonda criogénica TCI 5mm z-PFG</td><td>Bruker</td><td></td><td>aquisição de dados de RMN</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker TopSpin 4.0.1</td><td>Processamento Bruker</td><td></td><td>de dados de RMN</td></tr><tr><td>MO. Controle</td><td>as tecnologias</td><td></td> NanoTemper <td>incluídas no Monlith NT.115</td></tr><tr><td>MO. Análise de afinidade</td><td>Tecnologias NanoTemper</td><td></td><td>incluídas no Monlith NT.115</td></tr></tbody></table>

interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (nmr) e thermophoresis de microescala (mst) de medição

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Proteínas filamentosas como vimentina fornecem organização dentro das células, fornecendo um andaime estrutural com sites que ligam proteínas contendo plakin repete. Aqui, um protocolo para a detecção e medição de tais interações é descrito usando o domínio globular plakin de envoplakin e a bobina helicoidal da vimentina. Isto fornece uma base para determinar se uma proteína liga vimentina (ou proteínas filamentosas semelhantes) e medição da afinidade da interação. A proteína globular de interesse é rotulada com 15N e titulada com proteína vimentina em solução. Um espectro de NMR bidimensional é adquirido para detectar interações observando alterações na forma de pico ou mudanças químicas e para elucidar os efeitos das condições de solução, incluindo os níveis de sal, que influenciam a estrutura quaternária vimentina. Se a proteína de interesse vincula o ligante filamentoso, a interação de ligação é quantificada pelo MST usando as proteínas purified. A abordagem é uma maneira simples para determinar se uma proteína de interesse vincula um filamento e avaliar como alterações, tais como mutações ou condições de solução, afetam a interação.

O domínio E-PRD (resíduos 1822-2014 clonados em pProEX-HTC) do gene da envoplakin humana e o domínio de VimRod (resíduos clonado em pET21a 99-249) de vimentina humana4 foram expressas com tags His6 e purificado. Figura 6 e Figura 7 demonstram os níveis de pureza de VimRod (18,8 kDa) e E-PRD (21,8 kDa) é obtido por este método de purificação de proteínas. A remoção do His6 marca de construção de E-PRD é essencial para as experiências do MST, como a proteína VimRod está identificada usando um corante de vinculação de marca His6 e qualquer PRD-E mantendo sua marca de His6 pode competir para ligação do corante. A segunda coluna IMAC após a clivagem da tag com protease TEV remove a protease do PEV, a tag clivada e qualquer uncleaved His6-E-PRD que permaneceu. A etapa de polimento final da purificação é cromatografia de exclusão. Apesar de ambas as proteínas ser de um tamanho similar, o VimRod elutes da coluna em um 51 mL, enquanto que o pico de eluição E-PRD é centrado em 72 mL onde se esperaria um monômero de proteína deste tamanho. O aparente aumento no tamanho do VimRod é provavelmente devido às suas características como uma vara longa filamentosa em forma de proteína como analiticamente experimentos se demonstraram que o VimRod era monomérico4. Rendimentos mais baixos de proteína são obtidos a partir das culturas cultivadas em M9 do que aqueles de caldo de carne rico devido a uma menor quantidade de células, sendo produzido na mídia mínima. O crescimento inicial das maiores fermentos para preparações M9 em TB permite a melhoria dos rendimentos de célula, mantendo a extensão de 15N rotulagem necessário para os experimentos de NMR.
O 15N -1H HSQCs foram adquiridas para o tipo selvagem e mutante R1914E de E-PRD em presença ou ausência de VimRod (Figura 8A-8D). O espectro de E-PRD na Figura 8A mostra o número esperado de picos bem resolvidos, indicativos de uma proteína devidamente dobrada. Na presença de VimRod (Figura 8B) o espectro mostra extensa linha ampliando e desaparecimento de pico, correspondente a vinculação entre o E-PRD e VimRod. Essa ligação é perdida por mutação de R1914E, como evidenciado pela comparação da Figura 8 e 8 D. Pequena mudança é observada no espectro mediante adição de VimRod para o mutante R1914E, indicando uma falta de ligação entre este E-PRD mutante e VimRod. As intensidades de pico E-PRD na presença/ausência de VimRod foram comparadas e plotadas como as intensidades de pico relativo na Figura 8E, que indica o intervalo de pico ampliação do complexo E-PRD. O mutante R1914E de E-PRD (não mostrado) retidos cerca de 97% dos picos em intensidades mais elevadas de pico ou de 20% na presença de VimRod em comparação com cerca de 20% para o tipo selvagem (Figura 8E). Este representa uma perda de mutante de ponto de função, com adicionais mutantes tendo efeitos intermediários também tendo sido estudado4.
Para validar e dosar a ligação da análise VimRod e E-PRD MST usando rotulado com corante vermelho-tris-NTA fluorescente como o destino de His6-VimRod misturado com diminuindo a concentração do ligante E-PRD de 1,28 mM para 39,1 nM foram realizados. Realizaram-se três titulações de vinculação e os resultados são em média e mostrados na Figura 9. Os dados foram se encaixam com um modelo padrão de vinculação de um sítio ligante e deram um KD 25,7 ± 2,1 μm. Avaliação da ligação entre VimRod e E-PRD por ressonância de plasmon de superfície deu um valor de KD semelhante de 19,1 ± 1,3 μM4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig1.jpg"> Figura 1: tela de captura da instalação do experimento NMR. A janela mostrada é usada para configurar uma experiência padrão para coletar um conjunto de dados HSQC. Parâmetros do experimento são lidos no adjacente ao experimento. O experimento ZGPR mostrado é escolhido como um experimento inicial para carregar os parâmetros padrão e solvente próton dependente. A janela de título é usada para introduzir detalhes experimentais, para fins de manutenção de registros. Para coletar o espectro HSQC o experimento ZGPR é substituído por SFHMQC3GPPH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig2.jpg"> Figura 2: ajuste de parâmetros experimentais NMR. A janela mostrada é utilizada para inserir os parâmetros fundamentais para a sequência de pulso NMR para otimizar o sinal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig3.jpg"> Figura 3: processamento de dados NMR. Parâmetros utilizados para o processamento de cada uma das duas dimensões do espectro NMR são mostrados, com setas indicando os que normalmente são ajustados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig4.jpg"> Figura 4: parâmetros para a colheita de pico NMR. Os parâmetros usados para escolher NMR picos no espectro NMR transformado são mostrados com valores típicos. Ajuste o intervalo de ppm, a intensidade e o número de picos para otimizar os espectros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig5.jpg"> Figura 5: Peaklist representante com intensidades. Cada pico que é colhido no espectro NMR é dado um número e a 1H e 15N químico desloca e intensidade de sinal são exibidos. Este peaklist, então, pode ser usado para comparar os espectros obtidos na presença/ausência de um parceiro de interação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig6.jpg"> Figura 6: purificação de VimRod His6-marcados pelo IMAC e S. A. O cromatograma para a eluição da coluna IMAC mostra um grande pico de VimRod. B. o cromatograma para a eluição da coluna S mostra um pico maior. C. SDS-PAGE de fracções recolhidas ao longo de purificação: padrões de MW com o MW indicaram em kDa à esquerda do gel (M), lisado celular (1), IMAC de passagem (2), lavagem (3), em pool de eluição (E1), pool S eluição (E2). Bandas visíveis no maior peso molecular em vias E1 e E2 são oligômeros de pura VimRod confirmada pelo borrão ocidental (dados não mostrados). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig7.jpg"> Figura 7: purificação de E-PRD de IMAC e S. A. SDS-PAGE da purificação IMAC mostrando os padrões de peso molecular com o MW indicado em kDa à esquerda do gel (M) e o eluído primeiro IMAC na coluna (E1), o PEV clivagem produtos (+ TEV) e o fluxo através da segunda coluna IMAC (FT). B. o cromatógrafo da coluna S mostra um pico maior. C. SDS-PAGE dos padrões de peso molecular (M) e as frações do pico de S. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig8.jpg"> Figura 8: HSQC espectros do tipo selvagem e mutante R1914E de E-PRD na presença e ausência de VimRod. Os espectros HSQC mostram o selvagem-tipo E-PRD (100 µM) em 20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1 milímetro DTT, pH 7, na ausência (A) ou presença de 50 µM VimRod (B). Os painéis C e D são os espectros HSQC do mutante R1914E (100µM), na ausência ou presença de 50 µM VimRod, respectivamente. No painel E o pico de15N relativo 1H - intensidades do E-PRD com ou sem ligação de VimRod são mostradas como uma função do número de pico, o qual é atribuído arbitrariamente e não com base na posição de sequência. Esses valores podem ser usados para definir um limite de significância para a redução de intensidade de pico após a adição de um ligante. Se atribuições estão disponíveis, os valores significativos, muitas vezes podem ser vistos para mapear para uma área de vinculação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58537/58537fig9.jpg"> Figura 9: vinculação de E-PRD para VimRod. E-PRD foi diluído em uma série de diluições duplas de 1,28 mM para 39,1 nM e incubadas com rotulado VimRod antes de executar a análise de MST. Dados de três ensaios independentes foram combinados. Os dados eram próprios para um modelo KD dando um KD 25,7 μm com uma confiança de KD ± 2,1 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58537/58537fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato de sódio dibásico (anidro)</td>
			<td>6,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato de potássio monobásico (forma anidra)</td>
			<td>3,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de sódio</td>
			<td>0,5 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Até 950 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. M9 mídia para etiquetar Isotopic.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
<tr>
<td>
15 NH4Cl</td>
			<td>1,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>Glicose (ou 13C-glicose)</td>
			<td>2,0 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 M MgSO4
</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>50 mM CaCl2
</td>
			<td>4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>20 mg/mL de tiamina</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 mM FeCl3
</td>
			<td>400 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>Metal Mix (tabela 3)</td>
			<td>500 Μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Até 50 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2. Mistura de nutrientes para suplementação de M9 media.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagente</td>
			<td>Quantidade</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 mM ZnSO4
</td>
			<td>323 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 mM MnSO4
</td>
			<td>75,5 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>4,7 mM H3BO3
</td>
			<td>145 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,7 mM CuSO4
</td>
			<td>55,9 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td>Até 500 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3. Metal Mix suplemento para enriquecer a mistura de nutrientes de MT.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Amostra</td>
			<td>1 mM E-PRD em tampão A1 (µ l)</td>
			<td>1mM VimRod no buffer A (µ l)</td>
			<td>Reserva um (µ l)</td>
			<td>200 µM DSS na D2O (µ l)</td>
			<td>Tampão B2 (µ l)</td>
			<td>Volume total (µ l)</td>
		</tr>
<tr>
<td>E-PRD sozinho</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>PRD-E + VimRod</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>0</td>
			<td>50</td>
			<td>350</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">
1 Buffer de r: 20 mM Tris-HCl, 1 milímetro DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">
2 Tampão b: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4. Preparação da amostra NMR.

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção e purificação de proteínas que são rotulados com isótopos estáveis e posterior caracterização das interações da proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (RMN) e microescala Experimentos de Thermophoresis (MST).

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de interação proteica, como se a proteína se liga diretamente a uma molécula pequena ou grande. A principal vantagem dessa técnica é que é uma maneira simples e rápida de detectar interações diretas a nível atômico. Ligue o fluxo de ar com o comando ejetar ej.Isso vai trazer a amostra para cima do ímã. Agora, coloque a amostra dentro de um spinner em cima do ímã na abertura. Insira com o comando ij.Espere até que a amostra se instale dentro do ímã antes de prosseguir. Crie um novo conjunto de dados usando o comando edc e carregue parâmetros padrão de NMR de prótons selecionando o ZGPR do experimento. Preencha os campos de número de nome, número do experimento e número de pasta de dados processados.Selecione o solvente no campo Solvente Definir e clique em Executar getprosol para ler parâmetros padrão de probehead e solvente dependente. Bloqueie a amostra para o solvente deuterado usando o comando de bloqueio e espere até que ela termine de varrer e alcance o bloqueio. Corrija a frequência de ressonância do ímã afinando a amostra usando o comando de sintonia automática atma.Monitore a curva de oscilação até que a sintonia automática esteja completa. Shim o campo magnético usando topshim. Shimming faz ajuste para o campo magnético.Alcance a uniformidade em torno da amostra. É uma boa prática armazená-lo em valores com o comando wsh, e lê-los usando rsh antes de topshim, se usar as mesmas ou similares amostras. Agora ajuste o ganho do receptor com o comando rga para alcançar a relação sinal máximo/ruído.Coloque o centro do espectro no deslocamento de ressonância da água e coloque o pulso de próton de 90 graus em alta potência usando calibo1p1. Colete o espectro de prótons usando o comando zero go zg e processe com efp. Isso inclui multiplicação exponencial, a decadência de indução livre incorporando ampliação da linha, transformação fourier de FID e pk para aplicar correção de fase.Aplique o apk de correção automática de fase e o absn de correção automática da linha de base usando o polinômio sem opção de integração. Crie um novo conjunto de dados para o experimento SOFAST HMBC selecionando SFHMQC3GPPH em experimento. Copie o P1 e O1 otimizados do espectro de prótons e preencha pulsos dependentes P1 usando o comando getprosol 1H p1 plw1, onde p1 é o valor P1 otimizado, e plw1 é o nível de potência para P1. Agora, otimize a constante CNST54 para definir o deslocamento para a mudança química amida.Também otimizar o CNST55 para definir a largura de banda, a fim de abranger as regiões espectrais de interesse, permitindo que o ganho do receptor seja otimizado. Para selecionar esses parâmetros, extrair o primeiro FID do espectro bidimensional e procurar o sinal observado para defini-los. Além disso, varie o atraso de relaxamento, o número de varreduras e os exames manequim para obter sensibilidade de sinal aceitável com os gs de comando, o que permite ir e digitalizar para monitorar a qualidade dos dados em tempo real.Por fim, grave o espectro usando zero go zg. Defina os parâmetros de processamento para o tamanho das dimensões diretas de F2 e F1 indiretas do espectro, com previsão linear opcional na dimensão indireta. Selecione QSINE como função Janela e digite uma mudança de sino sine de dois para processar o espectro bidimensional.Digite o comando xfb para processar os dados em ambas as direções com função de janela e transformação Fourier. Use o comando apk2d para realizar correção automática de fase em ambas as direções. Corrija a linha de base com a função de correção automática da linha de base abs2 para dados 2D.Isso aplica uma função polinomial entre os valores ppm definidos nos parâmetros de processamento, e produzirá um espectro 2D para análise posterior. Se planeja realizar o processamento serial para comparação dos dados de interação com outra molécula, armazene os parâmetros de processamento com o comando wpar e lembre-os com rpar. Digite o comando pp para iniciar o processo de captação de pico.Defina a faixa ppm, intensidade mínima e número máximo de picos com base nos picos esperados. Em seguida, clique em OK. Verifique os resultados por inspeção visual. Se necessário, re-executar o processo até que os resultados sejam satisfatórios com base na qualidade do espectro.Gere uma lista de pico com o comando pp. Esta lista de picos contém informações de altura e intensidade de pico por padrão. A lista de picos pode ser exportada para espectros subsequentes e pode ser lida por outros programas.Agora observe o espectro de proteínas HSQC para mudanças nas intensidades de pico ou movimento em mudanças químicas que indicam interação com outra molécula. Se a molécula interativa for grande, espere reduções nas intensidades de pico, juntamente com o desaparecimento de alguns picos. Importe a lista de picos para o próximo conjunto de dados clicando na guia picos e selecionando importação com um clique com o botão direito do mouse na janela de picos.Visualize os picos sobre o espectro e, se necessário, mude-os para novas posições. Clique em intensidades de reset para que a tabela completa gere uma lista de pico para o espectro que inclui intensidades. Esta lista de picos levará as informações de posição da lista de pico armazenada.Exporte as listas de pico de diferentes conjuntos de dados para uma planilha ou outro programa matemático para análise, selecionando a função Exportação. Calcule a mudança nas intensidades de pico com a intensidade do pico da função em espectro complexo, intensidade máxima no espectro proteico para cada pico. Os valores podem ser convertidos em variação percentual por multiplicação por 100.Observe que os volumes de pico também são úteis, embora as intensidades de pico sejam mais fáceis de medir para picos que estão posicionados perto um do outro, como geralmente é o caso de proteínas com alta densidade de picos relativamente amplos. Os N15HSQCs foram adquiridos para o tipo selvagem E-PRD, bem como o mutante R1914E, na presença ou ausência de VimRod. O espectro do tipo selvagem E-PRD mostra o número esperado de picos bem resolvidos, indicativo de uma proteína devidamente dobrada.Na presença de VimRod, o espectro mostra extensa ampliação da linha e desaparecimento de pico, correspondendo à ligação entre E-PRD e VimRod. Pouca mudança é observada entre o espectro do mutante R1914E por conta própria e após a adição de VimRod, indicando uma falta de ligação a este Mutante E-PRD. Aqui, as intensidades máximas de E-PRD na presença e ausência de VimRod foram comparadas e traçadas como as intensidades de pico relativos para indicar a faixa de ampliação do pico no complexo E-PRD.Para validar e quantificar a vinculação de VimRod e E-PRD, a análise MST utilizando His6-VimRod rotulado com corante FLUORESCENTE RED-tris-NTA como alvo, foi realizada utilizando-se concentrações decrescentes do ligante E-PRD. Os dados foram adequados com um modelo padrão de ligação de ligantes de um local e deram um KD de 25,7 mais ou menos 2,1 micromolar. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar condições idênticas de aquisição e processamento.lutará por causa do acesso a amostras de proteínas rotuladas por isótopos para coleta de espectros de RMN. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de câncer, infecção ou doença neurodegenerativa porque envolvem a formação de interações proteicas comprometidas na doença.

measuring-interactions-globular-filamentous-proteins-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este vídeo descreve a técnica de espectroscopia de ressonância magnética nuclear para estudar as interações proteína-proteína entre 15proteínas envoplakin mutantes e do tipo selvagem marcadas com N e a proteína vimentina não marcada. A interação bem-sucedida entre a envoplaquina do tipo selvagem e a vimentina leva a um extenso alargamento da linha e ao desaparecimento do pico nos espectros de RMN, enquanto a ausência de uma interação entre a envoplaquina mutada e a vimentina resulta em picos...

Ressonância Magnética Nuclear para Estudo de Interações Proteína-Proteína em Nível Atômico

Este vídeo demonstra a termoforese em microescala para estudar a interação proteína-lipídio. O ensaio detecta a interação entre as moléculas quantificando o movimento termoforético de proteínas marcadas com fluorescência em resposta a um gradiente de temperatura. A molécula fluorescente é misturada com diferentes concentrações das moléculas lipídicas não fluorescentes, e a mistura de moléculas na solução é carregada nos capilares. Um gradiente de temperatura é aplicado às amostras nos capilares...

Termoforese em microescala para estudar interações proteína-lipídio em solução

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

A termoforese em microescala (MST) é uma tecnologia sensível para caracterizar as interações aptâmero-alvo. Este manuscrito descreve um protocolo MST para caracterizar as interações aptâmero-pequenas moléculas.

Mapear o sítio de ligação de um Aptamer no ATP Usando MicroScale termoforese

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

A termoforese de microescala obtém constantes de ligação rapidamente a baixo custo de material. A termoforese de microescala rotulada ou sem rótulo está comercialmente disponível; no entanto, a termoforese livre de rótulos não é capaz da diversidade de medidas de interação que podem ser realizadas usando rótulos fluorescentes. Fornecemos um protocolo para medições de termoforese rotuladas.

Uso de Termoforese microescala para medir interações proteína-lipídicas

Um protocolo para a aplicação de espectroscopia de RMN de realce por relaxação paramagnética para detectar interações inter e intramoleculares fracas e transitórias em proteínas intrinsecamente desordenadas é apresentado.

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

Aqui, apresentamos um protocolo detalhando a aquisição, processamento e análise de uma série de experimentos de RMN destinados a caracterizar as interações proteína-glicano em solução. As metodologias mais comuns baseadas em ligantes e proteínas são descritas, o que, sem dúvida, contribui para os campos da glicobiologia estrutural e estudos de reconhecimento molecular.

Desembaraçando as interações glicano-proteína: ressonância magnética nuclear (RMN) para o resgate

A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) pode caracterizar a dinâmica estrutural da proteína de maneira específica do resíduo. Fornecemos um protocolo prático para registrar experimentos de relaxamento de RMN 15N R1 e R2 e {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE), sensíveis à escala de tempo de picossegundos a nanossegundos.

Experimentos de relaxamento de RMN 15N para a investigação da dinâmica estrutural de proteínas de picossegundos a nanossegundos

Este protocolo baseado em RMN investiga interações proteína-glicano fracas usando cianovirina-N e D-manose. Combinando métodos detectados por ligantes e proteínas, ele mapeia locais de ligação, detecta efeitos alostéricos e identifica complexos de encontro. A abordagem descreve a preparação de amostras e a análise de dados, oferecendo insights estruturais e dinâmicos valiosos para diagnósticos específicos de glicanos e mecanismos de reconhecimento.

Explorando as interações proteína-glicano: avanços na ressonância magnética nuclear

Aprenda a caracterizar interações proteína-proteína usando espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) e termoforese de microescala (MST). Este protocolo eficiente permite analisar dinâmicas moleculares e afinidades de ligação em nível atômico.

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição (Vídeo) | JoVE Journal

Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Explorar mais vídeos