Interações de proteínas globulares e filamentosas por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (NMR) e Thermophoresis de microescala (MST) de medição

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de interação proteica, como se a proteína se liga diretamente a uma molécula pequena ou grande. A principal vantagem dessa técnica é que é uma maneira simples e rápida de detectar interações diretas a nível atômico. Ligue o fluxo de ar com o comando ejetar ej.

Isso vai trazer a amostra para cima do ímã. Agora, coloque a amostra dentro de um spinner em cima do ímã na abertura. Insira com o comando ij.

Espere até que a amostra se instale dentro do ímã antes de prosseguir. Crie um novo conjunto de dados usando o comando edc e carregue parâmetros padrão de NMR de prótons selecionando o ZGPR do experimento. Preencha os campos de número de nome, número do experimento e número de pasta de dados processados.

Selecione o solvente no campo Solvente Definir e clique em Executar getprosol para ler parâmetros padrão de probehead e solvente dependente. Bloqueie a amostra para o solvente deuterado usando o comando de bloqueio e espere até que ela termine de varrer e alcance o bloqueio. Corrija a frequência de ressonância do ímã afinando a amostra usando o comando de sintonia automática atma.

Monitore a curva de oscilação até que a sintonia automática esteja completa. Shim o campo magnético usando topshim. Shimming faz ajuste para o campo magnético.

Alcance a uniformidade em torno da amostra. É uma boa prática armazená-lo em valores com o comando wsh, e lê-los usando rsh antes de topshim, se usar as mesmas ou similares amostras. Agora ajuste o ganho do receptor com o comando rga para alcançar a relação sinal máximo/ruído.

Coloque o centro do espectro no deslocamento de ressonância da água e coloque o pulso de próton de 90 graus em alta potência usando calibo1p1. Colete o espectro de prótons usando o comando zero go zg e processe com efp. Isso inclui multiplicação exponencial, a decadência de indução livre incorporando ampliação da linha, transformação fourier de FID e pk para aplicar correção de fase.

Aplique o apk de correção automática de fase e o absn de correção automática da linha de base usando o polinômio sem opção de integração. Crie um novo conjunto de dados para o experimento SOFAST HMBC selecionando SFHMQC3GPPH em experimento. Copie o P1 e O1 otimizados do espectro de prótons e preencha pulsos dependentes P1 usando o comando getprosol 1H p1 plw1, onde p1 é o valor P1 otimizado, e plw1 é o nível de potência para P1. Agora, otimize a constante CNST54 para definir o deslocamento para a mudança química amida.

Também otimizar o CNST55 para definir a largura de banda, a fim de abranger as regiões espectrais de interesse, permitindo que o ganho do receptor seja otimizado. Para selecionar esses parâmetros, extrair o primeiro FID do espectro bidimensional e procurar o sinal observado para defini-los. Além disso, varie o atraso de relaxamento, o número de varreduras e os exames manequim para obter sensibilidade de sinal aceitável com os gs de comando, o que permite ir e digitalizar para monitorar a qualidade dos dados em tempo real.

Por fim, grave o espectro usando zero go zg. Defina os parâmetros de processamento para o tamanho das dimensões diretas de F2 e F1 indiretas do espectro, com previsão linear opcional na dimensão indireta. Selecione QSINE como função Janela e digite uma mudança de sino sine de dois para processar o espectro bidimensional.

Digite o comando xfb para processar os dados em ambas as direções com função de janela e transformação Fourier. Use o comando apk2d para realizar correção automática de fase em ambas as direções. Corrija a linha de base com a função de correção automática da linha de base abs2 para dados 2D.

Isso aplica uma função polinomial entre os valores ppm definidos nos parâmetros de processamento, e produzirá um espectro 2D para análise posterior. Se planeja realizar o processamento serial para comparação dos dados de interação com outra molécula, armazene os parâmetros de processamento com o comando wpar e lembre-os com rpar. Digite o comando pp para iniciar o processo de captação de pico.

Defina a faixa ppm, intensidade mínima e número máximo de picos com base nos picos esperados. Em seguida, clique em OK. Verifique os resultados por inspeção visual. Se necessário, re-executar o processo até que os resultados sejam satisfatórios com base na qualidade do espectro.

Gere uma lista de pico com o comando pp. Esta lista de picos contém informações de altura e intensidade de pico por padrão. A lista de picos pode ser exportada para espectros subsequentes e pode ser lida por outros programas.

Agora observe o espectro de proteínas HSQC para mudanças nas intensidades de pico ou movimento em mudanças químicas que indicam interação com outra molécula. Se a molécula interativa for grande, espere reduções nas intensidades de pico, juntamente com o desaparecimento de alguns picos. Importe a lista de picos para o próximo conjunto de dados clicando na guia picos e selecionando importação com um clique com o botão direito do mouse na janela de picos.

Visualize os picos sobre o espectro e, se necessário, mude-os para novas posições. Clique em intensidades de reset para que a tabela completa gere uma lista de pico para o espectro que inclui intensidades. Esta lista de picos levará as informações de posição da lista de pico armazenada.

Exporte as listas de pico de diferentes conjuntos de dados para uma planilha ou outro programa matemático para análise, selecionando a função Exportação. Calcule a mudança nas intensidades de pico com a intensidade do pico da função em espectro complexo, intensidade máxima no espectro proteico para cada pico. Os valores podem ser convertidos em variação percentual por multiplicação por 100.

Observe que os volumes de pico também são úteis, embora as intensidades de pico sejam mais fáceis de medir para picos que estão posicionados perto um do outro, como geralmente é o caso de proteínas com alta densidade de picos relativamente amplos. Os N15HSQCs foram adquiridos para o tipo selvagem E-PRD, bem como o mutante R1914E, na presença ou ausência de VimRod. O espectro do tipo selvagem E-PRD mostra o número esperado de picos bem resolvidos, indicativo de uma proteína devidamente dobrada.

Na presença de VimRod, o espectro mostra extensa ampliação da linha e desaparecimento de pico, correspondendo à ligação entre E-PRD e VimRod. Pouca mudança é observada entre o espectro do mutante R1914E por conta própria e após a adição de VimRod, indicando uma falta de ligação a este Mutante E-PRD. Aqui, as intensidades máximas de E-PRD na presença e ausência de VimRod foram comparadas e traçadas como as intensidades de pico relativos para indicar a faixa de ampliação do pico no complexo E-PRD.

Para validar e quantificar a vinculação de VimRod e E-PRD, a análise MST utilizando His6-VimRod rotulado com corante FLUORESCENTE RED-tris-NTA como alvo, foi realizada utilizando-se concentrações decrescentes do ligante E-PRD. Os dados foram adequados com um modelo padrão de ligação de ligantes de um local e deram um KD de 25,7 mais ou menos 2,1 micromolar. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar condições idênticas de aquisição e processamento.

lutará por causa do acesso a amostras de proteínas rotuladas por isótopos para coleta de espectros de RMN. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de câncer, infecção ou doença neurodegenerativa porque envolvem a formação de interações proteicas comprometidas na doença.