Name: Planta de crescimento e transformação de Floral-mergulho mediada por Agrobacterium do Extremophyte Schrenkiella parvula (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprenda o método floral-dip para transformação mediada por Agrobacterium em Schrenkiella parvula, um modelo extremófilo. Este protocolo permite criar linhagens transgênicas estáveis para estudar adaptações vegetais a ambientes extremos.

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Este trabalho foi apoiado por um prêmio da National Science Foundation 1616827 MCB.

1. crescimento da planta
<ol><li>
Esterilização de sementes (opcional)
	<ol>
<li>Prepare-se 50% de lixívia em água bidestilada (ddH2O) com 1 ou 2 gotas de um detergente não-iônico (ver Tabela de materiais) em um tubo de 50 mL. Inverta o tubo várias vezes para misturar a solução. Nota: É preferível realizar a esterilização de sementes em um fluxo laminar com uma superfície esterilizada UV durante 15 minutos.</li>
		<li>Adicionar a solução de lixívia a ~ 100-200 S. parvula sementes em um tubo de 1,5 mL. Misture bem e deixe o tubo descansar por 5 min.</li>
		<li>Remover o descorante do tubo e adicionar etanol a 70%. Lave as sementes pipetando várias vezes e em seguida, retire imediatamente a solução de etanol.</li>
		<li>Lave as sementes em água esterilizada para remover etanol e água sanitária em excesso e, em seguida, retire a água. Repita essa etapa 5 a 6 vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estratificação de sementes
	<ol>
<li>Mergulhe as sementes em água esterilizada e armazenar durante 5 a 7 dias a 4 ° C. Alternativamente, semear sementes secas esterilizadas, diretamente no solo úmido e coloque a bandeja de solo por 5 a 7 dias a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cultivo de plantas na preparação de transformação
	<ol>
<li>Preencher o solo misturar (ver Tabela de materiais) em potes de2 7 x 6 cm, mergulhe os potes de água e pulverizar a água da parte superior para assegurar um meio de crescimento uniformemente molhado. Adicione 5 – fertilizante grânulos (ver Tabela de materiais) na superfície do solo de cada pote. Nota: Tanto quanto vivemos, S. parvula cresce bem em qualquer mistura de solo onde a. thaliana pode crescer.</li>
		<li>Usando um palito de dente molhado, transferir 20 ~ 25 sementes por vaso na superfície do solo. Nota: Uma prática conveniente é colocar um lote de 4-5 sementes nos quatro cantos e o centro do pote (Figura 1, dia 15, painel esquerdo).</li>
		<li>Cubra a bandeja do pote com uma cúpula clara para manter as sementes sob alta umidade durante a germinação.</li>
		<li>Mantenha as bandejas de planta em uma câmara de crescimento com uma intensidade de luz em 130 µmol m− 2 s− 1 luz, temperatura de 22 a 24 ° C e 14 h por dia/10 h por ciclo de noite. Remova as cúpulas após 7-10 dias após a germinação. Adicione a água do fundo da bandeja para manter o solo umedecido uniformemente em um nível desejável.</li>
		<li>Eliminar mudas extras e deixar apenas 4-5 saudável mudas por vaso bem separado umas das outras (Figura 1, dia 15, painel direito).</li>
		<li>Delicadamente, regar as plantas a cada dois dias e fertilizar com 0.2 x de solução de Hoagland16 uma vez a cada duas semanas. Nota: Manter a umidade do solo em um nível uniforme é chave para crescimento S. parvula consistentemente e de forma saudável.</li>
		<li>Continuam a crescer as plantas durante 8-10 semanas até várias inflorescências produzem botões florais de 100 – 150 por planta (Figura 1, dia 60-80). No dia planejado para a transformação com base floral-mergulho (etapa 4.5), remova todos os siliques maduros e em desenvolvimento das plantas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. clonagem do Gene/genômica elemento de interesse em um vetor para transformação de planta
<ol><li>Amplificar o fragmento de DNA alvo usando o polymerase reação em cadeia (PCR)17 e isolar o produto do PCR usando uma gel de extração kit (veja a Tabela de materiais) de acordo com o protocolo do kit ou qualquer outro método adequado para purificar DNA utilizando gel de agarose eletroforese de17,18. Verifique se a sequência do produto do PCR isolada através de de sequenciamento Sanger19.</li>
	<li>Clone o produto desejado de PCR para o vetor clonagem e transformar a construção clonada para o competente Escherichia coli células usando uma clonagem baseada em topoisomerase kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as orientações do fabricante.</li>
	<li>Espalhe 50 µ l de produtos transformados em20 (LB) Luria-Bertani media ágar crescimento bacteriano (tabela 1) com antibióticos adequados, ex., 50 µ g / mL espectinomicina (ver Tabela de materiais) e incubar a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, selecionar colônias única de 5 – 10, inocular em meio líquido de LB com antibióticos apropriados e incubar com agitação suave a 37 ° C durante a noite.</li>
	<li>Plasmídeos isolados usando um isolamento de plasmídeo kit (veja a Tabela de materiais) e verificar através de de sequenciamento Sanger19 se a sequência do alvo amplificada em 2.1 é adequadamente clonada.</li>
	<li>Transferir o produto PCR clonado e verificado a um vetor de destino para a transformação da planta compatível com baseados na recombinação clonagem (ver Tabela de materiais), usando uma mistura de enzima recombinase kit seguinte (ver Tabela de materiais), instruções do fabricante kit. Repita da etapa 2.3 para etapa 2.5 para isolar e verificar clones abrigar construções de plasmídeo adequado.</li>
</ol>3. transformando construir o vetor para transformação da planta em Agrobacterium tumefaciens
<ol><li>Transforme o plasmídeo da construção de vetor de 2.6 para a cepa da . tumefaciens GV3101:pMP90RK21, que abriga um gene de resistência a rifampicina para seleção de fundo cromossômico. Usar antibióticos apropriados, por exemplo, gentamicina ou canamicina (ver Tabela de materiais), para a seleção de planta transformação construir (plasmídeo Ti). Um protocolo breve para transformação da . tumefaciens através de electroporation está incluído na seção 3.2.</li>
	<li>
A. tumefaciens transformação por eletroporação
	<ol>
<li>Descongele a . tumefaciens células competentes22 no gelo. Mix de 0,1 – 1 µ g do plasmídeo preparado a partir de 2.6, dissolvido em 1-2 µ l de DDQ2O, com células competentes no gelo. Transfira a mistura para uma cubeta de eletroporação (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Executar electroporation sobre a mistura de plasmídeos e células competentes de 3.2.1, usando um electroporator (ver Tabela de materiais) seguindo as orientações do fabricante. Nota: Limpe a superfície da cubeta antes de iniciar a eletroporação.</li>
		<li>Transfira a mistura de reação da cubeta para um tubo de microcentrifugadora que contém 1,5 mL de LB líquido e misture bem com a pipetagem e incubar durante 1 h a 28 ° C, com agitação suave.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocular o transformado a. tumefaciens da seção 3.2 LB placas contendo antibióticos seleção apropriada (por exemplo, canamicina 25 µ g / mL, espectinomicina 50 µ g / mL, gentamicina 25 µ g / mL e rifampicina 50 µ g / mL) e incubar a 28 ° C durante 3 dias.</li>
</ol>4. mediada por Agrobacterium transformação de S. parvula
<ol><li>Inocular o single transformado colônias de placas em 10 mL de LB mídia líquida contendo antibióticos (as mesmas 3.3) em uma estéril 50 mL cónica do tubo (ver Tabela de materiais). Incubar durante 24 h em uma tremendo incubadora (ver Tabela de materiais) em 250 r.p.m. a 28 ° C.</li>
	<li>Transferir a solução bacteriana de 3.4.1 num estéril 250 mL, adicionar 40 mL de meio líquido LB com antibióticos apropriados e incubar 12 h até a densidade óptica em 600 nm comprimento de onda (OD600) atinge cerca de 2.0.</li>
	<li>Centrifugue a . tumefaciens cultureat 3.100 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante e ressuspender a cultura bacteriana em 40 mL de solução de infiltração da . tumefaciens (tabela 1).</li>
	<li>Dilua a ressuspensão a. tumefaciens com solução de infiltração para um final OD600 de 0,8. Adicione 25 µ l da solução de surfactante (tabela 1) a 50 mL de diluídos a. tumefaciens solução e mistura várias vezes por inversão.</li>
	<li>Mergulhe a inflorescência das plantas na solução a. tumefaciens preparada na seção 4.4 para 20 s. uso uma solução bacteriana fresca após mergulhar a inflorescência de seis potes. Certifique-se de todas as flores estão em contacto com a solução. Soluções bacterianas Pipetar diretamente sobre flores, localizadas na parte inferior da inflorescência, se eles não podem ser mergulhados em solução. Nota: Para a transformação da primeira rodada, certifique-se de remover todos os siliques maduros e em desenvolvimento, usando um bisturi afiado ou tesouras pequenas. Não remova siliques se realizando a transformação pela segunda vez.</li>
</ol>5. pós-transformação planta cuidados e a segunda transformação
<ol><li>Coloque as plantas florais-mergulhado na horizontal em bandejas limpas com cúpulas para cobrir as plantas e colocar em um quarto escuro de crescimento por 1 – 2 dias. Nota: Mantendo as flores sob alta umidade é importante nesta fase (Figura 1, as plantas depois da transformação).</li>
	<li>Retorno as plantas para uma posição ereta e transferir as plantas para uma sala de crescimento com 14 h por dia/10 h por ciclo de noite, 130 µmol m-2 s-1 intensidade luminosa e temperatura de 22 a 24 ° C.</li>
	<li>Monitore as inflorescências mergulhadas na semana seguinte. Se um número significativo de flores abortar (Figura 2), repeti o mergulho floral (etapa 4) após cerca de 4 semanas ou depois de um grande número de flores recém desenvolvido. Nota: Ao contrário da etapa de preparação para a primeira transformação (etapa 1.3.7), não remova pre-existentes ou desenvolver siliques (Figura 2) antes da segunda rodada de transformação.</li>
	<li>Crescem as plantas até que as sementes maduras e colhem sementes em ~ 21 semanas.</li>
	<li>Sementes secas por 2 – 3 semanas à temperatura ambiente em um recipiente hermético com cheio de dessecantes (ver Tabela de materiais).</li>
</ol>6. seleção de Transformants positivo
<ol><li>Plante as sementes de T1, conforme descrito para as sementes de tipo selvagem em passos de 1.2 a 1.3.</li>
	<li>Crescem as plantas até desenvolvem as 2 primeiras folhas verdadeiras, cerca de 10 a 14 dias após a germinação.</li>
	<li>
Realize a primeira seleção para resistência a herbicida (Figura 3A e 3B) como detalhado abaixo.
	<ol>
<li>Diluir o herbicida glufosinato-amônio (11,3%) (ou BASTA) (tabela 1) para 1:1,000 (v/v). Pulverizar a solução diluída BASTA sobre as mudas e cobrir as plantas com cúpulas durante a noite.</li>
		<li>Repita BASTA pulverizar a 2-3 vezes a cada 5 a 7 dias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realize a segunda seleção usando um teste BASTA soltar conforme detalhado abaixo.
	<ol>
<li>Identifica as plantas que sobrevivem após ser aplicado 3 a 4 vezes com solução BASTA. Crescem as plantas por mais 2-3 semanas até 3-5 folhas desenvolvem uma área de superfície relativamente grande.</li>
		<li>Selecione a maior folha madura por planta, friccione a superfície da folha suavemente com um dedo para remover a camada de cera e coloque uma gota de solução diluída BASTA (da etapa 6.3.1). Nota: Marca a localização da folha aplicada com a gota BASTA colocando uma fita de papel no caule mais próximo.</li>
		<li>Monitore as folhas aplicadas com a gota BASTA para sinais de murcha por até uma semana. Selecione as plantas com folhas não afetadas pelas gotas BASTA. Nota: Folhas de falso-positivos mais plantas começam a murchar dentro de dois dias, enquanto folhas de verdadeiro-positivos estão intactas, mesmo depois que a gota de solução BASTA seca (Figura 3C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Confirme transformants positivo usando PCR genômico.
	<ol>
<li>2 – 3 folhas coletadas as plantas sobreviventes em etapa 6.4.5.</li>
		<li>Extrai DNA genômico de folhas usando o método CTAB23 ou qualquer outro DNA extração método adequado.</li>
		<li>Realize PCR usando extraídas amostras de DNA genômicas de alvo plantas, plantas de tipo selvagem (como controles negativos) e a construção de plasmídeo da etapa 3.1 (como um controle positivo). Usar um adequado par de primers PCR específicos para o gene marcador seletivo, por exemplo,, para gene BASTA-resistente (bar), TCAGCAGGTGGGTGTAGA (em frente) e GTCAACCACTACATCGAGACAA (reverso).<ol>
<li>Para os primers PCR exemplo como alvo o gene bar , use as seguintes condições PCR: a etapa de desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s; seguido de 30 ciclos de desnaturação a 98 ° C por 30 s, recozendo a 59 ° C por 30 s e estendendo-se a 72 ° C por 30 s; e a extensão final a 72 ° C por 5 min. Nota: Para garantir a inserção do T-DNA inteiro, recomendamos também realizando genomic PCR usando uma primeira demão do PCR do gene marcador seletivo e outro primer PCR específico para a sequência do alvo clonado para o vetor de transformação de plantas no passo</li>
		</ol>
</li>
		<li>Confirmar a presença do tamanho esperado do produto da PCR amplificados bar por de eletroforese de gel de agarose17 para as amostras de alvo(Figura 4), bem como pelo sequenciamento do isolado do PCR produto19 usando o mesmo procedimento como no passo 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O estado fisiológico da planta influencia significativamente a eficiência de transformação25. O uso de plantas saudáveis e vigorosas para transformação é um requisito-chave para a transformação bem sucedida em S. parvula. Água ou plantas estressadas luz terá menos flores em comparação com as ideal de transformação (Figura 1, painel central) de plantas saudáveis. S. parvula pode crescer em uma intensidade de luz menos de 130 µmol m-2 s...

Neste protocolo, descrevemos o crescimento e a criação de linhas transgênicas estáveis para o modelo extremophyte Schrenkiella parvula. A disponibilidade de um sistema eficiente de transformação é uma marca registrada de qualquer modelo genético versátil. Plantas que prosperam em ambientes extremos, referido como extremophytes, fornecem um recurso crítico para compreender as adaptações de plantas a estresses ambientais. Schrenkiella parvula (anteriormente Thellungiella parvula e Eutrema parvulum) é um tal modelo de extremophyte, com a expansão de recursos genômicos1,2,3,4,5. No entanto, os protocolos de transformação não ainda foram relatados para S. parvula em estudos publicados.
O genoma de S. parvula é o primeiro genoma de extremophyte publicado em Brassicaceae (repolho mostarda família) e mostra uma extensa synteny geral do genoma com o modelo de não-extremophyte, Arabidopsis thaliana1. Assim, estudos comparativos entre a. thaliana e S. parvula poderiam se beneficiar da riqueza dos estudos genéticos realizado na a. thaliana tornar informativos hipóteses sobre como o genoma de s. parvula evoluiu e regulamentada forma diferente para lidar com extrema ambiental salienta5,6,7. S. parvula é uma das espécies mais tolerante a sal (baseadas no solo NaCl LD50) entre parentes silvestres conhecidos da . thaliana8. Além da tolerância de NaCl, S. parvula sobrevive e completa seu ciclo de vida na presença de vários íons de sal em altas concentrações tóxicas para a maioria das plantas7. Em resposta às estresses abióticos prevalentes em seu habitat natural, evoluiu várias características, entre os quais vários têm sido estudados com a bioquímica ou fisiológica nível 8,9,10, 11.
Desde 2010, foram mais de 400 publicações peer-reveiwed que usou S. parvula como espécie-alvo ou usado em uma comparação com outras genomas de planta. No entanto, um gargalo claro poderia ser identificado com um olhar mais atento de que tipo de estudos têm sido realizados. A maioria destes relatórios discutir o potencial de uso dos S. parvula em estudos futuros, ou usá-lo em Genômica comparativa ou estudos filogenéticas. Devido à falta de um protocolo de transformação de prova de conceito estabelecido para S. parvula, ela não tem sido usada em estudos de genômicos funcionais, apesar de ter um dos genomas de planta mais alta qualidade disponíveis até à data (> 5 Mb contig N50) montado e anotados em pseudomolecules cromossomo-nível1.
O método de transformação mediada por Agrobacterium de floral-mergulho tornou-se o método mais amplamente utilizado para criar linhas de trasngenic na . thaliana, e o desenvolvimento de um sistema reprodutível da transformação foi um fator crítico de seu sucesso como um modelo genético12,13. No entanto, nem todas as espécies de Brassicaceae foram mostradas para ser com êxito transformada usando o método de imersão floral desenvolvido pela . thaliana. Especialmente, as espécies de Brassicaceae Lineage II que incluem S. parvula tem sido recalcitrantes a transformação com base floral-mergulho métodos14,15.
O hábito de crescimento indeterminado floração de S. parvula, combinada com sua morfologia de folhas estreitas tornou desafiador para adotar o método de transformação de floral-mergulho padrão mediada por Agrobacterium. Neste estudo, nós relatamos o protocolo modificado que desenvolvemos para transformação reprodutível de S. parvula.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-762</td><td>Agente de solda de ágar Bacto, vitaminas</td></tr><tr><td>B5</td> da BD <td>Diagnostics Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1019</td><td>Gamborg' s Solução de Vitaminas</td></tr><tr><td>Dessecante</td><td>W A Hammond Drierite, Xenia, OH</td><td>22005</td><td>Indicando DRIERITE 6 mesh</td></tr><tr><td>Vetor de destino para transformação de plantas</td><td>TAIR</td><td>Vetor:6531113857</td><td>pKGWFS7</td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação</td><td>USA Scientific</td><td>9104-5050</td><td>Cubeta de eletroporação, tampa redonda, folga de 0,2 cm</td></tr><tr><td>Eletroporador</td><td>BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA</td><td>1652100</td><td>MicroPulser Electroporator</td></tr><tr><td>Fertilizante grânulos</td><td>Osmocote Garden, Marysville, OH</td><td>N/A</td><td>Osmocote Smart-Release Plant Food&nbsp; Flor & Kit</td></tr><tr><td>de extração de gel</td> vegetal <td>iNtRON Biotechnology, Boston, MA</td><td>17289</td><td>MEGAquick-spin Kit de purificação de DNA de fragmento total</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>G1914-5G</td><td>Sulfato de gentamicina</td></tr><tr><td>Glufosinato-amônio (11,3%) herbicida (BASTA)</td><td>Bayer environmental science, Montvale,</td><td>NJ N/A</td><td>FINALE herbicida</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>200004-444</td><td>Monossulfato de canamicina</td></tr><tr><td>MES</td><td>Bioworld, Dublin, OH</td><td>41320024-2</td><td>MES,</td></tr><tr><td>sal de ácido livre MS</td><td>MP Biomedicals, Santa Anna, CA</td><td>092621822</td><td>Mistura de sal basal modificada de Hoagland</td></tr><tr><td>N6-benzilaminopurina (BA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>B3274</td><td>Solução de 6-benzilaminopurina</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Alrich</td><td>S7653</td><td>Cloreto de sódio</td></tr><tr><td>Detergente não iônico</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>9005-64-5</td><td>TWEEN 20&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de plasmídeo</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>D4036</td><td>Kits de plasmídeo Zyppy</td></tr><tr><td>Kit de mistura enzimática recombinase</td><td>Life Technology</td><td>11791-020</td><td>Gateway LR Clonase II Mistura enzimática</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>R3501-1G</td><td>Rifampicina, pó, 
&#8805; 97% (HPLC)</td></tr><tr><td>Incubadora de agitação</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SHKE4450</td><td>MaxQ 4450 Agitadores orbitais de bancada</td></tr><tr><td>Mistura de solo</td><td>Sun Gro</td><td>SUN239223328CFLP</td><td>Sun Gro Metro-Mix 360 Mistura de produtores</td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>IC15206705</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cônicos estéreis de 50 mL</td><td>USA Scientific, Ocala, FL</td><td>1500-1811</td><td>Tubos cônicos de 50 mL com tampa de rosca, copolímero, racks,</td></tr><tr><td>sacarose</td> estéril <td>VWR International, Radnor, PA</td><td>57-50-1</td><td>Sacarose, solução de</td></tr><tr><td>surfactante</td> ACS <td>Sementes de Lehle, Round Rock, TX</td><td>VIS-02</td> Kit de clonagem à base de topoisomerase <td>Silwet L-77</td></tr><tr><td>Life</td><td>Technologies, Carlsbad, CA</td><td>K240020</td><td>Kit de clonagem pENTR/D-TOPO, com One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td></tr><tr><td>Triptona</td><td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-282</td><td>BD Bacto Triptona,</td></tr><tr><td>Extrato de Levedura</td> BD Biosciences <td>VWR International, Radnor, PA</td><td>90000-722&nbsp;</td><td>Extrato de levedura BD Bacto, BD Biosciences</td></tr></tbody></table>

planta de crescimento e transformação de floral-mergulho mediada por agrobacterium do extremophyte schrenkiella parvula

Plant Growth and Agrobacterium-mediated Floral-dip Transformation of the Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula é uma extremophyte adaptada a vários estresses abióticos, incluindo várias tensões de toxicidade do íon. Apesar da alta qualidade genômicos recursos disponíveis estudar como as plantas se adaptam ao meio ambiente salienta, seu valor como um modelo de genômica funcional e ferramenta tem sido limitada pela falta de um sistema de transformação praticável. Neste protocolo, relatamos como gerar transgénicos estável S. parvula linhas usando um método de imersão floral mediada por Agrobacterium. Nós modificamos o protocolo de transformação utilizado para a. thaliana para contabilizar características únicas de S. parvula, como um hábito de florescimento indeterminado e um teor de ceras epicuticulares alta nas folhas. Brevemente, S. parvula sementes foram estratificadas em 4 ° C por cinco dias antes do plantio. As plantas foram cultivadas em um fotoperíodo de uma luz de 14 h e 10 h escuro e uma 130 µmol m-2s-1 intensidade luminosa, a 22 ° C a 24 ° C. Oito a nove semanas plantas com várias inflorescências foram selecionados para a transformação. Estas inflorescências foram mergulhadas em uma solução de infiltração de Agrobacterium tumefaciens GV3101 carregando o plasmídeo pMP90RK . Foram realizadas duas rodadas de flor mergulhando com um intervalo de três a quatro semanas para aumentar a eficiência de transformação. As sementes de T1 foram coletadas e secas por quatro semanas em um recipiente com dessecantes antes de germinação a tela para o candidato transformado linhas. Resistência à BASTA foi usada para plantas T1 de tela. Atingimos a solução BASTA três vezes com um intervalo de três dias, começando com duas semanas de plantas para reduzir falsos positivos. Um teste de gota BASTA foi realizado em sobreviver plantas individuais para identificar o verdadeiro transformants positivo. A eficiência de transformação foi 0.033%, rendendo 3 – 4 plantas transgénicas por 10.000 sementes de T1 propagadas.

Desenvolvemos um protocolo de transformação que permite a colheita de sementes de T0 no prazo de 150 dias, usando um método de imersão floral modificado do que para a. thaliana. A Figura 1 mostra um resumo do cronograma e S. parvula plantas que representam o palco ideal para executar a transformação através de imersão floral. Nós selecionamos S. parvula plantas com flores de 70 –80 em várias inflorescências em 60-80 dias ...

Transformação mediada por Agrobacterium, usando um método de imersão floral pode ser empregada com sucesso para criar linhas transgênicas estáveis do modelo extremophyte Schrenkiella parvula. Apresentamos um protocolo modificado do que para a Arabidopsis thaliana, considerando o crescimento de diferentes hábitos e características fisiológicas do extremophyte.

Planta de crescimento e transformação de Floral-mergulho mediada por Agrobacterium do Extremophyte Schrenkiella parvula

Schrenkiella parvula is an extremophyte adapted to various abiotic stresses, including multiple ion toxicity stresses. Despite high-quality genomic ...

Este método, um protocolo de transformação reprodutível para Schrenkiella parvula, pode ajudar a responder perguntas no campo do genoming comparativo e funcional das plantas, especialmente estudos que investigam adaptações de plantas a ambientes severos. Esta técnica permite investigações de funções rotineiras em Schrenkiella parvula no extremophyte adaptado a tensões de sal de íons múltiplos. Também permite estudos comparativos que também olham para seu parente próximo, o pai mãe Aribidopsis Thaliana.Comparar Schrenkiella Parvula com Aribidopsis Thaliana pode fornecer insights sobre variâncias na regulação genética e função que permitem a adaptação única de Schrenkiella parvula. O protocolo de transformação para Arabidopsis Thaliana já foi bem estabelecido. O método agora permite estudos comparativos utilizando plantas transgênicas Schrenkiella Parvula.Geralmente, pesquisadores novos neste método lutarão por causa do hábito de floração e da morfologia da folha das plantas Schrenkiella Parvula que fazem uma transformação efetiva usando um mergulho de flora, bem como a seleção de verdadeiros transformadores difíceis. Para começar, use um palito molhado para transferir cerca de 20 a 25 sementes S.Parvula para solo molhado. Em seguida, estratifique as sementes a quatro graus celsius por cinco a sete dias.Após a estratificação, devolva as sementes à câmara de crescimento por sete a dez dias. Uma vez que todas as mudas tenham germinado, deixe apenas uma muda em cada um dos quatro cantos e no centro dos potes. Plante as plantas por oito a 10 semanas na câmara de crescimento até florescerem.No dia da transformação, selecione plantas S.Parvula de acordo com o protocolo de texto. Use fórceps e pequenas tesouras para remover quaisquer inflorescências polinizados que já estão se desenvolvendo em siliques. Depois que as plantas estiverem prontas, prepare uma solução de infiltração de agrobacterium.Depois disso, mergulhe a inflorescência S.Parvula na solução de infiltração de agrobacterium por 20 segundos. Aqui é mostrado o estágio mais antigo das plantas que podem ser utilizadas para a transformação, desde que as siliques já desenvolvidas sejam removidas antes da transformação, plantas mais antigas com mais flores podem ser utilizadas. Após a transformação, coloque as plantas mergulhadas na horizontal em bandejas limpas com cúpulas para cobrir as plantas.Em seguida, coloque as plantas em uma sala de crescimento escura por um a dois dias. Devolva as plantas para uma posição vertical e transfira-as para a sala de crescimento. Na semana seguinte, monitore as inflorescências mergulhadas.Dez dias após o primeiro mergulho floral, as plantas S.Parvula continuarão produzindo novas inflorescências e siliques. Uma segunda rodada de mergulho floral pode ser realizada para transformar ainda mais as recém-emergentes inflorescências. Plante as plantas até que as sementes amadurecam, e colhe as sementes em torno de 21 semanas.Seque as sementes por duas a três semanas à temperatura ambiente em um recipiente hermético cheio de dessecantes. Plante as sementes T de acordo com o protocolo de texto. Cultivar as plantas até que as primeiras duas ou três folhas verdadeiras se desenvolvam.Para realizar a primeira seleção para resistência a herbicidas, diluir herbicida de amônio glufosinato e pulverizá-lo nas mudas. Cubra as mudas com as cúpulas durante a noite. Coloque as bandejas de volta para a sala de crescimento, e remova a cúpula.Espere até que a maioria das mudas sejam selecionadas pelo herbicida. Para iniciar a segunda seleção, identifique as plantas que sobrevivem após serem pulverizadas três a quatro vezes com a solução BASTA. Depois de cultivar as plantas por mais duas ou três semanas, selecione a maior folha madura em cada planta.Em seguida, esfregue a superfície da folha suavemente com um dedo para remover a camada de cera. Em seguida, coloque uma gota da solução BASTA diluída na folha. Monitore as folhas tratadas com a solução BASTA para sinais de murchar por até uma semana.Por fim, selecione as plantas com folhas não afetadas pelas gotas BASTA para análise posterior. Neste protocolo, a S.Parvula foi transformada com agrobacterium utilizando um método de mergulho floral. A infecção por agrobacterium resultou no aborto de algumas flores.No entanto, as plantas de S.Parvula continuaram a produzir novas flores após o primeiro mergulho de flores, e poderiam ser transformadas novamente. Usando os testes de pulverização e queda SUFICIENTE, verdadeiros transformadores positivos podem ser identificados com precisão. O número de amostras testadas usando a confirmação do PCR pode ser reduzido.Embora este método seja semelhante à transformação da Arabidopsis Thaliana, é importante lembrar as diferenças no crescimento e morfologia de Schrenkiella Parvula. Modificar o protocolo para refletir essas diferenças é fundamental para uma transformação bem sucedida. Essa técnica poderia ajudar os pesquisadores a explorar a evolução das variações genômicas que levam a múltiplas adaptações de estresse sal no modelo extremophyte, Schrenkiella Parvula.Combinando essa técnica com as informações sobre as funções de Aradopsis Thaliana, outra planta intimamente relacionada à Schrenkiella Parvula. Os pesquisadores podem estudar as variações na regulação e funções que são duas estruturas distintas entre essas duas espécies. Durante o processo de transformação, é importante conter toda a solução de infiltração de agrobacterium em recipientes autoclaveáveis.Esterilizar e descartar com segurança todos os materiais que entraram em contato com a agrobacterium, incluindo luvas, pontas de macro pipeta e toalhas de papel.

plant-growth-agrobacterium-mediated-floral-dip-transformation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este artigo ilustra o floral-dip método...

Floral-dip Transformação de Arabidopsis thaliana Examine a PTSO2:: β-glucuronidase Expressão Gênica Reporter

Fonte: Lee, H. et. al., Sistema de proteína fluorescente verde dividida para visualizar efetores entregues por bactérias durante a infecção. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra um método para monitorar a infecção bacteriana e a entrega de proteínas efetoras em células vegetais usando a complementação de proteína fluorescente verde de superpasta dividida (sfGFP) combinada com microscopia confocal. A abordagem permite a visualização precisa da translocação efetora para o citosol da célula...

Monitoramento da infecção bacteriana e entrega de proteínas efetoras em células vegetais

Neste vídeo, demonstramos a geração de plantas transgênicas de Arabidopsis expressando transgene estável por meio da transformação gênica baseada em cromossomos artificiais bacterianos binários mediada por Agrobacterium.

Transformação gênica baseada em vetor cromossômico artificial bacteriano binário em plantas de Arabidopsis: uma técnica para gerar plantas transgênicas com inserção de cópia única

Aqui, apresentamos um protocolo de transformar o linho usando Agrobacterium transformação de plantas mediada por via floral-dip. Este protocolo é simples de executar e barato, ainda produz uma taxa de transformação maior do que os actuais métodos disponíveis para transformação de linho.

Floral-Dip Transformação de linho ( Linum usitatissimum) Para gerar Transgênicos Progênies com uma alta taxa de Transformação

Usando um vetor binário pBIBAC-GW faz gerar plantas transgénicas com inserções de cópia única intactas, um processo fácil. Aqui, uma série de protocolos é apresentada que guia o leitor através do processo de geração de plantas transgênicas de Arabidopsis e teste as plantas para integridade e copiar o número de inserções.

Geração de plantas transgênicas com inserções de cópia única usando vetor binário BIBAC-GW

Abordagens de baseados em proteína fluorescentes para monitorar efetores secretadas pelas bactérias em células hospedeiras são desafiadores. Isto é devido à incompatibilidade entre proteínas fluorescentes e o sistema de secreção do tipo III. Aqui, é utilizado um sistema GFP de superfolder de separação otimizada para visualização de efetores secretada pelas bactérias para a célula da planta hospedeira.

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

Aqui apresentamos protocolos de fácil utilização para a produção e purificação de metabólitos diterpenóides através da expressão combinatória de enzimas biossintéticas em Escherichia coli ou Nicotiana javanica, seguida de produto cromatográfico Purificação. Os metabólitos resultantes são adequados para vários estudos, incluindo caracterização de estruturas moleculares, estudos funcionais enzimáticos e ensaios de Bioatividade.

Uma abordagem personalizável para a produção enzimática e purificação de produtos naturais de Diterpenóides

Este protocolo descreve a utilização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar gene(s) de interesse no genoma nuclear da microalga verde Chlorella vulgaris, levando à produção de transformantes estáveis.

Engenharia Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Microalgas Verdes, Chlorella vulgaris

Apresentamos um protocolo eficiente e otimizado para a transformação mediada por Agrobacterium de uma espécie anfíbia assexuada de Brassicaceae, Rorippa aquatica, sem procedimentos intensivos em recursos de cultura de tecidos estéreis. Utilizando um marcador visual de transformação e um oleoduto de regeneração de brotos, geraram com sucesso transformantes quase clonais, avançando assim os estudos futuros sobre a adaptação das plantas ao ambiente subaquático.

Transformação Eficiente Baseada em Regeneração Mediada por Agrobactérias de uma Espécie Assexuada de Brassicáceas, Rorippa aquatica

Apresentamos um protocolo simples, eficaz e reprodutível para a transformação mediada por Agrobacterium em Phytophthora palmivora, que também é aplicável a P. capsici.

Um método simplificado para a transformação mediada por agrobactérias de Phytophthora palmivora

Aprenda o método floral-dip para transformação mediada por Agrobacterium em Schrenkiella parvula, um modelo extremófilo. Este protocolo permite criar linhagens transgênicas estáveis para estudar adaptações vegetais a ambientes extremos.

Planta de crescimento e transformação de Floral-mergulho mediada por Agrobacterium do Extremophyte Schrenkiella parvula

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