Name: Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a técnica de imunocoloração digital de ZWINT em tecidos pulmonares humanos para pesquisa em patologia do câncer. Este método produz imagens digitais de alta qualidade e resultados confiáveis para análise de expressão proteica.

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Este projeto foi apoiado pela Fundação Nacional natural da China (no. 81500151, 81400121, 81270607, 81541027 e 81501352) e da Fundação natural da província de Hubei (China) (no. 2017CFB631). Os autores expressam sua apreciação a Guo Qin, Chang min, Li Hui, e seus colegas na tecnologia biológica Co. de Wuhan Google, LTD para seu apoio técnico. Os autores também agradecem a Muhammad Jamal pela edição da linguagem.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de ética do hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan e Renmin hospital da Universidade de Wuhan.
1. preparação de slides IHC
<ol><li>Fixar a amostra de tecido pulmonar, imersando o fragmento de tecido pulmonar humano (cerca de 3 x 3 cm) em paraformaldeído a 4% em solução salina tampão fosfato (PBS) por 24 h à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Desidratar o tecido em 80%, 95%, e 100% etanol por 15 min, 20 min e 20 min, respectivamente, à temperatura ambiente. Finalmente, mergulhe o tecido em 100% xileno 3x por 20 min cada em temperatura ambiente.</li>
	<li>Para a incorporação, mergulhe o tecido em parafina (63 ° c) durante 30 min. mude a parafina e mergulhe o tecido novamente por mais 45 min. Finalmente, mude a parafina novamente e mergulhe o tecido nele por um adicional de 1 h.</li>
	<li>Utilize um micrótomo rotativo para cortar o tecido em secções de 5 μm de espessura e coloque-os em lâminas revestidas com 20 μg/mL de poli-L-lisina.</li>
	<li>Para a descera, coloque as lâminas em um forno de 65 ° c por 2 h e, em seguida, mergulhe as seções em Dimetilbenzeno por 15 min, seguido de imersão em xileno 100% por 15 min.</li>
	<li>Hidratar as lâminas com as secções de tecido 2x por 5 min em 100% etanol, seguido por um tratamento com etanol diluído em série de 5 min em etanol 95%, 5 min em 80% etanol, 5 min em 70% etanol, e 5 min em 50% etanol.</li>
	<li>Realize o reparo do antígeno.<ol>
<li>Diluir o líquido do reparo do ácido cítrico (20x) a 1x com H2o dobro-destilado (DDH2o).</li>
		<li>Coloc as corrediças com as seções do tecido e o líquido do reparo do ácido cítrico 1x (300 mL) em uma caixa do reparo do antígeno e, a seguir, aqueça-os no forno de microonda na potência elevada por 2 minutos, seguido pelo aquecimento na baixa potência para sustentar a ebulição por 6 minutos.</li>
		<li>Permita que as seções esfriem naturalmente à temperatura ambiente.</li>
		<li>Substitua o líquido do reparo do ácido cítrico com 0, 1 M PBS, lave as seções 3x, cada vez por 5 minutos, no abanador giratório na temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Elimine a peroxidase endógena.<ol>
<li>Diluir 30% de H2o2 a 3% com DDH2o, adicioná-lo aos slides (certifique-se de que cobre todos os tecidos) e incubar as lâminas em uma caixa molhada à temperatura ambiente por 30 min. Nota: a caixa molhada é uma caixa plástica de 10 x 15 cm e pode conter a água.</li>
		<li>Lave as lâminas 3x, cada vez por 5 min, com 0, 1 M PBS no agitador rotativo à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Bloqueie o antígeno não específico.<ol>
<li>Diluir o soro de cabra normal concentrado para 10% de soro de cabra com PBS com 0,1% Tween 20 (PBST).</li>
		<li>Adicionar 10% de soro de cabra às lâminas e incubar-los na caixa molhada a 37 ° c durante 30 min. Nota: o soro de cabra deve cobrir todos os tecidos nas lâminas.</li>
	</ol></li>
	<li>Manchar os tecidos.<ol>
<li>Incubar as lâminas com o anticorpo anti-humano anti-ZWINT do coelho (1:50) em 4 ° c durante a noite.</li>
		<li>Lave as lâminas 3x, cada vez por 5 min, com 0, 1 M PBST (1 mL de 0,1% Tween 20 em 1.000 mL PBS) no agitador rotativo à temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar as lâminas com anticorpo secundário (sistema de detecção Anticoelho, 1:200) por 30 min a 37 ° c.</li>
		<li>Lave as lâminas 3x, cada vez por 5 min, com 0, 1 M PBST no agitador rotativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Para visualizar a imunocoloração, adicione as lâminas a 300 μL de 3, 3-diaminobenzidina fresca e, em seguida, lave as lâminas com água da torneira à temperatura ambiente. Nota: o grau de tingimento é monitorado um microscópio (ampliação 10X-40X).</li>
	<li>Contratura o tecido. Manchar as lâminas com hematoxilina solução de coloração para 2 min à temperatura ambiente e, em seguida, lave as lâminas com água da torneira para 15 min. Nota: o núcleo aparece azul o microscópio (ampliação 10X-40X). Se o grau de coloração azul é mais potente, a diferenciação de álcool clorídrico para 3-5 s pode ser usada, seguida de enxaguar o tecido de volta ao azul com água da torneira por 15 min para facilitar a coloração proeminente do tecido.</li>
	<li>Desidratar as lâminas por 5 min em 50% etanol, 5 min em 70% etanol, 2x em 80% etanol por 5 min, 5 min em 95% etanol e, finalmente, 2x por 5 min cada em 100% etanol à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para transparência, mergulhe as seções de tecido em um tanque contendo 100% de xileno por 15 min e transfira as seções para outro tanque contendo 100% de xileno por 15 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Para selar, tomar 50-100 μL de goma neutra e adicionar 5% de xileno à mistura (Evite misturar em bolhas). Adicionar 15 μL da mistura acima mencionada nas secções do tecido pulmonar. Selar o filme com tampa de vidro e pressione suavemente as bolhas para fora.</li>
</ol>2. varredura automática da todo-corrediça de corrediças de IHC
<ol><li>Deixe os slides selados secar por 12 h à temperatura ambiente para dessecá-los.</li>
	<li>Selecione o campo brilhante manualmente a opção e incorpore a interface de exploração manual.</li>
	<li>Revise o nome dos slides e selecione um caminho de armazenamento para as imagens.</li>
	<li>Defina a área de digitalização e escolha a opção digitalizar amostras usando limites definidos pelo usuário. O limiar é de cerca de 50 com um valor de expansão de área de digitalização de 200 μm.</li>
	<li>Defina o valor do foco de digitalização, selecione o foco automaticamente — ele varia de 1050 a 2650 — e, finalmente, selecione o modo de camada única.</li>
	<li>Carregue os slides IHC na estação de trabalho e inicie a digitalização automática. Nota: Certifique-se de que os slides não estão danificados. Manter os slides limpos e translúcidos e evitar poeira, confetes e resíduos de selante em excesso nas lâminas. A corrediça de vidro e o lamela devem ser desprovidos das marcas. Não limpe as lâminas com xileno. O tamanho das lâminas é fornecido na tabela 1.</li>
	<li>Digitalize automaticamente toda a seção de tecido em um slide com ampliação de 20X, 40X ou 100X.</li>
	<li>Colete e armazene as imagens no final da digitalização do slide inteiro.</li>
</ol>3. análise dos slides por Imaging Software
<ol><li>Inicie o software de análise de imagem histopatológica e selecione computador local.</li>
	<li>Abra o arquivo que armazena os dados de digitalização.</li>
	<li>Selecione o nível de zoom adequado do intervalo de 2X a 40X.</li>
	<li>Ajuste a cor para definir o contraste ideal através de alternância de cor ajustar.</li>
	<li>Circule manualmente e nomeie as porções de interesse em cada imagem. Nota: por exemplo, você pode circundar uma área e nomeá-la como a área do tumor.</li>
	<li>Selecione plugins e QC. Neste momento, o Construtor de cenários aparece.</li>
	<li>Selecione densidade Quant e ajuste a barra de detecção . Nota: este processo deve ser realizado com cuidado. A barra de tolerância azul é usada para ajustar a cor do núcleo celular. A barra de tolerância marrom é usada para ajustar a saturação da cor de preenchimento na imagem. Os resultados das imagens após ajustes devem ser consistentes com as contrapartes originais.</li>
	<li>Ajuste os níveis de Pontuação para tornar a intensidade de coloração das áreas circuladas semelhantes às das imagens originais. Nota: marrom escuro indica forte positivo, amarelo acastanhado é moderadamente positivo, luz amarela é fracamente positivo, e branco é negativo.</li>
	<li>Armazene e nomeie o modelo como um arquivo. Aplique o modelo a outros slides e selecione a anotação selecionada".</li>
	<li>Deixe o software calcular automaticamente o H-Score para as áreas circuladas na imagem.</li>
</ol>4. quantificação dos escores utilizando o sistema de Pontuação H9,10
<ol><li>Calcule a percentagem de imunocoloração e a intensidade de coloração (0: negativo, 1 +: fraco, 2 +: moderado, 3 +: forte).</li>
	<li>Use um sistema de Pontuação (H-score) para calcular a pontuação patológica do tumor e áreas adjacentes não tumorais. Nota: H-Score = (% das células com intensidade fraca x 1) + (% das células com intensidade moderada x 2) + (% das células com intensidade forte x 3). Portanto, o escore H máximo é 300 se 100% das células forem quantificadas com intensidade forte.</li>
</ol>

<ol><li>Endo, H., Ikeda, K., Urano, T., Horie-Inoue, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terf%2FTRIM17+stimulates+degradation+of+kinetochore+protein+ZWINT+and+regulates+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Terf/TRIM17 stimulates degradation of kinetochore protein ZWINT and regulates cell proliferation.</a> The Journal of Biochemistry. 151 (2), 139-144 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Zwint-1+specifies+localization+of+Zeste+White+10+to+kinetochores+and+is+essential+for+mitotic+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Zwint-1 specifies localization of Zeste White 10 to kinetochores and is essential for mitotic checkpoint signaling.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (52), 54590-54598 (2004).</li>
<li>Lin, Y. T., Chen, Y., Wu, G., Lee, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hec1+sequentially+recruits+Zwint-1+and+ZW10+to+kinetochores+for+faithful+chromosome+segregation+and+spindle+checkpoint+control%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Hec1 sequentially recruits Zwint-1 and ZW10 to kinetochores for faithful chromosome segregation and spindle checkpoint control.</a> Oncogene. 25 (52), 6901-6914 (2006).</li>
<li>Ying, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Zwint+predicts+poor+prognosis+and+promotes+the+proliferation+of+hepatocellular+carcinoma+by+regulating+cell-cycle-related+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Zwint predicts poor prognosis and promotes the proliferation of hepatocellular carcinoma by regulating cell-cycle-related proteins.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 689-702 (2018).</li>
<li>Yuan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+analysis+of+prognostic+value+of+ZW10+interacting+protein+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22OncoTargets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic analysis of prognostic value of ZW10 interacting protein in lung cancer.</a> OncoTargets and Therapy. 11, 1683-1695 (2018).</li>
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<li>Webster, J. D., Dunstan, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+and+automated+image+analysis%3A+considerations+and+opportunities+in+the+practice+of+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging and automated image analysis: considerations and opportunities in the practice of pathology.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 211-223 (2014).</li>
<li>Al-Janabi, S., Huisman, A., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology%3A+current+status+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Digital pathology: current status and future perspectives.</a> Histopathology. 61 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Bonomi, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+biomarkers+for+response+to+EGFR-directed+monoclonal+antibodies+for+advanced+squamous+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Predictive biomarkers for response to EGFR-directed monoclonal antibodies for advanced squamous cell lung cancer.</a> Annals of Oncology. 29 (8), 1701-1709 (2018).</li>
<li>Villalobos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERCC1+assessment+in+upfront+treatment+with+and+without+cisplatin-based+chemotherapy+in+stage+IIIB%2FIV+non-squamous+non-small+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">ERCC1 assessment in upfront treatment with and without cisplatin-based chemotherapy in stage IIIB/IV non-squamous non-small cell.</a> Medical Oncology. 35 (7), 106(2018).</li>
<li>Griffin, J., Treanor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology+in+clinical+use%3A+where+are+we+now+and+what+is+holding+us+back%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Digital pathology in clinical use: where are we now and what is holding us back?</a> Histopathology. 70 (1), 134-145 (2017).</li>
<li>Huisman, A., Looijen, A., van den Brink, S. M., van Diest, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+fully+digital+pathology+slide+archive+by+high-volume+tissue+slide+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Creation of a fully digital pathology slide archive by high-volume tissue slide scanning.</a> Human Pathology. 41 (5), 751-775 (2010).</li>
<li>Gray, A., Wright, A., Jackson, P., Hale, M., Treanor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+histochemical+stains+using+whole+slide+imaging%3A+development+of+a+method+and+demonstration+of+its+usefulness+in+laboratory+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Quantification of histochemical stains using whole slide imaging: development of a method and demonstration of its usefulness in laboratory quality control.</a> Journal of Clinical Pathology. 68 (3), 192-199 (2015).</li>
<li>Hofman, F. M., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry.</a> Current Protocols in Immunology. 103, Unit 21.4 (2013).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+Methods+of+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles and Methods of Immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li>
<li>Otali, D., Fredenburgh, J., Oelschlager, D. K., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+tissue+as+a+control+for+histochemical+and+immunohistochemical+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">A standard tissue as a control for histochemical and immunohistochemical staining.</a> Biotechnic & Histochemistry. 91 (5), 309-326 (2016).</li>
<li>Clarke, E. L., Treanor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colour+in+digital+pathology%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Colour in digital pathology: a review.</a> Histopathology. 70 (2), 153-163 (2017).</li>
<li>Potts, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+pathology+in+drug+discovery+and+development%3A+multisite+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Digital pathology in drug discovery and development: multisite integration.</a> Drug Discovery Today. 14 (19-20), 935-941 (2009).</li>
<li>Tabata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-slide+imaging+at+primary+pathological+diagnosis%3A+Validation+of+whole-slide+imaging-based+primary+pathological+diagnosis+at+twelve+Japanese+academic+institutes%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+International%22%5BJournal%5D)">Whole-slide imaging at primary pathological diagnosis: Validation of whole-slide imaging-based primary pathological diagnosis at twelve Japanese academic institutes.</a> Pathology International. 67 (11), 547-554 (2017).</li>
<li>Saco, A., Bombi, J. A., Garcia, A., Ramírez, J., Ordi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Status+of+Whole-Slide+Imaging+in+Education%5BTitle%5D)+AND+%22Pathobiology%22%5BJournal%5D)">Current Status of Whole-Slide Imaging in Education.</a> Pathobiology. 83 (2-3), 79-88 (2016).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A digitalização de slides inteiros está se tornando um tema quente para sua digitalização robusta e produção de imagens de alta qualidade para fins clínicos e de pesquisa11,12,13. As imagens podem ser produzidas por microscópios de slide-scanning dentro dos minutos11,12,13. Aplicando esta metodologia, nós obtivemos imagens de alta quali...

ZW10 proteína interagindo (zwint) é um componente necessário do complexo cinetócoro que está envolvido no ponto de verificação do fuso mitótico1,2,3. Relatou-se que a prostração de zwint conduz à segregação prematura aberrante1,2,3do cromossoma. Estudos recentes sugerem que a zwint está envolvida na patogênese de múltiplos tumores, promovendo a proliferação de células tumorais4,5. Nós relatamos previamente o superexpressão de zwint no cancro do pulmão5. Tem sido amplamente aceito que a análise de lâminas por patologistas utilizando CLM é demorada e não quantitativa6,7,8. Além disso, a deterioração de lâminas de vidro armazenadas pode tornar impossível a retrair slides criados anteriormente. O método emergente de imagiologia por computador, digital Whole-slide (WSI) pode superar essas limitações6,7,8.
Para este fim, nós descrevemos uma metodologia da imunocoloração de ZWINT em tecidos humanos do cancro de pulmão, acoplados com a exploração digital da todo-corrediça e a análise de imagem software-baseada. A principal vantagem desta metodologia é a produção de resultados concordantes com a CLM. Esta tecnologia pode ser amplamente utilizada nas áreas de Pontuação patológica de coloração de hematoxilina-eosina (H & e) e IHC, hibridação in situ de fluorescência (Fish), Microarrays teciduais (TMA) e descoberta e desenvolvimento de fármacos.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic MIDI</td><td>3D HISTECH</td><td>Cat: PMIDI-040709</td><td>Um scanner de slides digital automatizado com um conjunto de recursos notável: capacidade de 12 slides, varredura de fluorescência e muito mais.</td></tr><tr><td>QuantCenter</td><td>3D HISTECH</td><td>Baixado do site oficial da empresa</td><td>A estrutura para os aplicativos de análise de imagem da 3DHISTCH.</td></tr><tr><td>LEICA RM2235</td><td>Leica Microsystems</td><td>Cat: 14050038604</td><td>A precisão aprimorada dos novos acessórios adicionará conveniência à abordagem do bloco à faca, bem como à orientação da amostra.</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-ZWINT humano de coelho</td><td>Abcam</td><td>Cat: ab197794</td><td>Análise imuno-histoquímica de ZWINT em tecido pulmonar humano.</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário anti-coelho</td><td>Tecnologia Wuhan Goodbio Cat</td><td>: GB23303-1</td><td>Anticorpo secundário para coloração IHC.</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Wuhan Goodbio Technology</td><td>Cat:G0002</td><td>Uma solução contendo um tampão fosfato.</td></tr><tr><td>OLYMPUS CX23</td><td>OLYMPUS</td><td>Cat: 6M87620</td><td>Microscópio para detecção de H & Lâminas E ou IHC.</td></tr><tr><td>Reagente químico Dimetilbenzeno</td><td>Shanghai Lingfeng</td><td>Cat: 1330-20-7</td><td>Um fluido incolor e inflamável usado como solvente e agente clarificante na preparação de seções de tecido para estudo microscópico.</td></tr><tr><td>Hematoxilina que colore a</td><td>tecnologia de Wuhan Servicebio</td> da solução da coloração<td>: G1039</td><td>É de uso geral para estudos histológicos, colore o oftern os núcleos das pilhas azuis.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Baitg</td><td>Cat:2005-64-5</td><td>É um surfactante não iônico do tipo polissorbato formado pela etoxilação do sorbitano antes da adição de ácido láurico. É usado como dissuasor e emulsificante em aplicações farmacológicas.</td></tr><tr><td>Ácido cítrico reparação líquido</td><td>Wuhan Servicebio technology</td><td>Cat: G1202</td><td>É usado para reparar o antígeno após a fixação durante o procedimento IHC.</td></tr><tr><td>LEICA ASP200s</td><td>Leica</td><td>Cat: 14048043626</td><td>Foi projetado para histopatologia de rotina e pesquisa de até 200.</td></tr><tr><td>LEICA Arcadia H</td><td>Leica</td><td>Cat: 14039354103</td><td>É uma estação de embutir de parafina aquecida e permite uma operação simples e controle preciso, resultando em melhor qualidade, um fluxo de trabalho suave e confiabilidade.</td></tr><tr><td>LEICA Arcadia C</td><td>Leica</td><td>Cat: 14039354102</td><td>É uma placa fria com mais de 60/65 em sua grande superfície de trabalho. Ele foi projetado com um módulo de controle adaptativo ao ambiente para garantir que a temperatura operacional esteja sempre estabilizada em -6 graus Celsius.</td></tr><tr><td>Software CaseViewer</td><td>3DHISTECH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

análise digital de imunocoloração da proteína zw10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

A finalidade deste estudo é introduzir uma metodologia da imunomarcação de tecidos humanos do pulmão, seguida pela exploração digital da todo-corrediça e pela análise de imagem. A digitalização digital é uma maneira rápida de digitalizar uma pilha de slides e produzir imagens digitais com alta qualidade. Pode produzir resultados concordantes com a microscopia de luz convencional (CLM) por patologistas. Além disso, a disponibilidade de imagens digitais torna possível que o mesmo slide pode ser observado simultaneamente por várias pessoas. Além disso, imagens digitais de slides podem ser armazenadas em um banco de dados, o que significa que a deterioração a longo prazo das lâminas de vidro é evitada. As limitações desta técnica são as seguintes. Primeiramente, precisa o tecido preparado de alta qualidade e as corrediças immunohistochemistry originais (IHC) sem nenhum dano ou resíduo excedente do vedador. Em segundo, as áreas do tumor ou do Atlas devem ser especificadas por patologistas experientes antes da análise usando o software, a fim evitar toda a confusão sobre as áreas do tumor ou do Atlas durante a pontuação. Em terceiro lugar, o operador precisa de controlar a reprodução da cor durante todo o processo da digitalização na imagem latente do inteiro-corrediça.

Nós medimos os níveis da expressão de zwint em 28 pares de espécimes do cancro do pulmão da não-pequeno-pilha (NSCLC) (tumor e de tecidos Atlas adjacentes), incluindo 14 carcinomas de pilha Squamous (SCCs) e 14 adenocarcinomas (ADCs), por IHC. A digitalização digital do slide inteiro das lâminas forneceu imagens digitais de alta qualidade (Figura 1a). Os resultados mostraram que o escore-H do câncer de pulmão foi significativamente maior que o dos tecidos adj...

A proteína de interação ZW10 (ZWINT) participa no ponto de verificação mitotic do eixo e na patogénese da carcinoma. Aqui, apresentamos uma metodologia de imunocoloração de ZWINT em tecidos de câncer de pulmão humano, seguido pela digitalização digital de slides inteiros e análise de imagem. Esta metodologia pode fornecer imagens digitais de alta qualidade e resultados confiáveis.

Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na patologia e na imunohistoquímica. A principal vantagem dessa técnica é que é mais rápida e que produz mídia digital com alta qualidade. Comece fixando uma amostra de tecido kung de três por três centímetros em 4% de paraformaldeído por 24 horas em temperatura ambiente.No dia seguinte, desidratar o tecido em imersões ascendentes de etanol à temperatura ambiente, seguido de três imersões em 100% xileno por 20 minutos por tratamento. Após a última imersão de xileno, coloque o tecido em parafina Celsius de 63 graus por 30 minutos, seguido de uma segunda imersão de 45 minutos em parafina Celsius fresca de 63 graus, depois mude a parafina mais uma vez para uma incubação final de uma hora. Quando a parafina tiver esfriado, use um microtome rotativo para adquirir cinco seções de espessura de micrômetros da amostra de tecido embarcada em parafina, capturando as seções em 20 slides poli-L-lysine revestidos de micrograma.Para desapóxi, coloque os slides em um forno Celsius de 65 graus por duas horas, seguido de imersão em dimetilbenzeno por 15 minutos e imersão em 100% xileno por 15 minutos, depois reidratando os slides em uma série de imersão de etanol descendente. Para reparo de antígeno, coloque os slides em uma caixa de reparo de antígeno e adicione 300 mililitros de líquido de reparação de ácido cítrico à caixa. Aqueça a caixa em um forno micro-ondas em alta potência por dois minutos, seguido de aquecimento em baixa potência para manter a ebulição por seis minutos.Quando os slides tiverem esfriado à temperatura ambiente, lave as amostras de tecido com três lavagens pbs molares de cinco minutos 0,01 em um agitador rotativo à temperatura ambiente. Para eliminar a peroxidase endógena, incubar os slides com peróxido de hidrogênio de 3% em água dupla destilada por 30 minutos em uma caixa molhada à temperatura ambiente. No final da incubação, lave os slides como demonstrado e conecte qualquer ligação inespecífica em cada seção com 100 microliters de 10% de soro de cabra por 39 minutos a 37 graus Celsius.Em seguida, rotule os tecidos com 100 microliters de anticorpo anti-ZWINT por slide a quatro graus Celsius durante a noite, seguido por três lavagens em PBS molar de 0,01. Após a última lavagem, incubar os slides com um anticorpo secundário apropriado por 30 minutos a 37 graus Celsius, seguido por três lavagens pbs molar de 0,01. Após a última lavagem, adicione os slides a 300 microliters de DAB fresco por 10 minutos, seguido por uma lavagem de 10 segundos com água da torneira em temperatura ambiente.Os contadores mancham os tecidos com solução de coloração de hematoxilina por dois minutos à temperatura ambiente, seguidos de lavagem na água da torneira por 15 minutos, depois desidratam o tecido novamente em imersões ascendentes de etanol, seguidas por duas imersões de 15 minutos em xileno à temperatura ambiente. Após a última imersão de 100% de etanol, monte as seções com 15 microliters de um xileno de 5% em solução de goma neutra e cubra cada amostra de tecido com um copo de cobertura. Para a varredura automática de lâminas inteiras das seções, primeiro permita que os slides sequem à temperatura ambiente por 12 horas para dessecar as amostras de tecido.Em seguida, no scanner automático de slides completos, selecione Brightfield manualmente e digite a interface de digitalização manual. Revise o nome dos slides e selecione um caminho de armazenamento para as imagens. Defina a área de digitalização e selecione as amostras de varredura usando a opção Limites definidos pelo usuário.O limiar é de cerca de 50 com um valor de expansão da área de digitalização de 200 micrômetros. Defina o valor de foco de digitalização e selecione o modo Foco Automático e Camada Única, em seguida, carregue os slides na estação de trabalho e inicie a digitalização automática. Quando todos os slides tiverem sido escaneados, salve as imagens para análise posterior.Para analisar as imagens das seções de tecido pulmonar, abra o software histopatológico de análise de imagens e selecione Computador Local para abrir o arquivo com os dados de digitalização. Selecione o nível de zoom apropriado e use Ajuste de cor para definir a cor para o contraste ideal, em seguida, circule e nomeie as regiões de interesse de cada imagem. Em seguida, sob plugins, selecione QC. O Construtor de Cenários vai aparecer.Selecione Density Quant e ajuste a barra de detecção. Ajuste os níveis de pontuação até que a intensidade de coloração das áreas circundadas seja semelhante à das imagens originais e armazene e nomeie o modelo como um novo arquivo, em seguida, aplique o modelo a outros slides e selecione Anotação Selecionada para permitir que o software calcule automaticamente a pontuação de APE para as regiões de interesse de cada imagem. A varredura digital total de seções de tecido pulmonar de tumores e tecidos não tumorais adjacentes de amostras de câncer de pulmão de células não pequenas produz imagens digitais de alta qualidade.Os escores de APE calculados a partir desses tipos de amostras de câncer de pulmão são tipicamente significativamente maiores do que aqueles determinados para os tecidos não cancerosos adjacentes. Além disso, os níveis de expressão ZWINT em seções de tecido carcinoma de células escamosas são frequentemente determinados como significativamente maiores do que os medidos em amostras de tecido abnocarcinoma. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de se preparar com alta qualidade das áreas tumorais ou tumorais durante a realização de varredura patológica.Após esse procedimento, outros métodos da microscopia podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Nem o método ou o método diferente para a varredura patológica. Após essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da digitalização patológica explorarem diagnósticos digitais no propósito da pesquisa.Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como máscaras devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

Pesquisa sobre o Câncer

A utilização de ratinhos repórter acoplado ao conjunto de montagem e a secção de coloração, microscopia e ensaios in vivo facilita a análise dos mecanismos subjacentes à padronização normal do tracto respiratório. Aqui descrevemos a forma como estas técnicas contribuiu para a análise de sinalização Wnt durante o desenvolvimento traqueal.

Estudar Wnt Signaling Durante Padronização de conduzir Airways

As células imunes residentes no pulmão, incluindo células dendríticas (DCs) em humanos, são essenciais para a defesa contra patógenos e alérgenos inalados. No entanto, devido à escassez de tecido pulmonar humano, os estudos são limitados. Este trabalho apresenta protocolos para processamento de biópsias endobrônquicas da mucosa humana para estudo de DCs pulmonares usando imuno-histoquímica e citometria de fluxo.

Células Humanas Lung dendríticas: distribuição espacial e fenotípica Identificação em endobrônquica Biópsias imunohistoquímica e citometria de fluxo

Tendo em conta o princípio dos 3R, modelos respiratórios como alternativas para estudos animais estão evoluindo. Especialmente para a avaliação dos riscos das substâncias respiratórias, há uma falta de ensaios adequados. Aqui, descrevemos o uso de fatias de pulmão humano de precisão de corte para a avaliação de substâncias no ar.

Avaliação do citotóxicos e efeitos imunomoduladores de substâncias no pulmão humano de precisão de corte fatias

Um protocolo detalhado para um painel de seis-marcador multiplex imunofluorescência é otimizado e executado, usando um corante automatizado para resultados mais consistentes e um menor tempo de procedimento. Esta abordagem pode ser adaptada directamente por qualquer laboratório de estudos imuno-oncologia.

Painel de imunofluorescência Multiplex automatizada para estudos imuno-oncologia em amostras de Carcinoma fixada em formol

Ozônio combinado e endotoxina bacteriana exposição de camundongos mostram morte celular generalizada, incluindo a de neutrófilos. Observamos adaptações celulares como interrupção da lamellipodia citoesquelética, aumento da expressão celular da complexa subunidade de synthase V ATP β e angiostatina na lavagem bronco-alveolar, supressão da resposta imune pulmonar e recrutamento retardado de neutrófilos.

Visualizando adaptações celulares pulmonares durante a lesão pulmonar aguda de ozônio e LPS induzidas por LPS

Este protocolo experimental descreve e otimiza um método de coloração por imunoistoquímica multiplex (IHQ), principalmente otimizando as condições de incubação de anticorpos de canal único e ajustando as configurações de anticorpos e canais para resolver os problemas de autofluorescência e crosstalk de canais em tecidos de câncer de pulmão de origem clínica.

Coloração por imunohistoquímica multiplex para tecido de câncer de pulmão embebido em parafina

Desenvolvemos uma técnica de processamento tecidual utilizando tecido pulmonar embebido em vibratótomo e agarose para gerar cortes pulmonares, permitindo a aquisição de imagens de alta resolução da arquitetura pulmonar. Empregamos a coloração de imunofluorescência para observar a expressão proteica espacial usando marcadores estruturais pulmonares específicos.

Secção Automatizada por Vibratomo de Tecido Pulmonar Incorporado em Agarose para Imagem por Fluorescência Multiplex

Este protocolo descreve um método de imagem residente tumor infiltrando T CD8 células rotulado com anticorpos fluorescente acoplados dentro de fatias de tumor de pulmão humano. Esta técnica permite análises em tempo real de migração de células T CD8 usando microscopia confocal.

Ex Vivo Imagem de linfócitos de T CD8 residente no Tumor de pulmão humano fatias utilizando microscopia Confocal

Um modelo animal é necessário decifrar o papel de células tumorais (CTC) em promover a colonização de pulmão durante a metástase do cancro em circulação. Aqui, nós estabelecemos e realizou com sucesso um na vivo do ensaio para teste especificamente a exigência de assembly de fibronectina poliméricos (polyFN) na CTC para a colonização de pulmão.

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

O manuscrito descreve um ensaio PCR digital baseada no chip para detectar uma rara variante de CDH1 transcrição (CDH1a) em normal fresco congelado e tecidos de tumor obtidos de pacientes com câncer gástrico.

Deteção de uma variante de transcrição raro CDH1 em tecidos de câncer gástrico fresco congelado pelo PCR Digital baseada em Chip

Aprenda a técnica de imunocoloração digital de ZWINT em tecidos pulmonares humanos para pesquisa em patologia do câncer. Este método produz imagens digitais de alta qualidade e resultados confiáveis para análise de expressão proteica.

Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

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