Análise digital de imunocoloração da proteína ZW10 interagindo em tecidos pulmonares humanos

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na patologia e na imunohistoquímica. A principal vantagem dessa técnica é que é mais rápida e que produz mídia digital com alta qualidade. Comece fixando uma amostra de tecido kung de três por três centímetros em 4% de paraformaldeído por 24 horas em temperatura ambiente.

No dia seguinte, desidratar o tecido em imersões ascendentes de etanol à temperatura ambiente, seguido de três imersões em 100% xileno por 20 minutos por tratamento. Após a última imersão de xileno, coloque o tecido em parafina Celsius de 63 graus por 30 minutos, seguido de uma segunda imersão de 45 minutos em parafina Celsius fresca de 63 graus, depois mude a parafina mais uma vez para uma incubação final de uma hora. Quando a parafina tiver esfriado, use um microtome rotativo para adquirir cinco seções de espessura de micrômetros da amostra de tecido embarcada em parafina, capturando as seções em 20 slides poli-L-lysine revestidos de micrograma.

Para desapóxi, coloque os slides em um forno Celsius de 65 graus por duas horas, seguido de imersão em dimetilbenzeno por 15 minutos e imersão em 100% xileno por 15 minutos, depois reidratando os slides em uma série de imersão de etanol descendente. Para reparo de antígeno, coloque os slides em uma caixa de reparo de antígeno e adicione 300 mililitros de líquido de reparação de ácido cítrico à caixa. Aqueça a caixa em um forno micro-ondas em alta potência por dois minutos, seguido de aquecimento em baixa potência para manter a ebulição por seis minutos.

Quando os slides tiverem esfriado à temperatura ambiente, lave as amostras de tecido com três lavagens pbs molares de cinco minutos 0,01 em um agitador rotativo à temperatura ambiente. Para eliminar a peroxidase endógena, incubar os slides com peróxido de hidrogênio de 3% em água dupla destilada por 30 minutos em uma caixa molhada à temperatura ambiente. No final da incubação, lave os slides como demonstrado e conecte qualquer ligação inespecífica em cada seção com 100 microliters de 10% de soro de cabra por 39 minutos a 37 graus Celsius.

Em seguida, rotule os tecidos com 100 microliters de anticorpo anti-ZWINT por slide a quatro graus Celsius durante a noite, seguido por três lavagens em PBS molar de 0,01. Após a última lavagem, incubar os slides com um anticorpo secundário apropriado por 30 minutos a 37 graus Celsius, seguido por três lavagens pbs molar de 0,01. Após a última lavagem, adicione os slides a 300 microliters de DAB fresco por 10 minutos, seguido por uma lavagem de 10 segundos com água da torneira em temperatura ambiente.

Os contadores mancham os tecidos com solução de coloração de hematoxilina por dois minutos à temperatura ambiente, seguidos de lavagem na água da torneira por 15 minutos, depois desidratam o tecido novamente em imersões ascendentes de etanol, seguidas por duas imersões de 15 minutos em xileno à temperatura ambiente. Após a última imersão de 100% de etanol, monte as seções com 15 microliters de um xileno de 5% em solução de goma neutra e cubra cada amostra de tecido com um copo de cobertura. Para a varredura automática de lâminas inteiras das seções, primeiro permita que os slides sequem à temperatura ambiente por 12 horas para dessecar as amostras de tecido.

Em seguida, no scanner automático de slides completos, selecione Brightfield manualmente e digite a interface de digitalização manual. Revise o nome dos slides e selecione um caminho de armazenamento para as imagens. Defina a área de digitalização e selecione as amostras de varredura usando a opção Limites definidos pelo usuário.

O limiar é de cerca de 50 com um valor de expansão da área de digitalização de 200 micrômetros. Defina o valor de foco de digitalização e selecione o modo Foco Automático e Camada Única, em seguida, carregue os slides na estação de trabalho e inicie a digitalização automática. Quando todos os slides tiverem sido escaneados, salve as imagens para análise posterior.

Para analisar as imagens das seções de tecido pulmonar, abra o software histopatológico de análise de imagens e selecione Computador Local para abrir o arquivo com os dados de digitalização. Selecione o nível de zoom apropriado e use Ajuste de cor para definir a cor para o contraste ideal, em seguida, circule e nomeie as regiões de interesse de cada imagem. Em seguida, sob plugins, selecione QC. O Construtor de Cenários vai aparecer.

Selecione Density Quant e ajuste a barra de detecção. Ajuste os níveis de pontuação até que a intensidade de coloração das áreas circundadas seja semelhante à das imagens originais e armazene e nomeie o modelo como um novo arquivo, em seguida, aplique o modelo a outros slides e selecione Anotação Selecionada para permitir que o software calcule automaticamente a pontuação de APE para as regiões de interesse de cada imagem. A varredura digital total de seções de tecido pulmonar de tumores e tecidos não tumorais adjacentes de amostras de câncer de pulmão de células não pequenas produz imagens digitais de alta qualidade.

Os escores de APE calculados a partir desses tipos de amostras de câncer de pulmão são tipicamente significativamente maiores do que aqueles determinados para os tecidos não cancerosos adjacentes. Além disso, os níveis de expressão ZWINT em seções de tecido carcinoma de células escamosas são frequentemente determinados como significativamente maiores do que os medidos em amostras de tecido abnocarcinoma. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de se preparar com alta qualidade das áreas tumorais ou tumorais durante a realização de varredura patológica.

Após esse procedimento, outros métodos da microscopia podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Nem o método ou o método diferente para a varredura patológica. Após essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da digitalização patológica explorarem diagnósticos digitais no propósito da pesquisa.

Não se esqueça que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como máscaras devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.