Name: Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Aprenda a cultivar córneas de porco ex vivo para estudar cicatrização de feridas em ambiente 3D multicelular. Este modelo permite avaliar efeitos de agentes terapêuticos e toxicidade de fármacos de forma controlada.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH-NEI R01 EY024942, pesquisa para evitar cegueira, Upstate Medical Universidade irrestrito fundos de investigação, e Lions distrito 20-Y. microscopia e análise de imagens de cortes de parafina foram realizadas no núcleo microscopia e preparação de lâmina histológica foi realizada no biorepositórios e no núcleo de patologia da faculdade de medicina de Icahn no Monte Sinai.

1. o órgão cultura
<ol><li>
Preparações
	<ol>
<li>Prepare a solução de ágar como segue. Em um pequeno frasco, prepare-se 1% de ágar e colágeno bovino de 1 mg/mL em DMEM-F12 até 20 mL. Trazer para ferver em uma chapa quente. Colocar a solução em um tubo cónico de 50 mL. Colocar o tubo em um banho de água em uma chapa quente para manter a solução de solidificação.</li>
		<li>Prepare a mídia de soro livre completadas (SSFM) conforme a composição fornecida na Tabela de materiais. Nota: A quantidade necessária de SSFM estar preparado depende do número de córneas para serem processados. Geralmente 30 mL é suficiente meios para 4 córneas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissecação Nota: Execute esta etapa em uma capa de dissecação ou capuz químico. Os olhos são fornecidos com tampas ainda presa em sacos individuais para proteger os globos.<ol>
<li>Remova globos de tampas com uma lâmina de borda reta cirúrgica em uma tábua de etanol-limpo. Remova o excesso de tecido gorduroso do olho usando uma lâmina ou uma pequena tesoura (Figura 3A, 3B).</li>
		<li>Depois de retirar a tampa, o globo, segure o globo posteriormente com fórceps e mergulhe imediatamente o olho em tampão fosfato salino (PBS). Mergulhe-o rapidamente 3x em iodo 10% (em um copo de 100 mL). Mergulhe rapidamente 2x em PBS (~ 100 mL numa proveta, mudança frequentemente PBS).</li>
		<li>Usando um pano limpo ou tecido, embrulhe o olho circunferencialmente com pressão suficiente para ter uma superfície corneal esticada para cortar com a trefina. Nota: tenha cuidado para evitar a toalha ou tecido de entrar em contato com a córnea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ferindo
	<ol>
<li>Use um trépano de 6mm para ferir o centro da córnea. Penetra o epitélio e o estroma anterior sem fazer uma ferida de espessura total através da córnea inteira. Nota: Se o endotélio é penetrado, uma perda de pressão e vazamento de fluido será vista. Neste caso, o olho deve ser Descartado.</li>
		<li>Colocar o trépano no centro da córnea, girá-la 180° no sentido horário e anti-horário 5 x (cada vez que a direção é alterada ele conta como uma vez), aplicando uma ligeira pressão para aprofundar a ferida. Nota: A ferida deve agora ser profunda o suficiente para permitir que um retalho de tecido ser levantado usando um par de pinças. Se isso não for a caso repita a etapa 1.3.2.</li>
		<li>Levante a aba das bordas. Ao mesmo tempo, com a outra mão ou com uma segunda pessoa, use uma lâmina, corte paralelo ao Globo de cortar o tecido, como a pinça continua a levantar a córnea anterior dentro da margem da ferida. Na conclusão desta etapa, deverá haver uma ferida circular localizada no centro da córnea (ver Figura 3 C, 3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cortando e removendo a córnea do globo
	<ol>
<li>Segurando o olho com o tecido, faça uma pequena incisão 1mm longe da borda da córnea com uma lâmina para que o limbo é incluído na cultura do órgão.</li>
		<li>Usando o pequeno, tesoura afiada acessar a incisão criada na etapa anterior para cortar ao redor do globo, mantendo uma margem de milímetros em toda a córnea para manter intacto o limbo.</li>
		<li>Coloque a córnea em um prato de 60 mm com 1 mL de PBS, ferida de lado para baixo até a montagem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montagem
	<ol>
<li>Certifique-se que o ágar chegou-se a uma temperatura morna (cerca de 25 ° C).</li>
		<li>Com dois pares de pinças, crie uma taça, segurando os dois lados da córnea com o lado endotelial. Adicione a solução de ágar aqueceu em córnea usando uma pipeta de transferência estéril até que esteja completo.</li>
		<li>Depois que o ágar endurece (geralmente aproximadamente 30-45 s) flip cuidadosamente a córnea com o ágar-ágar em placa de 60 mm (Figura 3E). Cubra com uma tampa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Incubação
	<ol>
<li>Adicionar 4 mL de SSFM à placa, mantendo as córneas em uma interface ar-líquido na fronteira estroma em 5% CO2 a 37 ° C. Atualize a mídia após 24 h e depois disso todos os dias. Nota: Se executar uma transfecção na ferida, omita os antibióticos até depois do transfection.</li>
		<li>Molhe a superfície da córnea uma vez ao dia, adicionando 1 gota de SSFM da mídia condicionadas no prato para manter a umidade. Para isso, leve o prato fora da incubadora, colocá-lo sob o capô, retire a tampa do prato, molhe a superfície com mídia de prato usando uma pipeta estéril, cubra novamente e colocá-lo de volta na incubadora.</li>
		<li>Para o nocaute do gene, tratar a ferida com gene-alvo ou controle siRNA que é complexado a um portador de lipídios-mediada conforme instruções do fornecedor (veja abaixo).</li>
		<li>Mistura de 5 µ l (50 pmol) de siRNA em 50 µ l de soro e reduzida mínima essencial mídia (EG., Opti-MEM). Misture 2 µ l de reagente de transfeccao em 50 µ l de soro reduzido mídia. Deixe este sentar-se por 5 min e em seguida, misturá-los.</li>
		<li>Adicione 200 µ l de mídia mínima reduzido-soro para a mistura de reagente/siRNA.</li>
		<li>Pipetar gota a gota sobre o ferimento e incubar durante 3 h.</li>
		<li>Lave siRNA da superfície corneal com mídia no prato. Altere a mídia de incubação para SSFM + antibióticos (consulte a Tabela de materiais). Continue a incubação como mencionado anteriormente (passos 1.6.1-1.6.2).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. histologia: Cortes de parafina e imunocoloração
<ol><li>
Preparação do tecido
	<ol>
<li>Após uma incubação de duas semanas, se usar algum do tecido para quantitativo em tempo real do polymerase reação em cadeia (qRT-PCR) análise, antes da fixação, cortada ao meio através da ferida, a córnea. Coloque esta metade ou apenas ¼ (também é de tecido suficiente) para estabilizar o reagente RNA-proteger.</li>
		<li>Usando um kit de isolamento padrão, isolar o RNA e executar qRT-PCR. Nota: Alternativamente, a parte ferida só pode ser isolada e testada para a expressão do gene.</li>
		<li>Coloque a outra metade da córnea em fitas de patologia do tecido e mergulhe no fixador (formol a 10%) durante 2 a 4 dias à temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Parafina incorporar esta metade da córnea ferida usando as técnicas padrão. Nota: Oriente a córnea ferida para garantir que o seccionamento de tecido irá produzir um corte transversal da córnea.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining usando 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
	<ol>
<li>
Dia 1
		<ol>
<li>Rótulo de slides corretamente usando um lápis. De paraffinize do tecido, colocando slides em um frasco com agente (2 trocas, 10 min cada) de limpeza.</li>
			<li>Re-hidratar o tecido pela transferência de slides para etanol em diminuir as concentrações (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5min para cada alteração).</li>
			<li>Execute a recuperação do antígeno por microondas dos slides em um frasco de plástico com tampão citrato (10 mM, pH 6,4) por 5 min. Primeiro ciclo 5 min à 50% de potência. Encha a jarra com tampão citrato e repita. Esfriar por 10 min.</li>
			<li>Lave 3x com PBS, 2 min cada. Permeabilize tecido com 1% Triton X-100 em PBS 10 min no bloco RT. seções com 3% de soro de cabra normal (NGS) por 1h no RT em câmara úmida.</li>
			<li>Incubar o tecido com anticorpo primário (1: 100 ou como sugere o fornecedor) em 3% NGS durante a noite a 4 ° C (300 µ l por slide).</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Dia 2
		<ol>
<li>Enxágue os slides 3x com PBST (PBS, acrescido de 1% Tween 20), 2 min cada. Coloque slides em 3% H2O2 por 10 min bloquear a peroxidase endógena. Lave 3x com PBST, 2 min cada. Incubar as seções com anticorpo secundário HRP (1: 250) em 3% NGS por 1h no RT (300 µ l por slide).</li>
			<li>Lave slides 3 x PBST, 2 min cada. Trate de slides com o kit DAB. Adicionar 300 µ l/slide de 3 min. lavagem desliza com dH2O 2 x (mergulhos rápidos).</li>
			<li>Counterstain com hematoxilina por 20 s. lavagem do slide com dH2O 2 x (mergulhos rápidos). Mancha com agente de anil para 20 s. enxágue em dH2O por 20 s. desidratando tecido colocando slides em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 100%, 100%, todos os mergulhos rápidos).</li>
			<li>Seque os slides em uma toalha de papel sob o capô para 10-20 min.</li>
			<li>Montagem de slides usando 1 gota de montagem mídia, cobrir com lamínula. Rotular e armazenar em RT</li>
			<li>Imagem dos slides sob um microscópio e quantificar o sinal DAB com ImageJ7 (ver secção 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Immunostaining: fluorescência
	<ol>
<li>No dia 1 siga os passos descritos na etapa 2.2.1. Execute as seguintes etapas no dia 2.</li>
		<li>Enxágue os slides 3 x em PBST por 2 min cada. Incubar as seções com anticorpo secundário fluoróforo-tag em 3% NGS (1: 200) por 1h no RT</li>
		<li>Lave 3 x em PBST, 2 min cada. Montagem de slides usando 1 gota de 4 ′, mídia de montagem 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e cobrir com uma lamela. Seca na toalha de papel sob a capa de 30 min. loja no escuro a 4 ° C até imagens de fluorescência.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantificação usando Image J
	<ol>
<li>Baixe a versão de "Fiji" do ImageJ, que inclui os plugins necessários para DAB, quantificação de coloração.</li>
		<li>Abrir uma imagem em Fiji e selecione imagem → → de cor cor deconvolução.</li>
		<li>Selecione "DAB-H" como a mancha e, em seguida, clique Okey. Três novas imagens aparecerão. Selecione a imagem que contém a única mancha de DAB.</li>
		<li>Para quantificar stromal coloração somente, use a função de borracha ImageJ para remover o epitélio da imagem DAB.</li>
		<li>Selecione analisar → medida (ou Ctrl + M) e registre o valor.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Este protocolo descreve um modelo para o estudo de cicatrização de feridas, em um ambiente 3D estratificado natural. Uso da cultura de órgãos como um intermediário entre a cultura de células e de estudos in vivo reduz significativamente os custos, bem como reduzir os procedimentos em animais vivos. Outros modelos 3D tem sido de grande benefício para o campo, incluindo Self sintetizando o gel de colágeno, feita a partir de fibroblastos da córnea humana primária2 ou estas mesmas células incorporados...

Cicatrizes na córnea resultantes de infecção, trauma ou lesão podem levar a debilitante opacidades e perda de visão permanente. Assim, há uma necessidade crítica para identificar caminhos que podem ser direcionados para a intervenção terapêutica. Opções atuais do tratamento são limitadas e consistem principalmente de transplantes da córnea, que não são acessíveis aos pacientes em todo o mundo. Cultura de células 3D estudos1,2e ambos humanos (Figura 1) e córneas animais podem ser utilizadas para 2D. Córneas de cadáver humano não são adequadas para transplante podem ser obtidas em bancos de olhos ou bancos de tecidos centralizado (nacional doença pesquisa Interchange (NDRI)), e olhos de animais podem ser obtidos de um matadouro. Células epiteliais da córnea primárias, fibroblastos do estroma e, mais recentemente, as células endoteliais, podem ser isoladas e cultivadas destes tecidos para cicatrização de feridas e toxicologia estuda3,4,5. Além da importância de compreender a base molecular da cegueira doença ocular, a acessibilidade do tecido e a capacidade de cultura primária de células fez a córnea um sistema importante modelo para estudo. A córnea é ideal para testar os efeitos dos agentes em cicatrizes como a córnea normal é transparente e certos tipos de feridas criam opacidades ou cicatrizes fibróticas (revistas em6). Várias em vivo modelos cura de ferida da córnea também tem sido utilizados extensivamente para cicatrizes de estudos1. Menos utilizado tem sido o ex vivo da córnea ferida cura modelo7,,8 é descrever em detalhe aqui. O objetivo desse método é quantificar resultados cicatricial caracterizados por fabricantes fibróticos em um 3D multicelulares corneal ex sistema de modelo vivo.
Epiteliais da córnea, ferindo que não infringe a membrana basal epitelial normalmente fecha dentro de 24-72 h9. Logo após o ferimento, as células na borda do epitélio começam espalhando e migrando para a superfície epitelial livre, para restabelecer a função da barreira epitelial. Esta atividade sequencialmente é seguida pela ativação da proliferação da córnea basocelular primeiro e, numa fase posterior, de células precursoras, localizado na zona exterior estroma para alcançar a recuperação de células epiteliais em massa10,11. Estas feridas cicatrizam muitas vezes sem deixar cicatrizes. No entanto, uma ferida que penetra a membrana basal do estroma geralmente resulta em cicatriz formação1. Após ferimento do estroma da córnea, o estroma é preenchido com células de várias origens, incluindo células do estroma residentes diferenciadas, bem como derivados da medula óssea Fi12,13,14. Cicatrizes fibróticas é caracterizada pela persistência de miofibroblastos em uma cura ferida. Estes myofibroblasts patológicos demonstram maior adesão através da acumulação das integrinas em adesões focais, fibras de estresse de actina (α-SMA) músculo contrátil de α-liso e ativação local da matriz extracelular (ECM)-isolado latente-transformar o fator de crescimento-beta (TGFβ). A diferenciação das células epiteliais-derivado, conhecido como epitélio de transição mesenquimal (EMT), também pode contribuir para a formação de6da cicatriz.
Há um equilíbrio delicado entre a diferenciação celular e apoptose após ferimento. Por causa da violação na membrana do porão, crescimento fatores tais como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e TGFβ de lágrimas e o epitélio banham o estroma, induzindo a diferenciação de Miofibroblasto, um loop de autócrina sustentado de ativação TGFβ e o secreção de desorganizada fibrótico ECM15,16. A persistência de miofibroblastos na ferida curada promove haze e cicatrizes na córnea (Figura 2). No entanto, em regeneratively curado ferida embora myofibroblasts desenvolver, eles apoptose e, portanto, estão ausentes ou significativamente reduzida em número no tecido curado (revisto em referência6,10). Assim, a pesquisa em cicatrizes fibróticas centrou pelo menos em parte no direcionamento de moléculas que impedem o desenvolvimento excessivo de Miofibroblasto ou Miofibroblasto persistência17,18. Porque a persistência de Miofibroblasto caracteriza doença cicatriz e fibrótica em todos os tecidos19, a córnea pode ser útil como um sistema modelo para estudar os mecanismos celulares gerais da fibrose.
Em nosso sistema de modelo, a córnea é ferida com uma lâmina cilíndrica chamada uma trefina enquanto ainda na globo. Humano e as córneas de porco podem ser feridas com qualquer um 6 ou 7 mm trefina; para córneas de coelho um trépano de 6mm é preferencial. A córnea de porco é semelhante em tamanho da córnea humana. Porque eles são custo-eficaz e prontamente disponível em grandes números, córneas de porco são rotineiramente utilizadas para cultura de órgãos. Além disso, os anticorpos e siRNAs feita reagir com humanos têm consistentemente cross-reacted com porco7. Após ferimento, córneas são cortadas do globo com o limbo intactas e montado sobre um base de agar/colágeno. As córneas são cultivadas em meios de comunicação isento de soro mais estabilizaram vitamina C para simular a proliferação de fibroblastos e deposição de ECM20. A adição de soro, nem fatores de crescimento são necessários para induzir a formação de Miofibroblasto7. As córneas são rotineiramente fixadas e processadas para histologia após duas semanas de cultura. Para knockdown do gene, ou para testar os efeitos de um agente na cicatrização de feridas, a ferida pode ser tratada com siRNA na ferida depois ferindo7 ou um agente solúvel pode ser adicionado para a mídia, respectivamente,8.

<table><tbody><tr><td>Caneta PBS</td><td>Gibco</td><td>10-010-023</td><td></td></tr><tr><td>Strep&nbsp;</td>Solução <td>de Colágeno Bovino 91670049</td><td></td> <td>MP Biomedicals</td></tr><tr><td></td><td>Advance Biomatrix</td><td>5005</td><td></td></tr><tr><td>Olhos de porco com pálpebras anexadas&nbsp;</td><td>Pel-freeze, Arkansas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6.0 mm trephine&nbsp;</td><td>Lâmina Cirúrgica Katena</td><td>K28014</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tesoura pequena Personna</td><td>0.009</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>895110</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td><td>Fisher</td><td>08953-F</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes&nbsp;</td><td>Kimberly-Clark&trade; 34120</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de células de 60 mm&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Supplemented Serum- Free media (SSFM)</td><td></td><td></td><td>Adicione todos os seguintes componentes ao DMEM/F-12:&nbsp; ITS, RPMI, Glutationa, L-Glutamina, MEM Aminoácidos não essenciais, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicina, Vitamina C.&nbsp; </td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td></td></tr><tr><td>ITS Suplemento de Mídia Líquida&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td>100X</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Solução de Vitaminas&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R7256</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutationa</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>Use em 1 &micro; g/mL. Congelar alíquotas; Não reutilize após o descongelamento.</td></tr><tr><td>Solução de L-glutamina a 1%&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>100x</td></tr><tr><td>MEM Solução de aminoácidos não essenciais&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td>100x</td></tr><tr><td>MEM Solução de piruvato de sódio&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td>1 M Stocks (1,000x) e congelamento em aliquits de uso único.&nbsp; Use do freezer sempre que a mídia for feita.</td></tr><tr><td>ABAM&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7292</td><td>100x</td></tr><tr><td>Gentamicina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>30-005-CR</td><td>200x</td></tr><tr><td>Vitamina C&nbsp;</td><td>Wako</td><td>070-0483</td><td>2-0-aD Ácido Glucopiranosil-Ascórbico. Estoques de 1 mM (1000x)</td></tr><tr><td>10% Iodo&nbsp;</td><td>de</td> Caminho de Tecido <td>Fisher Chemical SI86-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>22-272416</td><td></td></tr><tr><td>Soro de Cabra Normal (NGS)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>Usamos 3% de Mídia de Montagem NGS</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>Cofre Transparente&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>314-629</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Etílico</td><td>Ultra Puro</td><td>200CSGP</td><td>200 Proof, diluído a 100%, 70%, 50%)&nbsp;</td></tr><tr><td>Citrato de sódio&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP327</td><td>10 mM, pH 6.4</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>EMD Millipore</td><td>M10742500</td><td></td></tr><tr><td>Agente azulado&nbsp;</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>220-106</td><td></td></tr><tr><td>1% Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>9002-93-1</td><td>Diluído em PBS</td></tr><tr><td>0.1% Tween 20&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP337</td><td>Diluído em PBS</td></tr><tr><td>3% de Peróxido de Hidrogênio&nbsp;</td><td>Kit DAB Fisher</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>Ágar&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500 Solução de</td><td>ágar: prepare 1% de ágar e 1 mg/mL de colágeno bovino em DMEM-F12 até 20 mL</td></tr><tr><td>de Parafilm</td><td></td><td></td> Bermis 13-374-12 <td></td></tr><tr><td>Câmara úmida</td><td>Use qualquer câmara, cubra-a com lenço umedecido e coloque uma camada de parafilme sobre ela.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen RNAprotect Reagente Celular</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp; 76104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion PureLink RNA Mini Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fibronectina-EDA Anticorpo</td><td>Sigma</td><td>F6140</td><td>1:200 Diluído em&nbsp; 3% de soro de cabra normal</td></tr><tr><td>Anti-alfa de actina de músculo liso Anticorpo</td><td>Sigma</td><td>A2547 ou C6198 (cy3 conjugado)</td><td>1:200 Diluído em 3% de soro de cabra normal</td></tr><tr><td>Permafluor&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Gt anti -MS IgG (H+L) Anticorpo Secundário, HRP&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>62-6520</td><td>1:100 diluído em soro de cabra normal a 3% (para coloração a-SMA, DAB)</td></tr><tr><td>Gt anti -MS IgM (H+L) Anticorpo Secundário, HRP&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>PA1-85999</td><td>1:100 diluído em 3% de soro de cabra normal (para FN-EDA, coloração DAB)</td></tr><tr><td>Gt anti -MS IgG (H+L) Anticorpo Secundário, Cy3&nbsp;</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>115-165-146</td><td>1:200 Diluído em&nbsp; 3% de soro de cabra normal (para a-SMA, coloração de fluorescência)</td></tr><tr><td>&nbsp; Zeiss Axioplan2&nbsp;</td><td>Instrumentos</td>diagnósticos <td></td> do microscópio <td>SPOT-2 de Zeiss</td></tr><tr><td></td><td>, alturas esterlinas,</td><td>câmera</td><td></td> do CCD de Michigan</tr></tbody></table>

ex vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

A córnea tem sido amplamente utilizada como um sistema modelo para estudar a cicatrização de feridas. A capacidade de gerar e utilizar células primárias de mamíferos em duas dimensões (2D) e a três dimensões (3D) cultura gerou uma riqueza de informações não só sobre Biologia da córnea, mas também sobre a ferida cura, Miofibroblasto, biologia e cicatrizes em geral . O objetivo do protocolo é um sistema de ensaio para quantificar o desenvolvimento Miofibroblasto, que caracteriza a cicatriz. Vamos demonstrar um órgão corneal cultura ex vivo modelo usando olhos de porco. Neste anterior fotorrefrativa ferida, córneas ainda na globo estão feridas com uma lâmina circular chamada uma trefina. Um plugue de aproximadamente 1/3 da córnea anterior é removido, incluindo o epitélio, a membrana basal e a parte anterior do estroma. Após ferimento, córneas são cortadas do globe, montadas sobre uma base de colagénio/agar e cultivadas por duas semanas, complementado-soro livre médio com estabilizado vitamina C para aumentar a proliferação celular e secreção de matriz extracelular pelos fibroblastos residentes. Ativação de miofibroblastos no estroma anterior é evidente na córnea cicatrizada. Este modelo pode ser usado para o ensaio de fechamento da ferida, o desenvolvimento de miofibroblastos e marcadores fibróticas e para estudos de toxicologia. Além disso, os efeitos de inibidores de pequenas moléculas, bem como a transfeccao siRNA lipídica mediada por knockdown do gene podem ser testados neste sistema.

Imuno-histoquímica é o ensaio principal utilizado para analisar o sucesso do ex vivo ferida cura experimento. A Figura 4 mostra o epitélio e o estroma anterior no tecido de controle (Figura 4A, 4B). Seis horas após o ferimento, o epitélio estava ausente (Figura 4, 4-D). Seis dias após o ferimento como esperado, o epitélio tinha crescido (Figura 4...

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Este artigo descreveu um método simples para avaliar o ferimento em um sistema de modelo de cultura de órgãos tridimensional e multicelular. Fazemos isso usando olhos de porco, mas mesmo que você não esteja familiarizado com os olhos, você pode fazer este ensaio. Como visão geral, recebemos olhos suínos, cortamos os globos, fazemos uma ferida circular na córnea que passa pelo epitélio e cerca de um terço do estroma.Cortamos a córnea, montamos em uma base de Ágar, e colocamos essa construção na incubadora. O tecido vai preencher a criação de uma cicatriz na córnea. Você não precisa adicionar nenhum fator de crescimento, ou mesmo soro.Isso é feito em mídia sem soro. Embora isso seja realizado na córnea, pode ser usado como um sistema modelo de cicatrização fibrosa em geral. Como muitas das vias celulares que são ativadas durante as cicatrizes são semelhantes entre os sistemas.Em um capô de biossegurança, use uma lâmina cirúrgica de borda reta para remover o globo da tampa em uma tábua de corte limpa por etanol, e remova o excesso de tecido gorduroso de cada olho. Segurando o globo limpo posteriormente com fórceps imediatamente mergulham o olho na PBS seguido de três mergulhos rápidos

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Medicine

Medicina

Relatamos uma técnica para a fabricação de microbolsas dentro membranas electrospun para estudar o comportamento das células. Especificamente, descreve-se uma combinação de microstereolithography e de electrospinning para a produção de PLGA (poli (láctido-co-glicólido)) dispositivos de biomateriais córnea equipados com microestruturas.

Combinação de Microstereolithography e Electrospinning Produzir Membranas Equipado com nichos para a Regeneração da córnea

Descrito aqui é o estabelecimento de um modelo de cirurgia de catarata simulada ex vivo clinicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de resposta à lesão de tecidos epiteliais dentro de seu microambiente nativo.

Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

Este protocolo descreve um método para infligir uma abrasão na superfície ocular do mouse e a seguir a ferida que daí em diante o processo de cura. O protocolo se aproveita de uma rebarba ocular para remover parcialmente o epitélio superficial do olho em camundongos anestesiados.

Cicatrização de feridas abrasão epitelial da córnea com Burr Ocular como um modelo para córnea

Aqui, um protocolo passo a passo para a preparação e o cultivo de botões córneos rachados suínos é apresentado. Como este modelo organo-tipicamente cultivado da cultura do órgão mostra taxas de morte da pilha dentro de 15 dias, comparável às córneas doadoras humanas, representa o primeiro modelo permitindo o cultivo a longo prazo de córneas não-humanas sem adicionar o Dextran tóxico.

Um modelo de cultura de órgão endotelial corneano porcina usando Split córnea botões

Aqui, apresentamos um protocolo para desprender as células endoteliais da córnea (CEC) da membrana de Descemet (DM) usando um laser de neodímio:YAG (Nd:YAG) como um modelo de doença ex vivo para ceratopatia bânouca (BK).

Desenvolvimento de um modelo experimental não invasivo, assistido a laser de perda de células endoteliais córneas

Este artigo descreve um protocolo passo a passo para criar um modelo de ceratite porcina ex vivo de ceratite bacteriana. Pseudomonas aeruginosa é usado como organismo prototípico. Este modelo inovador imita a infecção in vivo, pois a proliferação bacteriana depende da capacidade da bactéria de danificar o tecido córnea.

Estabelecendo um modelo de córnea porcina ex vivo para estudar tratamentos medicamentosos contra ceratite bacteriana

Aqui, um protocolo para criar uma ferida de abrasão epitelial córnea central no rato usando uma trefina e um taco de golfe sem corte é descrito. Este modelo de cura de feridas na córnea é altamente reprodutível e agora está sendo usado para avaliar a cicatrização comprometida da ferida córnea no contexto das doenças.

Um modelo de abrasão epitelial para estudar a cicatrização da ferida córnea

Aqui, modelos animais baseados em camundongos e coelhos são desenvolvidos para lesão mecânica e química do epitélio corneano para triagem de novas terapêuticas e do mecanismo subjacente.

Modelos Animais Ex Vivo e In Vivo para Lesões Mecânicas e Químicas do Epitélio da Córnea

Descemet's Stripping Only é um procedimento experimental em que pacientes com gutae córnea central resultante da Distrofia Corneal Endotelial De Fuchs têm a membrana de Descemet despojada para células periféricas para regenerar a camada endotelial. Apresentamos nova metodologia simulando DSO em córneas humanas distróficas ex vivo com cura acelerada estimulada pelo eFGF1 (NM141).

Um modelo de cultura de órgãos córneas humanas de descascamento de descemet apenas com cura acelerada estimulada pelo fator de crescimento do fibroblasto projetado 1

O presente protocolo demonstra as diferentes etapas envolvidas na ferida da córnea de um filhote embrionário em ovo. As córneas regeneradoras ou totalmente restauradas podem ser analisadas para potencial regenerativo usando várias técnicas celulares e moleculares após o procedimento de ferir.

Investigando regeneração de tecido sem cicatrizes em córneas de filhotes feridos embrionários

A cultura de órgãos ex vivo da córnea suína e a cicatrização de feridas epiteliais fornecem um meio econômico, ético, reprodutível e quantitativo para testar a toxicidade ocular de produtos químicos. Eles também ajudam a elucidar os mecanismos subjacentes à regulação da epitelização e reparo tecidual e na avaliação terapêutica para o tratamento de ceratopatia diabética e cicatrização retardada de feridas.

Avaliação da toxicidade terapêutica e química usando córneas suínas cultivadas em órgãos e cicatrização de feridas epiteliais

Aprenda a cultivar córneas de porco ex vivo para estudar cicatrização de feridas em ambiente 3D multicelular. Este modelo permite avaliar efeitos de agentes terapêuticos e toxicidade de fármacos de forma controlada.

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

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