Name: Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda a técnica de injeção intratecal com lidocaína para entrega de vírus adeno-associados no sistema nervoso central de camundongos. Este método utiliza paralisia transitória como indicador visual para avaliar a eficácia da transdução em pesquisas de terapia gênica neurológica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento Provincial de recursos humanos da HEBEI e Segurança Social (CY201605) e uma bolsa da Fundação ciência Natural da província de Hebei (H2017206101), e agradecemos muito ao Dr. Gao Guangping, que forneceu o vírus adeno-associados para Este estudo.

Camundongos FVB/NJ foram criados na instalação de animais de laboratório chave de Neurologia de Hebei. Todos os experimentos de rato foram aprovados pelo segundo Hospital de Hebei médica Universidade Comitê de ética e realizados de acordo com os regulamentos de animais de laboratório, promulgada pelo Ministério da ciência e tecnologia da República Popular da China.
1. preparação da solução-mãe cloridrato de lidocaína 20%
<ol><li>Pese 2 g de cloridrato de lidocaína. Adicione 5 a 6 mL de água estéril e vórtice suavemente. Aumente o volume para um total de 10 mL com água estéril.</li>
	<li>1.2 filtre a solução através de filtros de 0,2 mícron. Alíquota da solução, 1ml por microcentrifuga de 1,5 mL do tubo e selá-lo com uma película de vedação. Loja a 4 ° C.</li>
</ol>2. direct intratecal AAV entrega em ratos acordados
<ol><li>Limpe a área de trabalho usando gaze esterilizada com 70% de etanol e preparar os materiais necessários, conforme mencionado na tabela 1.</li>
	<li>Prepare-se 100 µ l de cloridrato de lidocaína AAVrh.10/1% complexo adicionando 95 µ l de solução rAAVrh10 (5 x 1012 genoma cópias/mL) em um tubo estéril de microcentrifuga µ l 200 e adicione 5 µ l de solução-mãe cloridrato de lidocaína 20%. Misture bem pipetando para cima e para baixo. Em seguida, armazene a solução de vírus no gelo (4 ° C). Nota: 8 µ l por rato4 será usado.</li>
	<li>
Preparar a seringa com a solução AAV para injeção
	<ol>
<li>Monte um 25 µ l Hamilton a seringa com uma agulha 27G e alinhe a ponta chanfrada da agulha com a escala volumétrica na seringa.</li>
		<li>Desenhe 8 µ l com 4 x 1010 cópias do genoma da solução de vírus para a seringa delicadamente. Certifique-se de remover as bolhas de ar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparando o mouse Nota: ratos FVB/NJ masculino ou femininos (30 a 70 dias de idade) foram utilizados neste estudo. Injeção foi operada no capô.<ol>
<li>Esterilize a área de trabalho em um capuz com etanol a 70%. Coloque o mouse acordado (masculinos ou femininos, 30-70 dias de idade, 13-20 g de peso) em um bedpiece em posição de capuz. Cubra a parte superior do corpo com gaze estéril para acalmar o mouse e evitar ser mordido.</li>
		<li>Corrigi o animal, agarrando-se adequadamente e firme em sua cintura pélvica com um polegar em um lado e o dedo indicador/médio dedo do outro lado. Manter a pele entre bilaterais cinturas pélvicas tensa com o polegar e o indicador. Segure suavemente na parte superior do corpo do animal com a palma da mão.</li>
		<li>Raspar o pelo nas costas entre a cintura pélvica bilateral e, em seguida, esterilizar a superfície da pele com um iodeto esfoliante e 70% do etanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De injeção intratecal12
	<ol>
<li>Sinta o espaço intervertebral ao longo da linha média entre a cintura pélvica bilateral com um polegar ou o dedo indicador da outra mão e pressione uma marca com uma unha para indicar o espaço intervertebral L5-L6 (localizar o local da injeção).</li>
		<li>Girar a base da cauda ligeiramente e suavemente para indicar a linha média da coluna vertebral. Ajuste o bisel da agulha para a cabeça do animal antes da injeção (mencionado na etapa 2.3.1).</li>
		<li>Certifique-se que os animais são fixados firmemente e alinham a agulha ao longo da linha mediana da coluna vertebral.</li>
		<li>Inserir a agulha suavemente e verticalmente (ou incline ligeiramente a 70-80°) na interseção de recuo e mantenha a seringa em um plano sagital central. Reduzir o ângulo de aproximadamente 30° lentamente, quando ele se conecta ao osso e, em seguida, enfiar a agulha no espaço intervertebral. Nota: Um filme de cauda evidente de repente é um sinal de entrada bem sucedida no espaço intradural. Uma vez que a agulha entra no espaço intervertebral, vai sentir a ponta da agulha firmemente preso. A agulha 27G utilizada neste estudo é adequada para a entrega IT em ratos, mas não ratos.</li>
		<li>Injecte a solução de vetor (mencionada na etapa 2.2). Iniciar o temporizador e injetar 8 µ l da solução de vetor a uma velocidade de 1 µ l/4 s. reter a agulha aproximadamente 1 min depois de terminar entrega. Retire a agulha com rotação suave para evitar vazamento.</li>
		<li>Marca a fraqueza transitória do mouse Membros imediatamente após o parto para avaliar a qualidade de injeção4. Nota: O padrão é da seguinte forma4. Pontuação 0: nenhuma fraqueza; escore 1: menor fraqueza dos membros posteriores sem anormalidade da marcha; Pontuação 2: moderada fraqueza dos membros posteriores com anormalidade óbvia da marcha; Pontuação 3: completar a paralisia dos membros posteriores; marcar 4: completar a paralisia dos membros posteriores, falta de ar e fraqueza moderada dos membros dianteiros; e pontuação 5: completa paralisia de todos os quatro membros e evidente falta de ar.</li>
		<li>Mova o mouse de volta para a gaiola para a recuperação da paralisia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Limpar
	<ol>
<li>Lave a seringa com 1 mL de água estéril. Classificar materiais de laboratório e coletar todos os materiais não-descartáveis para a esterilização autoclave. Limpe o banco com etanol a 70%.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. tecido preparação para a coloração imuno-histoquímica
<ol><li>
Coleção de tecido
	<ol>
<li>Anestesia profundamente ratos no pós-injeção de 21 dias com 3% hidrato de cloral (0,1 mL/10g) por injeção intraperitoneal.</li>
		<li>Perfuse transcardially com 20 mL de PBS gelado de 0,01 M (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K.2HPO4 8,1 mM, pH 7,4) em primeiro lugar, então 4% gelada paraformaldeído (em PBS de 0,01 M) com bomba (10 mL/min por 1 min, em seguida 5 mL/min. para 9 min). Atenção: Paraformaldeído é tóxico e cancerígeno. Amanhar-apenas a coifa usando luvas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissecação do cérebro e da medula espinhal
	<ol>
<li>Corrigir os membros e a cabeça de cada animal em posição na capa de uma caixa de espuma com agulhas de seringa, em seguida, tira e remover a pele da cabeça ao Sacro com tesoura.</li>
		<li>Clip do crânio entre os olhos, corte ao lado da rota média do crânio e linha horizontal sobre o cerebelo e, em seguida, abrir o crânio para cada lado.</li>
		<li>Levante o osso occipital com pinças e abrir o canal medular bilateral com tesouras oftálmicas. Corte as costelas em ambos os lados e remova a metade superior das vértebras com cuidado.</li>
		<li>Levante o cérebro com uma pinça curvada e cortar os nervos da base do crânio e, em seguida, dissecar cuidadosamente para fora o cérebro ea medula espinhal. Fixar os tecidos em paraformaldeído 4% por 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de fatias de tecido
	<ol>
<li>Crioproteção do cérebro e da medula espinhal cervical e lombar em 30% de solução de sacarose durante a noite a 4 ° C. Incorporar o tecido no ideal da temperatura de corte (OCT) composto e congelar rapidamente com nitrogênio líquido.</li>
		<li>Corte o tecido na 25 µm usando um criostato e armazenar as seções congeladas em PBS 0,01 M a 4 ° C para uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. imuno-histoquímica
<ol><li>Pré-tratamento seções flutuantes em 1% H2O2 por 10 min, em seguida, lave em PBS durante 10 min. Incubar em uma solução de bloqueio contendo 5% de soro e detergente não-iônico 0,3% em PBS por 1h.</li>
	<li>Incubar as fatias com anticorpos primários correspondentes durante a noite a 4 ° C. Lave as seções em PBST (0,2% Tween 20 em PBS) por 30 min (3 vezes por 10 min cada).</li>
	<li>Incube as fatias com anticorpo de biotina-secundário correspondente à temperatura ambiente por 1 h. lavagem em PBST por 30 min (3 vezes por 10 min cada).</li>
	<li>Incubar as secções com peroxidase de biotina afinidade complexa por 40 min e mancha com agente achromogenic. Montar as seções sobre guias e seque bem.</li>
	<li>Mergulhe os slides em etanol anidro por 5 min e xileno por 10 min e, em seguida, selar os slides com um meio de montagem. Finalmente, imagem dos slides com um microscópio equipado com um dispositivo de carga acoplada (CCD) em x 100 x 200 e 400 ampliações de x.</li>
</ol>

<ol><li>Murlidharan, G., Samulski, R. J., Asokan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+adeno-associated+viral+vectors+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Biology of adeno-associated viral vectors in the central nervous system.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 76(2014).</li>
<li>Lentz, T. B., Gray, S. J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22001604">Viral vectors for gene delivery to the central nervous system.</a> Neurobiology Disease. 48 (2), 179-188 (2012).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+CNS+transduction+of+adult+mice+by+intravenously+delivered+rAAVrh.8+and+rAAVrh.10+and+nonhuman+primates+by+rAAVrh.10%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Global CNS transduction of adult mice by intravenously delivered rAAVrh.8 and rAAVrh.10 and nonhuman primates by rAAVrh.10.</a> Molecular Therapy. 22 (7), 1299-1309 (2014).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+Injection+of+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+into+the+Lumbar+Cistern+Delivers+Transgene+Expression+Throughout+the+Whole+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Single Injection of Recombinant Adeno-Associated Virus into the Lumbar Cistern Delivers Transgene Expression Throughout the Whole Spinal Cord.</a> Molecular Neurobiology. 53 (5), 3235-3248 (2016).</li>
<li>Hastie, E., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+at+50%3A+a+golden+anniversary+of+discovery%2C+research%2C+and+gene+therapy+success--a+personal+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus at 50: a golden anniversary of discovery, research, and gene therapy success--a personal perspective.</a> Human Gene Therapy. 26 (5), 257-265 (2015).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-Associated+Virus-Based+Gene+Therapy+for+CNS+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-Associated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.</a> Human Gene Therapy. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Tanguy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+AAVrh10+provides+higher+transgene+expression+than+AAV9+in+the+brain+and+the+spinal+cord+of+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Systemic AAVrh10 provides higher transgene expression than AAV9 in the brain and the spinal cord of neonatal mice.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 36(2015).</li>
<li>Federic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+spinal+motor+neuron+transduction+following+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Robust spinal motor neuron transduction following intrathecal delivery of AAV9 in pigs.</a> Gene Therapy. 19, 852-859 (2012).</li>
<li>Ayers, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+efficient+transduction+of+spinal+cord+and+brain+following+neonatal+AAV+injection+and+potential+disease+modifying+effect+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Widespread and efficient transduction of spinal cord and brain following neonatal AAV injection and potential disease modifying effect in ALS mice.</a> Molecular Therapy. 23 (1), 53-62 (2015).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Intrathecal+Injection+of+rAAVrh10+Enhances+its+Transduction+of+Spinal+Cord+and+Therapeutic+Efficacy+in+a+Mutant+SOD1+Model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Slow Intrathecal Injection of rAAVrh10 Enhances its Transduction of Spinal Cord and Therapeutic Efficacy in a Mutant SOD1 Model of ALS.</a> Neuroscience. 365, 192-205 (2017).</li>
<li>Borel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+rAAVrh10+Mediated+SOD1+Silencing+in+Adult+SOD1%28G93A%29+Mice+and+Nonhuman+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Therapeutic rAAVrh10 Mediated SOD1 Silencing in Adult SOD1(G93A) Mice and Nonhuman Primates.</a> Human Gene Therapy. 27 (1), 19-31 (2016).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+a+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: a new technique.</a> European Journal of Pharmacology. 67, 313-316 (1980).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+spinal+cord+transduction+by+intrathecal+injection+of+rAAV+delivers+efficacious+RNAi+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Widespread spinal cord transduction by intrathecal injection of rAAV delivers efficacious RNAi therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Human Molecular Genetics. 23 (3), 668-681 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((scAAV9-VEGF+prolongs+the+survival+of+transgenic+ALS+mice+by+promoting+activation+of+M2+microglia+and+PI3K%2FAkt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">scAAV9-VEGF prolongs the survival of transgenic ALS mice by promoting activation of M2 microglia and PI3K/Akt pathway.</a> Brain Research. 1648, Pt A 1-10 (2016).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Tecnicamente, há várias etapas críticas durante a injeção de IT em ratos acordados. Primeiro, bom gesto e firme controle dos ratos ao longo de toda a operação é um pré-requisito para o sucesso na entrega. Em segundo lugar, o ponto mais difícil é sentir o espaço intervertebral com a ponta da agulha, como é necessário para não inserir profundamente sem resistência ou inserir forçadamente sob forte resistência no caso de ferir os animais ou dobra a ponta da agulha. Em terceiro lugar, embora a paralisia transitória devido a ...

AAV pode mediar a expressão do gene a longo prazo e generalizada na transdução de CNS com poucos efeitos colaterais e, portanto, tornou-se um dos veículos mais promissoras para terapia gênica tratar doenças do CNS, incluindo esclerose lateral amiotrófica (ela), Huntington doença (HD), a doença de Alzheimer (AD), doenças de depósito lisossômico (LSD), doença de Gaucher (GD) e neuronal ceroid DoenÃ (NCL)1. Atualmente, mais de 100 sorotipos de vírus adeno-associados têm sido isolados de humanos e animais. Entre estes, pelo menos 12 foram usados em pré-clínicos e clínicos, incluindo o mais comumente usado vetores de gene como AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Doenças de CNS diferentes exigem diferentes estratégias de entrega AAV, devido a várias regiões afectadas do CNS e tipos de células. As regiões de CNS e célula tipos que AAV pode transduce varia dependendo do serótipo bem como método de entrega. Por exemplo, rAAVrh10 tem demonstrado transduce predominantemente astrócitos quando entregue por sistêmica injeção intravenosa (IV), Considerando que ele nao tanto neurônios e glia quando entregue por intratecal injeção4,7. Além disso, a injeção de parênquima resultou na transdução de local para as imediações do local da injeção, Considerando que a injeção no fluido cerebrospinal (CSF) através de intraventricular ou injeção intratecal resultou na transdução generalizada de CNS8 . Estudos também demonstraram potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração9,10,11. Em doenças que afetam grandes áreas do SNC tais como ALS, injeção intratecal para o CSF foi mostrada para cobrir a maior parte das áreas que são afectados pela doença com uma dose mais baixa, em comparação com um método de entrega sistêmica4,10. Estudos recentes têm mostrado também que a punção lombar pode ser usada para injetar o vírus adeno-associados em modelos do rato para ALS, que evita lesões potenciais associados com laminectomia e intratecal cateterismo4.
Experimental punção direta foi usada primeiramente para entregar agentes anestésicos, especialmente, para a medula espinhal para analgesia e anestesia em 188512,13. Neste relatório, podemos ilustrar a punção lombar método de injeção é em ratos adultos, com o auxílio de 1% de cloridrato de lidocaína, um anestésico local Amida derivada, na solução de injeção para avaliar e monitorar a qualidade de injeção. Injeções bem sucedidas foram marcadas por paralisia transitória induzida por lidocaína, Considerando que a falha de injeções não mostrou esse comportamento. Estamos classificados o nível de fraqueza transitória, como uma das cinco classes para ajudar a prever a eficiência de injeção. Finalmente, mostramos que o nível de transdução de rAAVrh10 pode ser previsto pelo grau de paralisia. Portanto, este método de entrega AAV intratecal pode ser usado para melhorar a AAV-mediada gene-entrega para terapia experimental das doenças do CNS.

<table><tbody><tr><td>Camundongos FVB/NJ</td><td>Charles River Laboratories China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de lidocaína monohidratado</td><td>HEOWNS</td><td>73-78-9</td><td></td></tr><tr><td>AAV</td><td>Núcleo de vetor viral do Centro de Terapia Gênica da Escola</td><td></td><td></td>de Medicina da Universidade de Massachusetts</tr><tr><td>25 &micro; L&nbsp; Seringa Hamilton / agulha 27-30 G</td><td>GASTIGHT</td><td>1702</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T compond</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>H 2 O 2</td><td>SHUI HUAN PAI</td><td></td><td></td></tr> 170401 <tr><td>Soro de cabra</td><td>Solarbio</td><td>S9070</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>LIFE SCIENCES</td><td>T8200</td><td></td></tr><tr><td>Coelho anti-GFP</td><td>Tecnologia da vida</td><td>G10362</td><td>Diluição 1:333</td></tr><tr><td>O segundo anticorpo (cabra-anti coelho)</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>111-005-144</td><td>Diluição 1:1.000</td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC REAGENTE</td><td>Vector Lab</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit</td><td>Vector Lab</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Meio de montagem para fluorescência com DAPI</td><td>Vectorshield</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; 2H2O</td><td>Yong Da Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 12H2O</td><td>Yong Da Paraformaldeído Químico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yong Da</td> Lâminas<td>de</td> Microscópio de Adesão <td>307699</td><td></td>Química</tr><tr><td></td><td>CITOGLAS</td><td>17083</td><td>25 mm x 75 mm</td></tr><tr><td>SUPER-SLIP MICRO-GLAS</td><td>Electro Microscopia Siences</td><td>72236-60</td><td>24 mm x 60 mm</td></tr><tr><td>15 mL Tubo de centrífuga</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>96 poço cluster de cultura de células</td><td>Coster</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>cluster de cultura de células de 24 poços</td><td>Coster</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>WEN ZHI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gauze</td><td>Wei AN</td><td>05171112</td><td>8 cm x 10 cm x 12 cm</td></tr><tr><td>seringa de 1 mL</td><td>Microtubos de Microtubos</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Plasmados</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipet&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peppet dicas</td><td>Rainin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centirifuge</td><td>eppendorf</td><td>5427R</td><td></td></tr><tr><td>Regenerador</td><td>Haier</td><td>BCD-539WT</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>MILLEX GP</td><td>R4PA42342</td><td></td></tr><tr><td>Bomba</td><td>LongerPump</td><td>BT-100-2J/YZ1515X</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo de congelamento</td><td>Leica</td><td>CM1520</td><td></td></tr></tbody></table>

injeção intratecal de vírus adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Direct Intrathecal Injection of Recombinant Adeno-associated Viruses in Adult Mice

Injeção intratecal (IT) do vírus adeno-associado (AAV) tem atraído considerável interesse na terapia de gene CNS em virtude de sua segurança, noninvasiveness e transdução excelente eficácia no SNC. Estudos anteriores têm demonstrado a potência terapêutica da terapia do gene AAV-entregue em doenças neurodegenerativas por esta administração. No entanto, altas taxas de falha imprevisível devido a limitação técnica de administração de ti em pequenos animais têm sido relatadas. Aqui, nós estabelecemos um sistema de Pontuação para indicar o grau de sucesso de punção lombar em pequenos animais pela adição de cloridrato de lidocaína a 1% para a solução de injeção. Vamos mostrar ainda mais que a extensão da fraqueza transitória após injeção pode prever a eficiência de transdução de AAV. Assim, este método de injeção de IT pode ser usado para otimizar os ensaios terapêuticos em modelos do rato de doenças CNS que afligem largas regiões do SNC.

Camundongos mostraram graus diferentes de fraqueza transitória logo após ele injeção da solução AAV no cloridrato de lidocaína 1% devido a vários qualidade de injeção intratecal. De acordo com o semigrau 5 sistema de pontuação que estabelecemos, nós testamos os padrões de transdução da AAV em camundongos com graus diferentes de fraqueza induzida por lidocaína membro (Pontuação 0, n = 2; escore 1, n = 1; marcar 4, n = 4; Pontuação 5, n = 3). EGFP imunocoloração de espinais mostrou nenhuma ...

Aqui apresentamos uma técnica de injeção intratecal direto usando cloridrato de lidocaína a 1% em uma solução viral para assegurar a entrega eficiente de vírus adeno-associado aos pequenos animais e estabelecer um sistema de Pontuação para prever a eficiência de transdução no central sistema nervoso de acordo com o grau de fraqueza transitória induzida pela lidocaína.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Intrathecal (IT) injection of adeno-associated virus (AAV) has drawn considerable interest in CNS gene therapy by virtue of its safety, noninvasiveness, ...

Este método facilita a eficiente entrega intratecal de transgênicos virais associados ao adeno em animais de pequeno porte acordados para o tratamento experimental de doenças do sistema nervoso central, como a ELA. A principal vantagem deste método é que a solução viral inclui cloridrato de 1%lidocaína que induz uma paralisia transitória após uma injeção bem sucedida. Embora este método forneça um indicador visual para julgar o sucesso da situação automatizada intratecal, a prática suficiente é essencial para melhorar a taxa de sucesso da entrega.Antes de iniciar o procedimento, conecte uma agulha de calibre 27 a uma seringa Hamilton de 25 microliter e alinhe a ponta chanfrada da agulha com a balança volumosa na seringa. Em seguida, carregue cuidadosamente 8 microliters de 4 x 10 para o décimo genoma cópias da solução do vírus na seringa, tomando cuidado para evitar bolhas. Em seguida, coloque um rato acordado de 30 a 70 dias de idade de 12 a 30 gramas em uma peça de cama na posição propensa em um capô biossegurança e cubra o corpo superior com gaze estéril para acalmar o rato e evitar ser mordido.Segure firmemente o mouse em sua cinta pélvica com o polegar de um lado e o dedo indicador e o dedo médio do outro lado mantendo a pele entre as cintas pélvicas bilaterais esticada com um polegar e dedo indicador. Em seguida, raspe a pele entre as cintas pélvicas bilaterais e esterilize a pele exposta com um esfoliante à base de iodo e 70% de etanol. Para a entrega intratecal direta da solução de vírus associada ao adeno, palpa o espaço intervertebral ao longo da linha média entre as cintas pélvicas bilaterais e use uma unha para deprimir uma recuo na pele para indicar o espaço intervertebral L5 a L6.Gire a base da cauda ligeiramente e suavemente para revelar a linha média da coluna vertebral e ajustar o bisel da agulha em direção à cabeça do animal. Com o mouse firmemente posicionado, alinhe a agulha ao longo da linha média da coluna vertebral e insira a agulha suave e verticalmente no centro do recuo mantendo a seringa em um plano sagital central. Quando a agulha entrar em contato com o osso, diminua lentamente o ângulo para aproximadamente 30 graus e deslize a agulha para o espaço intervertebral.Um súbito movimento de cauda é um sinal de uma entrada bem sucedida no espaço intradural. Quando a agulha entrar no espaço intervertebral, a ponta se sentirá firmemente presa. Injete a solução vetorial e mantenha a agulha dentro do espaço intradural por um minuto.Em seguida, retire lentamente a agulha com rotação para minimizar o vazamento. Escore imediatamente a fraqueza transitória dos membros do rato para avaliar a qualidade da injeção e devolver o mouse à sua gaiola para recuperação da paralisia. No ponto final experimental apropriado, fixar os membros e a cabeça do rato injetado na posição propensa em uma tampa de caixa de espuma e usar uma tesoura para tirar e remover a pele da cabeça para o sacro.Corte o crânio entre os olhos, corte ao longo da linha média do crânio e a linha horizontal acima do cerebelo e abra o crânio de cada lado. Use pinças para remover o osso occipital e use uma tesoura oftálmica para abrir bilateralmente o canal espinhal. Corte as costelas em ambos os lados e remova cuidadosamente a parte superior das vértebras.Use pinças curvas para levantar o cérebro e cortar os nervos da base do crânio. Em seguida, extrair cuidadosamente todo o cérebro e medula espinhal e fixar os tecidos em 4% de paraformaldeído por 24 horas. Ao final do período de fixação, crioprotege o cérebro e a medula espinhal cervical e lombar em solução de 30% de sacarose durante a noite a 4 graus Celsius seguido de incorporação no composto de temperatura de corte ideal antes de quebrar o congelamento em nitrogênio líquido.Em seguida, use um criostat para obter seções de 25 micrômetros de espessura de cada tecido, armazenando as seções congeladas em PBS molar de 0,01 a 4 graus Celsius à medida que são obtidas. Para análise imunohistoquímica dos tecidos, pré-trar as seções flutuantes livres com peróxido de hidrogênio de 1% por 10 minutos seguido de uma lavagem de 10 minutos em PBS. Em seguida, incubar as amostras em solução de bloqueio contendo 5% de soro e detergente não iônico de 0,3% na PBS por 1 hora, seguido pela rotulagem noturna a 4 graus Celsius com os anticorpos primários de interesse apropriados.No dia seguinte, lave as seções com lavagens de 3 10 minutos em PBS mais Tween e incuba os slides com os anticorpos secundários biotinilados correspondentes apropriados à temperatura ambiente por 1 hora após a última lavagem. Ao final da incubação, lave as seções 3 vezes em PBST fresco como apenas demonstrado e incuba as amostras com complexo de peroxidase de biotina infinita por 40 minutos seguido de coloração com um agente cromogênico apropriado. Monte as seções rotuladas em lâminas de microscópio de vidro e mergulhe os slides em etanol anidro por 5 minutos, uma vez que as seções montadas tenham secado completamente.Em seguida, mergulhe os slides em xileno por 10 minutos e sele-os com um meio de montagem apropriado. Em seguida, imagem os slides com um microscópio de luz equipado com um dispositivo acoplado a carga em 100, 200 e 400 vezes ampliações. A imunostaining eGFP de seções de tecido medular cervical e lombar revela pouca ou nenhuma transdução na medula espinhal lombar de camundongos com um escore de fraqueza de 0, transdução ligeiramente aumentada em camundongos com um escore de fraqueza de 1, e transduções fortes e generalizadas em camundongos com um escore de fraqueza de 4 ou 5.A quantificação da intensidade de coloração do GFP das seções de tecido medular de camundongos que apresentam vários graus de fraqueza transitória dos membros indica que a gravidade da fraqueza após a injeção da solução do vírus se correlaciona estreitamente com a extensão da transdução da medula espinhal. No cérebro, sinais robustos de eGFP são detectados na lâmpada olfativa, córtex pré-frontal dorsolateral, giro dentado e na zona CA3 do hipocampo, córtex cerebelar e áreas marginais do tronco cerebral, incluindo o núcleo facial, plexo choroide e as células epiteliais ependímicas. Os neurônios motores nos chifres anteriores também são fortemente transduzidos em diferentes níveis da medula espinhal.Além disso, no córtex, os neurônios positivos GFP, incluindo células piramiadas, são detectados, bem como vários tipos de células gliais, incluindo microglia, astrócitos e oligodenrócitos. Essa técnica permite que pesquisadores da área de neurologia explorem os efeitos terapêuticos do parto intratecal direto em pequenos animais acordados em doenças do sistema nervoso central.

direct-intrathecal-injection-recombinant-adeno-associated-viruses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Aqui apresentamos a injeção intracraniana de vetores de AAV para a rotulagem fluorescentes de neurônios e células gliais no córtex visual.

Injeção intracraniana da adeno-associado vetores virais

Fonte: Li, D., et al. Injeção intratecal direta de vírus adeno-associados recombinantes em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o procedimento para a injeção intratecal de vírus adeno-associados (AAV) no líquido cefalorraquidiano (LCR) de um camundongo acordado, abrangendo a preparação da seringa, o alinhamento da coluna vertebral e a inserção precisa da agulha. Este método valida a entrega de genes direcionados, apoiando seu potencial para terapias do SNC.

Entrega intratecal de vírus em um modelo de camundongo para tratamento de doenças do sistema nervoso central

Fonte:Pourshafie, N., et al. Entrega sistêmica de microRNA usando vírus adeno-associado recombinante sorotipo 9 para tratar doenças neuromusculares em roedores. J. Vis. Exp. (2018).Neste vídeo, uma atrofia muscular espinhal e bulbar ou camundongo afetado por SBMA é submetido à injeção na veia da cauda de vetores AAV (vetores adeno-associados) recombinantes que carregam um plasmídeo que codifica microRNA terapêutico. O vetor produz microRNA que se liga ao AR mutante (receptor de andrógeno)-mRNA...

Injetando vetores adeno-associados recombinantes em um modelo de camundongo com atrofia muscular espinhal e bulbar

Fonte: Grames, M. S., et al. Métodos e dicas para administração intravenosa de vírus adeno-associado a ratos e avaliação da transdução do sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2017)Este vídeo demonstra a injeção na veia da cauda do vírus adeno-associado recombinante (AAV) em ratos. Após a injeção na veia lateral da cauda, o vírus entra na corrente sanguínea, circula pelo coração e chega ao cérebro, onde entra nos neurônios e facilita a produção de proteínas-alvo para aplicações...

 Administração intravenosa de vetores virais adeno-associados recombinantes em modelo de rato 

Aqui demonstramos uma técnica para transdução neuronal generalizada por injeção intraventricular de vírus adeno-associado no cérebro de camundongo neonatal.  Este método fornece uma maneira rápida e fácil de obter a expressão vitalícia de transgenes entregues por vírus.

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

O objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar a potência e a segurança da entrega de genes mediada pelo vírus adeno-associado à coluna vertebral (AAV9) usando uma nova técnica de entrega de genes subpial em camundongos adultos.

Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

O presente protocolo descreve instruções passo a passo para a realização de injeções intratecais em camundongos neonatais para edição gênica e liberação de drogas.

Injeção Intratecal de Camundongos Recém-Nascidos para Edição do Genoma e Liberação de Fármacos

Um procedimento cirúrgico é descrito para realizar injeções na cisterna lombar do rato juvenil. Essa abordagem tem sido usada para a entrega intratecal de vetores de terapia gênica, mas prevê-se que essa abordagem possa ser usada para uma variedade de terapêuticas, incluindo células e medicamentos.

Entrega de vetor intratecal em ratos juvenis por injeção de cisterna lombar

Aqui, detalhamos um protocolo otimizado para injeção de veia da cauda lateral de camundongo para administrar sistemicamente o vírus adeno-associado (AAV) em camundongos adultos. Além disso, descrevemos protocolos de ensaios comumente usados para avaliar a transdução de AAV.

Entrega consistente de vírus adeno-associado por injeção lateral na veia da cauda em camundongos adultos

Uma injeção intratecal lombar representa uma via de administração translacionalmente relevante para administrar terapia gênica ao sistema nervoso central. Este protocolo padronizado abrangente para injeções intratecais lombares em camundongos e ratos neonatais, juvenis e adultos visa orientar os pesquisadores na adoção dessa técnica para estudos pré-clínicos de terapia gênica.

Injeção intratecal lombar de vetores de terapia gênica para direcionamento do sistema nervoso central em camundongos e ratos

Uma nova técnica para entrega generalizada de vírus adeno-associado que usa infusão de vírus subaracnóideo é descrita. Este método não apenas garante a transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos em camadas superficiais, mas também resulta na expressão seletiva do transgene em neurônios piramidais da camada cinco, mesmo quando se usa um promotor não seletivo.

Transdução generalizada de neurônios neocorticais de camundongos por injeção subaracnóidea de AAV2

Aprenda a técnica de injeção intratecal com lidocaína para entrega de vírus adeno-associados no sistema nervoso central de camundongos. Este método utiliza paralisia transitória como indicador visual para avaliar a eficácia da transdução em pesquisas de terapia gênica neurológica.

Injeção intratecal de vírus Adeno-associado recombinantes em ratos adultos

Explorar mais vídeos