Um novo método simples para a medição de Lipofilicidade (logP) usando ¹⁹espectroscopia RMN de F

Desenvolvemos um método simples para a medição da lipofphilicidade de compostos frenéticos usando RMR flúor que é árido o suficiente para reproduzir medimos pequenas diferenças na lipoffilia. Este método pode ser usado para estudar sistematicamente o impacto da formação de compostos orgânicos nas mudanças de lipofífilidade resolvidas, o que é de interesse na química medicinal geral. As vantagens deste método incluem que os compostos não têm que ser reativos, e eles não têm que ser completamente puros.

Não há necessidade de medir a massa exata ou os volumes, e não há necessidade de estabelecer curvas de calibração. Deve-se escolher um composto de referência adequado e evitar a contaminação cruzada da alíquota durante a fase de amostragem. Neste vídeo, demonstraremos habilidades práticas apropriadas para amostragem, vedação de tubos NMR e uso correto de software NMR para processamento de dados.

Adicione 6,0 miligramas de Composto X e 3,0 miligramas do Composto de Referência a um frasco em forma de pera de 10 mililitros. Dissolva os compostos em aproximadamente dois mililitros de n-Octanol de grau HPLC, e adicione dois mililitros de água de grau HPLC. Coloque os frascos dentro de um recipiente controlado pela temperatura acima de uma placa de mexida e conecte-se a um refrigerador recirculador.

Mexa a mistura bifásica a 25 graus Celsius por duas horas, com velocidade de agitação a 600 RPM. Equilibre a mistura a 25 graus Celsius durante a noite para permitir a separação completa da fase. Fixar o frasco em uma bancada de réplica com um grampo.

Pegue uma alíquota de aproximadamente 0,70 a 0,85 mililitros de ambas as camadas de água e n-Octanol usando uma seringa plástica descartável mililitro com agulhas longas. Para tomar a alíquota da água, desenhe aproximadamente 0,02 mililitros de ar na seringa antes de colocar a agulha na mistura. Ao mover a agulha através da camada n-Octanol superior para a camada de água, empurre suavemente o ar para evitar que a solução n-Octanol entre na agulha.

Retire a agulha longa da mistura. Descarte uma pequena quantidade de água, deixando aproximadamente 0,6 mililitros de amostra deixados na seringa. Limpe cuidadosamente a agulha com tecido seco e injete aproximadamente 0,5 mililitros da amostra de água em um tubo NMR limpo.

Feche rapidamente o tubo NMR com uma tampa. Para a amostra n-Octanol, remova a agulha longa da camada n-Octanol. Descarte uma pequena quantidade de amostra n-Octanol, deixando aproximadamente 0,6 mililitros de amostra deixadas na seringa.

Depois de limpar cuidadosamente a agulha com tecido seco, injete aproximadamente 0,5 mililitros da amostra n-Octanol em um tubo NMR limpo. Feche rapidamente o tubo NMR com uma tampa. Inspecione visualmente amostras de n-Octanol e água para obter qualquer contaminação da outra fase.

A cada tubo NMR, adicione 0,1 mililitros de um solvente NMR desuterado que é miscível tanto com n-Octanol quanto com água, para permitir o bloqueio de sinal durante a aquisição de NMR. Para compostos com baixos pontos de ebulição, sele os tubos NMR usando um maçarico e, após o resfriamento, inverta o tubo para verificar se há vazamentos. Inverta cuidadosamente os tubos NMR selados ou não selados 20 vezes para obter uma solução homogênea para experimentos de RMR F19.

Execute experimentos de RMR de flúor dissociados de prótons para identificar mudanças químicas do Composto X e do Composto de Referência em amostras de N-Octanol e NMR de água. Use as configurações padrão do parâmetro NMR conforme listado no protocolo de texto. Meça o tempo de relaxamento de rede de spin, ou T1, para núcleos de flúor diagnóstico usando uma sequência de recuperação de inversão.

Avalie o nível de tempo de atraso de pulso adequado dos valores T1 obtidos para uma integração quantitativa precisa de RMR. Execute um espectro F19 H1 rápido para configurar os parâmetros iniciais. Meça a largura de pulso de 90 graus e, em seguida, defina o parâmetro para o experimento de medição T1 e execute o experimento de medição T1 usando uma sequência de recuperação de inversão.

Execute experimentos de RMR de flúor dissociados novamente com configurações de parâmetros ajustados. Defina D1 e centralizar o ponto de deslocamento de frequência entre os dois sinais de flúor diagnóstico para que ambos os núcleos possam ser igualmente animados. Além disso, defina a largura espectral como 300 PPM, e defina o número de transitórios para 64.

Ajuste esses valores se for necessária uma maior relação sinal-ruído. Processe os dados obtidos usando o ACD NMR Processor Academic Edition ou outro software de processamento NMR personalizado. Abra o arquivo de dados NMR.

Em seguida, abra a pasta pdata, seguida pela pasta 1. Exclua o arquivo 1r. Retorne ao arquivo de dados NMR e arraste o arquivo FID para a janela do processador ACD NMR.

Clique no botão de função da janela, selecione exponencial, defina o valor de ampliação da linha como dois e clique no botão ok. Agora, clique no botão de preenchimento zero, aumente a contagem de pontos para quatro vezes da contagem de pontos original clicando em um pequeno botão ao lado do número e clique no botão ok. Selecione o botão de transformar fourier.

Em seguida, clique no botão de fase e clique no botão de eliminação do mouse. Clique e segure o botão esquerdo do mouse e prossiga para mover o mouse para frente ou para trás até que o pico principal do espectro seja devidamente gradual. Agora, clique e segure o botão direito do mouse e mova o mouse para frente ou para trás até que os outros picos do espectro sejam devidamente gradualmente.

Em seguida, desbocote o botão de esfinge do mouse e amplie na área espectral com os picos de flúor. Clique em ajuste fino, execute a correção de fase, se necessário, conforme descrito anteriormente e clique no botão tick. Clique no botão da linha de base e, em seguida, no botão opções.

Selecione a média de espectro para modelos automáticos, ajuste o número de pontos para meia largura da caixa, se necessário. Clique bem, auto e clique no botão tick. Em seguida, clique em integração, integre os picos de flúor diagnóstico e clique no botão tick.

Finalmente, obtenha as razões de integração das amostras N-Octanol e NMR de água e use-as na equação de cálculo logP para obter o valor logP do composto X.Usando 2, 2, 2-Trifluoroetanol como Composto de Referência, um valor logP de 0,75 foi obtido para dois fluoroetanol, e um valor logP de 1,20 positivo foi encontrado para 3, 3, 3, 2, 2-pentafluoropropanol. Posteriormente, a lipofilia de dois fluoroetanol foi determinada novamente, mas com 3, 3, 3, 2, 2-pentafluoropropanol como referência. O valor de logP medido foi de 0,76, que só teve diferença de 0,01 unidades logP quando comparado com o valor medido utilizando 2-2-2-trifluoroetanol como referência.

Da mesma forma, para cis-2, 3-difluro-1, 4-butano-diol, a diferença nos valores de logP medidos usando dois fluoroetanol e seu trans-isômero são muito pequenos. Isso demonstra boa reprodutibilidade, e que a seleção do Composto de Referência não tem impacto na medição do logP. Exemplos selecionados adicionais são mostrados aqui.

Todos esses compostos a fafáticos ativos não UV, desde carboidratos fluorados, até fluorohidrinas, podem ser facilmente medidos com este método. Outros métodos baseados em NMR podem ser usados se o composto não contiver flúor, e se o composto contiver Cromofor UV, então a medição do logP pode ser realizada usando quantificação UV. A lipoficidade de uma ampla gama de fluorohidrinas ativas não UV e carboidratos desoxifluoados foi medida.

A biblioteca de dados obtida foi utilizada para estabelecer tendências e regras para o impacto da fluoretação alifática na lipofoficidade. Octanol e água representam riscos mínimos de segurança. É claro que os perigos que são medidos e o Composto de Referência devem ser sempre levados em consideração.