Name: Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a determinar a estrutura cristalina do domínio N-terminal do receptor de ryanodina de Plutella xylostella usando cristalografia de raios X. Este método fornece modelos para o desenvolvimento de inseticidas específicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiamento para esta pesquisa foi fornecida por: nacional chave de pesquisa e desenvolvimento programa de China (2017YFD0201400, 2017YFD0201403), nacional natureza Science Foundation da China (31320103922, 31230061) e projeto de pesquisa básica nacional (973) programa de China (2015CB856500, 2015CB856504). Somos gratos ao pessoal sobre a trajetória de BL17U1 em instalações de radiação síncrotron de Shanghai (SSRF).

1. Gene clonagem e expressão de proteínas purificação
<ol><li>PCR amplificar DNA correspondente à proteína de interesse (resíduos 1-205 de DBM RyR, Genbank ACC. n. AFW97408) e clone em vetor de animal de estimação-28a-HMT por clonagem independente de ligadura (LIC)25. Este vetor contém uma marca de histidina, tag MBP e um local de clivagem de protease TEV no N-terminal15.
	<ol>
<li>Projeto LIC primers para amplificação do gene alvo com extensões 5' LIC-compatível com: Encaminhar a cartilha LIC: 5' TACTTCCAATCCAATGCAATGGCGGAAGCGGAAGGGG 3' Cartilha LIC inversa: 5' TTATCCACTTCCAATGTTATTATATGCCGGTCCCGTACGGC 3'</li>
		<li>Combinar os componentes da reação (50 μL): 1 μL de modelos de DNA (100 ng/μL), 1 μL de primer para a frente (10 μM), 1 μL de primer reverso (10 μM), 0,5 μL de DNA polimerase (NEB), 5 μL de reação 10x buffer, 1 μL de dNTP (25 mM) , 40.5 μL de RNase free ddH2O.<ol>
<li>Coloque a mistura de reação em uma máquina PCR e executar o programa a seguir.</li>
			<li>Incubar a 95 ° C por 3 min, e em seguida, executar 30 ciclos de (95 ° C por 30 s, 58 ° C, por 15 s, 72 ° C por 1 min). Incubar a 72 ° C por 5 min e em seguida, mantenha a 4 ° C.</li>
			<li>Executar a mistura de reação inteira (50 μL) em um gel de agarose 2% e extrair com um Kit de extração do Gel. Siga o protocolo do fabricante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Independente de ligadura da clonagem (LIC)<ol>
<li>Realizar a digestão SspI (60 μL): 20 μL de DNA de vetor (50 ng/μL), 6 μL de 10 x 30 μL de DDQ2O. Incubar a 37 ° C por 3 h. executar a reação inteira, 4 μL de SspI e amortecedor da reação misturar em gel de agarose 1% e extrair com um Kit de extração do Gel. Siga o protocolo do fabricante.</li>
			<li>Realizar o tratamento T4 DNA Polymerase do vetor e inserir DNA. Combinar o seguinte: 5 μL de DNA vetor ou insert (50 ng/μL), 2 μL de tampão, DNA polimerase 10 x T4, 1 μL de dGTP (25 mM) para vector ou 1 μL do dCTP (25 mM) para inserir DNA, 1 μL de TDT (100 mM), 0,4 μL de T4 DNA Polymerase (LIC-qualificado) e 9.6 μL de DDQ2O. Incubar as reacções à temperatura ambiente por 40 min. calor-inativar enzimas a 75 ° C por 20 min. Nota: O vetor LIC e inserir DNA devem ser tratadas em reações distintas.</li>
			<li>Execute o recozimento reação LIC. Combinar o seguinte: 2 μL de T4-tratados inserir DNA, 2 μL de T4-tratados LIC vector DNA. Incube a reação à temperatura ambiente por 10 min.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transformar BL21 (DE3) Escherichia coli células com este plasmídeo recombinante.<ol>
<li>Descongele as células competentes (50 μL em microtubo) no gelo.</li>
		<li>Adicionar aproximadamente 1 μL (50 ng) do plasmídeo no tubo. Misture as células e DNA por sacudir suavemente o tubo 2 – 3 vezes. Coloca o tubo no gelo por 20 min.</li>
		<li>Calor choque a 42 ° C por 40 s. lugar do tubo no gelo novamente por 2 min. adicionar 1 mL de temperatura LB mídia ao tubo.</li>
		<li>Lugar do tubo de mistura no shaker 250 rpm a 37 ° C por 45 min. espalhar a 150-200 µ l da mistura nas chapas de seleção. Inverter a placa e incubar durante uma noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Escolha uma única colônia e cultura de células em 100 mL de meio de 2YT contendo 50 canamicina µ g/mL a 37 ° C durante a noite. Na manhã seguinte, inocular meio 2YT de 1L contendo 50 canamicina µ g/mL com 10ml de cultura durante a noite e incubar em incubadora de abanador de 37 ° C a 250 rpm, até que o OD600 atinge ~ 0.6. Posteriormente, induzir a cultura com IPTG para uma concentração final de 0,4 mM e crescer para outro h 5 a 30 ° C.</li>
	<li>Recolher as células por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C, recolher as células e ressuspender todas as células de 10g em 40 mL de tampão de lise (10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl, 10mm β-Mercaptoetanol, 25 lisozima μg/mL, 25 μg/mL DNase 1 mM PMSF).<ol>
<li>Interrompê-lo por sonication em amplitude de 65% para 8 min com 1 s s no e 1 fora. Remova os restos de células por centrifugação a 40.000 x g durante 30 min a 4 ° C. Filtrar o sobrenadante, passando através de filtro de 0,22 μm e carregá-lo para o loop de amostra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificar a proteína de fusão, cleave a tag e re-purificar a proteína do alvo.<ol>
<li>Purificar a proteína de fusão usando coluna Ni-NTA (tampão de ligação: 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl; tampão de eluição: pH HEPES 10mm 7.4, 250 mM KCl, imidazol 500mm) e purificar através de um sistema de purificação, com um gradiente linear de imidazol 20 – 250 mM.</li>
		<li>Cleave a proteína alvo eluted com protease do PEV (01:50 ratio) durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Purificar a mistura de reação de clivagem, usando a coluna de resina de amilose (tampão de ligação: 10 mM HEPES pH 7,4, 250 mM KCl; tampão de eluição: pH HEPES 10mm 7.4, 250 mM KCl, maltose 10 mM) e Ni-NTA coluna para remover a tag e protease TEV. A proteína do alvo será na fração de escoamento dessas duas colunas.</li>
		<li>Dialize a amostra contra tampão de diálise (10 mM Tris-HCl pH 8.8, 50 mM KCl, 10mm β-Mercaptoetanol para reduzir a concentração de sal. Purificar a amostra em uma coluna de troca de ânion (tampão de ligação: 10 mM Tris-HCl pH 8.8, 10 mM β-Mercaptoetanol; tampão de eluição: pH 10 mM Tris-HCl 8.8, 1 M de KCl, 10mm β-Mercaptoetanol) por um gradiente linear de 20 – 500 mM KCl no buffer de eluição.</li>
		<li>Como um passo final no processo de purificação, concentrar a proteína usando o concentrador centrífugo (10 kDa MWCO) e injetar em uma coluna de gel filtração Superdex 200 26/600 para verificar a homogeneidade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Examine a pureza da proteína, executando-o em um SDS 15% página. Nota: Todas as colunas estão executando em um sistema de purificação de proteínas com uma taxa de fluxo de ligação de 2 mL/min e uma taxa de fluxo de eluição de 4 mL/min, exceto gel-filtração em 1 mL/min.</li>
</ol>2. cristalização e preparação de proteína
<ol><li>Concentrar a amostra de proteína purificada para 10 mg/mL, utilizando centrífuga concentrador (10 kDa MWCO) e troca de buffer de buffer de cristalização antes de armazenar a-80 ° C.</li>
	<li>Realizar triagem de cristalização (proporção de 1:1, 200 nL de proteína e 200 nL de tampão do reservatório) por sessão soltar método de difusão de vapor a 295 K com vários kits de cristalização usando um líquido automatizado sistema robótico em um formato de 96 poços de manipulação. Nota: Nós usamos kits da investigação Molecular de dimensões e Hampton e o Gryphon automatizado sistema de manipulação de líquidos.</li>
	<li>A placa de 96 poços cristalização para evitar a evaporação e habilitar o equilibrio da gota da proteína com o tampão do reservatório do selo. Em seguida, manter as placas na incubadora de cristal a 18 ° C.</li>
	<li>Verifique as placas de 96 poços, periodicamente, usando um microscópio de luz para monitorar o crescimento e a formação de cristais.</li>
	<li>Para diferenciar os cristais de proteínas de cristais de sal, use uma tintura de proteína. Adicione 1 µ l de corante para soltar o alvo. Esperar cerca de 1h e observar sob microscópio. Os cristais de proteína ficará azuis.</li>
	<li>Usar as condições de cristalização positivo (sulfato de amônio de 1,5 M, 0,1 M Tris pH 8.0) para otimizar ainda mais os cristais usando suspensão cair método de difusão de vapor em placas de 24 poços.<ol>
<li>Otimize o pH de 7,0 a 8,5 com intervalo de unidade de pH 0,5 cada passo. Otimize a concentração de sulfato de amónio de 1,2 M de 1,7 M, com intervalo de 0,1 M cada passo. (No nosso caso a melhor condição de produzir grandes cristais em forma de placa foi 0,1 M HEPES pH 7.0 e 1.6 M sulfato de amônio)</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cristal montagem, raio-x coleta de dados e determinação da estrutura
<ol><li>Monte os cristais em um cryoloop e flash-cool em nitrogênio líquido usando reservatório solução contendo 20% de glicerol como crio-protetor. Coloque os cristais em unipuck para armazenamento e transporte.</li>
	<li>Pre-tela usando um difratômetro in-house diffractor de raio-x de cristais de proteína. Escolha os melhores com as resoluções mais altos para coleta de dados nas instalações do síncrotron (o nosso dataset foi colhido em BL17U1 nas instalações de radiação síncrotron de Shanghai).<ol>
<li>Use o software de controle de trajetória BluIce26 para montar e centralizar os cristais da função centragem automática ou manual. Realize exposições de teste para determinar a estratégia de coleta de dados, incluindo o início, ângulo, tempo de exposição, distância do detector, largura da moldura e números.</li>
		<li>Recolher o dataset em conformidade (recolhemos 180 frames com 1 s tempo de exposição, largura da moldura de 1° e a distância de detector de 350mm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Índice, integrar e dimensionar o dataset usando o HKL2000 suíte27. Primeiro, realizar a função de busca de pico para encontrar os pontos de difração e então os pontos de índice e selecione o grupo de certo espaço. Após a integração de pico, dimensionar o conjunto de dados com o modelo de erro apropriado e salvar o arquivo de saída .sca.</li>
	<li>Resolva o problema da fase por substituição molecular usando Phaser28 em PHENIX29.<ol>
<li>Calcule o número de cópia possível de moléculas de proteína na unidade assimétrica por Xtriage30.</li>
		<li>Olhe para os modelos de estrutura apropriada com alta identidade e estrutural similaridades como a proteína do alvo usando estruturas conhecidas da literatura ou os modelos gerados pelo servidor de predição de estrutura como Phyre231 (usamos coelho RyR1 NTD como um modelo de pesquisa, PDB ID 2XOA).</li>
		<li>Execute Phaser usando o arquivo de dados de difração, o arquivo de modelo de estrutura e o arquivo de sequência de proteínas para encontrar a solução.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Execute AutoBuild32 no PHENIX29 para gerar o modelo inicial usando o arquivo de saída de Phaser e o arquivo de sequência da proteína alvo.</li>
	<li>Construir a estrutura para a densidade de elétron experimental modificados usando Coot33 e refinar usando phenix.refine34 em ciclos iterativos manualmente.</li>
	<li>Valide o modelo final usando as ferramentas de validação no PHENIX18.</li>
</ol>

<ol><li>Giannini, G., Sorrentino, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+and+tissue+distribution+of+ryanodine+receptors+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Medicinal+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular structure and tissue distribution of ryanodine receptors calcium channels.</a> Medicinal Research Reviews. 15 (4), 313-323 (1995).</li>
<li>Takeshima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+gene+for+a+ryanodine+receptor%2Fcalcium+release+channel+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a gene for a ryanodine receptor/calcium release channel in Drosophila melanogaster.</a> FEBS Letters. 337 (1), 81-87 (1994).</li>
<li>Sattelle, D. B., Cordova, D., Cheek, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+ryanodine+receptors%3A+molecular+targets+for+novel+pest+control+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Insect ryanodine receptors: molecular targets for novel pest control chemicals.</a> Invertebrate Neuroscience. 8 (3), 107-119 (2008).</li>
<li>Steinbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geographic+spread%2C+genetics+and+functional+characteristics+of+ryanodine+receptor+based+target-site+resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Geographic spread, genetics and functional characteristics of ryanodine receptor based target-site resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 63, 14-22 (2015).</li>
<li>Wang, X., Khakame, S. K., Ye, C., Yang, Y., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+field-evolved+resistance+to+chlorantraniliprole+in+the+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella%2C+from+China%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Characterisation of field-evolved resistance to chlorantraniliprole in the diamondback moth, Plutella xylostella, from China.</a> Pest Management Science. 69 (5), 661-665 (2013).</li>
<li>Liu, X., Wang, H. Y., Ning, Y. B., Qiao, K., Wang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+Selection+and+Characterization+of+Chlorantraniliprole+Resistance+in+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Resistance Selection and Characterization of Chlorantraniliprole Resistance in Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Journal of Economic Entomology. 108 (4), 1978-1985 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+a+point+mutation+in+the+ryanodine+receptor+of+Plutella+xylostella+%28L.%29+associated+with+resistance+to+chlorantraniliprole%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of a point mutation in the ryanodine receptor of Plutella xylostella (L.) associated with resistance to chlorantraniliprole.</a> Pest Management Science. 70 (7), 1083-1089 (2014).</li>
<li>Troczka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+diamide+insecticides+in+diamondback+moth%2C+Plutella+xylostella+%28Lepidoptera%3A+Plutellidae%29+is+associated+with+a+mutation+in+the+membrane-spanning+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Resistance to diamide insecticides in diamondback moth, Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae) is associated with a mutation in the membrane-spanning domain of the ryanodine receptor.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (11), 873-880 (2012).</li>
<li>Roditakis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor+point+mutations+confer+diamide+insecticide+resistance+in+tomato+leafminer%2C+Tuta+absoluta+%28Lepidoptera%3A+Gelechiidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor point mutations confer diamide insecticide resistance in tomato leafminer, Tuta absoluta (Lepidoptera: Gelechiidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 80, 11-20 (2017).</li>
<li>Borko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+human+RyR2+N-terminal+region+involved+in+cardiac+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the human RyR2 N-terminal region involved in cardiac arrhythmias.</a> Acta Crystallographica Section D. 70 (Pt 11), 2897-2912 (2014).</li>
<li>Sharma, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+the+phosphorylation+domain+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural determination of the phosphorylation domain of the ryanodine receptor.</a> FEBS Journal. 279 (20), 3952-3964 (2012).</li>
<li>Kimlicka, L., Lau, K., Tung, C. C., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+mutations+in+the+ryanodine+receptor+N-terminal+region+couple+to+a+mobile+intersubunit+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disease mutations in the ryanodine receptor N-terminal region couple to a mobile intersubunit interface.</a> Nature Communications. 4, 1506(2013).</li>
<li>Lau, K., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+wild+type+and+disease+mutant+forms+of+the+ryanodine+receptor+SPRY2+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of wild type and disease mutant forms of the ryanodine receptor SPRY2 domain.</a> Nature Communications. 5, 5397(2014).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+the+N-terminal+domains+of+cardiac+and+skeletal+muscle+ryanodine+receptors%3A+insights+into+disease+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of the N-terminal domains of cardiac and skeletal muscle ryanodine receptors: insights into disease mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>des Georges, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Basis+for+Gating+and+Activation+of+RyR1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural Basis for Gating and Activation of RyR1.</a> Cell. 167 (1), 145-157 (2016).</li>
<li>Efremov, R. G., Leitner, A., Aebersold, R., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+conformational+switch+mechanism+of+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture and conformational switch mechanism of the ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 39-43 (2015).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+gating+mechanism+of+the+type+2+ryanodine+receptor+RyR2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor RyR2.</a> Science. 354 (6310), (2016).</li>
<li>Wei, R. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/cr201699">Structural insights into Ca2+-activated long-range allosteric channel gating of RyR1.</a> Cell Research. 26 (9), 977-994 (2016).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+rabbit+ryanodine+receptor+RyR1+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the rabbit ryanodine receptor RyR1 at near-atomic resolution.</a> Nature. 517 (7532), 50-55 (2015).</li>
<li>Zalk, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mammalian+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a mammalian ryanodine receptor.</a> Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).</li>
<li>Furlong, M. J., Wright, D. J., Dosdall, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diamondback+moth+ecology+and+management%3A+problems%2C+progress%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Diamondback moth ecology and management: problems, progress, and prospects.</a> Annual Review of Entomology. 58, 517-541 (2013).</li>
<li>Amador, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+type+I+ryanodine+receptor+amino-terminal+beta-trefoil+domain+reveals+a+disease-associated+mutation+%26%2334%3Bhot+spot%26%2334%3B+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of type I ryanodine receptor amino-terminal beta-trefoil domain reveals a disease-associated mutation &#34;hot spot&#34; loop.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (27), 11040-11044 (2009).</li>
<li>Lobo, P. A., Van Petegem, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+the+N-Terminal+Domains+of+Cardiac+and+Skeletal+Muscle+Ryanodine+Receptors%3A+Insights+into+Disease+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of the N-Terminal Domains of Cardiac and Skeletal Muscle Ryanodine Receptors: Insights into Disease Mutations.</a> Structure. 17 (11), 1505-1514 (2009).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li>
<li>Stepanov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JBluIce-EPICS+control+system+for+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">JBluIce-EPICS control system for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 67 (3), 176-188 (2011).</li>
<li>Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HKL-3000%3A+the+integration+of+data+reduction+and+structure+solution--from+diffraction+images+to+an+initial+model+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).</li>
<li>McCoy, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaser+crystallographic+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Phaser crystallographic software.</a> Journal of Applied Crystallography. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).</li>
<li>Zwart, P. H., Gross-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. <a target="_blank" href="http://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.378.2281&rep=rep1&type=pdf">Xtriage and Fest: Automatic assessment of X-ray data and substructure structure factor estimation.</a> CCP4 Newsletter. (43), 27-35 (2005).</li>
<li>Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Phyre2+web+portal+for+protein+modeling%2C+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis.</a> Nature Protocols. 10 (6), 845-858 (2015).</li>
<li>Terwilliger, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+model+building%2C+structure+refinement+and+density+modification+with+the+PHENIX+AutoBuild+wizard%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard.</a> Acta Crystallographica Section D. 64 (Pt 1), 61-69 (2008).</li>
<li>Emsley, P., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coot%3A+model-building+tools+for+molecular+graphics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Coot: model-building tools for molecular graphics.</a> Acta Crystallographica Section D. 60, 2126-2132 (2004).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).</li>
<li>Lin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+ryanodine+receptor+N-terminal+domain+from+Plutella+xylostella+reveals+two+potential+species-specific+insecticide-targeting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of ryanodine receptor N-terminal domain from Plutella xylostella reveals two potential species-specific insecticide-targeting sites.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 73-83 (2018).</li>
<li>Qi, S., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+differences+in+chlorantraniliprole+and+flubendiamide+insecticide+binding+sites+in+the+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Species differences in chlorantraniliprole and flubendiamide insecticide binding sites in the ryanodine receptor.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 321-326 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste artigo, descrevemos o procedimento para expressar recombinantes, purificar, cristalizar e determinar a estrutura de DBM RyR NTD. Para cristalização, um requisito crucial é a obtenção de proteínas com homogeneidade, pureza e alta solubilidade. Em nosso protocolo, escolhemos usar pET-28a-HMT vetor que contém uma marca de hexahistidine e MBP, ambos os quais poderiam ser utilizados para a purificação obter uma maior pureza de dobra. Além disso, as aids marca MBP na solubilidade da proteína alvo. Nós purificado da prote...

Ryanodine receptors (RyRs) são canais de íon específico, que mediam a permeação dos íons de Ca2 + através das membranas do retículo sarcoplasmático (RS) em células musculares. Portanto, eles jogam um papel importante na processo de acoplamento excitação contração. Na sua forma funcional, RyR monta como um homo-tetrâmero com uma massa molecular de > 2 MDa, com cada subunidade composto por resíduos de aminoácidos ~ 5000. Em mamíferos, existem três isoformas: RyR1 - tipo de músculo esquelético, RyR2 - tipo de músculo cardíaco e RyR3-ubiquitously expressa em tecidos diferentes1.
Em insetos, há apenas um tipo de RyR, que é expresso no tecido muscular e nervoso2. Inseto RyR é mais semelhante a mamíferos RyR2 com uma identidade de sequência de cerca de 47%3. Inseticidas de diamido segmentação RyR de Lepidoptera e Coleoptera foram desenvolvidas e comercializadas por grandes empresas como Bayer (flubendiamida), DuPont (chlorantraniliprole) e Syngenta (cyantraniliprole). Desde o seu lançamento relativamente recente, diamido inseticidas tornaram-se uma das classe mais rápido crescimento de inseticidas. Atualmente, as vendas destes três inseticidas anualmente cruzaram 2 bilhões dólares americanos com uma taxa de crescimento de mais de 50% desde 2009 (Agranova).
Estudos recentes têm relatado o desenvolvimento de resistência em insetos, depois de algumas gerações de uso destes inseticidas4,5,6,7,8. As resistência mutações no domínio transmembrana de RyRs do diamondback moth (DBM), Plutella plutella (G4946E, I4790M) e as posições correspondentes em Minador do tomate, Tuta absoluta (G4903E, I4746M) mostram que a região pode ser envolvido na ligação de inseticida de diamido como esta região é conhecida por ser crítico para retenção do canal4,8,9. Apesar de inúmeras pesquisas nesta área, os mecanismos moleculares exatos de diamido inseticidas permanecem indescritíveis. Além disso, não está claro se as mutações de resistência afetam as interações com diamides diretamente ou qual alostericamente.
Estudos anteriores relataram a estrutura de vários domínios RyR de espécies de mamíferos e a estrutura de completos mamíferos RyR1 e RyR2 por cristalografia de raios x e microscopia cryo-elétron, respectivamente10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Mas até agora, nenhuma estrutura de insecto RyR foi relatada, que nos proíbe de compreender os meandros moleculares da função do receptor, bem como os mecanismos moleculares de ação inseticida e desenvolvimento de resistência de inseticida.
Este manuscrito, apresentamos um protocolo de generalizadas para caracterização estrutural de domínio de β-trevo N-terminal do receptor de ryanodine do diamondback moth, uma praga destrutivo infectando crucíferos culturas no mundo22. A construção foi projetada de acordo com o coelho publicado RyR1 NTD cristal estruturas23,24e o cryo-EM modelos estruturais16,17,18,19, 20 , 21. esta é a primeira estrutura de alta resolução, relatada por inseto RyR, que revela o mecanismo de retenção de canal e fornece um modelo importante para o desenvolvimento de inseticidas espécie-específicos usando drogas baseada em estrutura de design. Para a elucidação da estrutura, utilizamos a cristalografia de raios x, que é considerada como o "padrão ouro" para a determinação da estrutura da proteína em perto de resolução atômica. Embora o processo de cristalização é imprevisível e trabalho intensivo, este protocolo passo a passo ajudará pesquisadores a express, purificar e caracterizar outros domínios de inseto RyR ou qualquer outras proteínas em geral.

<table><tbody><tr>Vetor <td></td><td></td><td>pET-28a-HMT</td><td>Este vetor pET modificado contém uma marca de hexa-histidina, uma proteína de fusão MBP e um local de clivagem da protease TEV no terminal N (Lobo e Van Petegem, 2009)</td></tr> <tr><td>E. coli cepa BL21 (DE3) Novagen</td><td></td><td>69450-3CN</td><td></td></tr><tr><td>Coluna HisTrapHP (5 mL)</td> <td>GE Healthcare</td><td>45-000-325</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de resina de amilose</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Q Sepharose coluna de alto desempenho&nbsp;</td><td>Concentradores Amicon GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>(10 kDa MWCO)</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 26/600 coluna de filtração em gel&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-36</td><td></td></tr><tr><td>Sistema robótico automatizado de manuseio de líquidos&nbsp;</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>Gryphon</td><td></td></tr><tr><td>96 Well CrystalQuick</td><td>Greiner bio-one</td><td>82050-494</td><td></td></tr><tr><td>Uni-Puck</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-601</td><td></td></tr><tr><td>Montado CryoLoop - 20 mícrons</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-955</td><td></td></tr><tr><td>CryoWand</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD7-411</td><td></td></tr><tr><td>Puck ferramenta de carregamento dewar</td><td>Molecular Dimensões</td><td>MD7-607</td><td></td></tr><tr><td>Nano drop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cristal</td><td>Dimensões moleculares</td><td>MD5-605</td><td></td></tr><tr><td>Difrator de raios-X</td><td>Rigaku</td><td>FRX</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de PCR</td><td>Eppendorf</td><td>Nexus GX2</td><td></td></tr><tr><td>Kit de mini-preparação de plasmídeo</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Extração de gel kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>SspI endonuclease de restrição</td><td>NEB</td><td>R0132S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polimerase</td><td>Novagen</td><td>2868713</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Scientific Chemical</td><td>25389940</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Genview</td><td>367931</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Genview</td><td>7365459</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Genview</td><td>60242</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>Sorvall LYNX 6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sonnicator</td><td>Scientz</td><td>II-D</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de purificação de proteínas</td><td>GE Healthcare</td><td>Akta Microscópio de luz pura</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>Corante de cristal IzIt</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-710</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de eletroforese</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>Shaker Incubadora</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2401</td><td></td></tr><tr><td>Tela de cristal de índice</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Tela de cristal de estrutura</td><td>Dimensões moleculares</td><td>MD1-01</td><td></td></tr><tr><td>Tela de cristal ProPlex</td><td>Dimensões moleculares</td><td>MD1-38</td><td></td></tr><tr><td>PACT tela de cristal premier</td><td>Dimensões moleculares</td><td>MD1-29</td><td></td></tr><tr><td>Tela de cristal JCSG-plus</td><td>Molecular Dimensões</td><td>MD1-37</td><td></td></tr></tbody></table>

estrutura cristalina do domínio n-terminal do ryanodine receptor de plutella plutella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Desenvolvimento de inseticidas potentes e eficientes como alvo receptores ryanodine inseto (RyRs) tem sido de grande interesse na área de controle de pragas agrícolas. Até à data, vários insecticidas de diamido visando pragas que ryrs ter sido comercializados, que geram receita anual de 2 bilhões de dólares. Mas a compreensão do modo de ação de inseticidas RyR-direcionamento é limitada pela falta de informações estruturais sobre inseto RyR. Isto por sua vez restringe a compreensão do desenvolvimento da resistência de inseticida em pragas. O diamondback moth (DBM) é uma praga devastadora destruindo crucíferas culturas em todo o mundo, que também tem sido relatada para mostrar resistência aos inseticidas de diamido. Portanto, é de grande importância prática para desenvolver novas inseticidas visando o RyR DBM, especialmente visando uma região diferente do local de ligação do diamido tradicional. Aqui, apresentamos um protocolo para caracterizar estruturalmente o domínio N-terminal do RyR da DBM. A estrutura de cristal de raio-x foi resolvida por substituição molecular em uma resolução de 2.84 Å, que mostra um motivo de dobramento de beta-trevo e uma acompanhamento alfa-hélice. Este protocolo pode ser adaptado para a expressão, purificação e caracterização estrutural de proteínas ou outros domínios em geral.

Purificação
O domínio N-terminal da DBM RyR foi expressa como uma proteína de fusão com uma marca de hexahistidine, uma marca MBP e um local de clivagem de protease TEV. Nós seguimos uma estratégia de purificação de cinco etapas para obter uma proteína altamente pura, adequada para efeito de cristalização. Em primeiro lugar, a proteína de fusão foi purificada da fracção solúvel de lisado celular por coluna Ni-NTA (HisTrap HP). Em s...

Neste artigo, descrevemos os protocolos de determinação de estrutura, purificação, cristalização e expressão da proteína do domínio N-terminal do receptor de ryanodine do diamondback moth (Plutella plutella).

Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Resolver a estrutura do domínio do receptor de ryanodo pode ajudar com a compreensão do mecanismo molecular da função proteica, ação de inseticidas e desenvolvimento de resistência a inseticidas. Esta medida implica o uso de cristalografia de raios-X para ilustração da estrutura, que é considerada um padrão-ouro para determinação da estrutura proteica em resolução quase atômica. Esta estrutura de alta resolução do domínio do receptor de ryanodo de insetos revela o mecanismo de gating de canal e fornece um modelo importante para o desenvolvimento de inseticidas específicos de espécies usando abordagens de design de drogas baseadas em estrutura.Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão, porque os cristalógrafos de proteínas em potencial devem ser proficientes em bioquímica, biofísica, ciência da computação e matemática. Comece amplificando o DNA correspondente à proteína de interesse pela reação em cadeia de polimerase. No final da reação, execute todos os 50 microliters de mistura de reação em um gel de 2% de agarose, e extraia o DNA com um kit de extração de gel de acordo com os protocolos padrão.Em seguida, linearize o DNA vetorial LIC misturando 20 microliters do DNA vetorial com 6 microliters de tampão de reação 10X e 4 microliters de enzima de restrição de SiI em 30 microliters de água dupla destilada. Incubar esta mistura de reação por três horas a 37 graus Celsius. No final da incubação, execute toda a mistura de reação em um gel de 1% de agarose, seguido pela extração do DNA vetorial linearizado com um kit de extração de gel de acordo com as instruções do fabricante.Em seguida, realize tratamentos separados de polimerase de DNA T4 em 5 microliters do DNA vetorial linearizado e o DNA de inserção amplificada do PCR, de acordo com os protocolos padrão. Incubar por 40 minutos em temperatura ambiente, seguido de 20 minutos de inativação de calor enzimante a 75 graus Celsius. Realize a reação de ressarcação de clonagem independente da ligadura combinando 2 microlitadores do DNA de inserção t4 tratado com 2 microliters do DNA vetorial LIC tratado T4 para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente.Para transformar as células BL21(DE3)E. Coli com o plasmídeo recombinante, descongelar 50 microliters de células competentes no gelo, e adicionar aproximadamente 1 microliter do plasmídeo realado ao tubo. Gire suavemente o tubo duas a três vezes para misturar as células e o DNA, e coloque o tubo de volta no gelo por 20 minutos.No final da incubação, o calor choca as células a 42 graus Celsius por 40 segundos, seguido de dois minutos de volta ao gelo. Em seguida, adicione um mililitro de temperatura ambiente lb médio ao tubo, e coloque as células em um agitador de 250 RPM por 45 minutos a 37 graus Celsius. No final da incubação de agitação, placa de 150 a 200 microliters desta mistura em placas de seleção, e inverta as placas durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, a cultura uma única colônia em 100 mililitros de meio 2-YT, suplementada com kanamicina, em uma incubadora shaker a 37 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, inocular um litro de meio 2-YT, suplementado com kanamicina, com 10 mililitros de cultura durante a noite, e incubar a 37 graus Celsius com agitação até que a leitura de OD600 atinja aproximadamente 0,6. Em seguida, induzir a cultura com IPTG a uma concentração final de 0,4 milimililar, e cultivar as células por cinco horas a 30 graus Celsius.Ao final da incubação, colde as células por centrifugação e suspenda a pelota para 10 gramas de bactérias por 40 mililitros de concentração tampão de lise. Interrompa as paredes celulares por sônica em uma amplitude de 65%, e um segundo em um segundo de folga, por oito minutos. Remova os detritos celulares por centrifugação.Em seguida, filtre o supernatante através de um filtro de 22 micrômetros e carregue a solução em um loop de amostra. Para purificar a proteína de fusão, injete o supernanato filtrado do laço amostral em uma coluna de níquel-nitrolotriactic de cinco mililitros em um sistema de purificação com um gradiente linear de 20 a 250 milimidazol. Corte a proteína alvo elucida com protease do vírus da etch do tabaco, em uma proporção de 1 a 50, durante a noite a 4 graus Celsius, e purifique a mistura de reação de decote em uma coluna de resina amilose, e uma coluna de níquel-nitrolotriacético, para remover a etiqueta e o vírus da etch do tabaco protease.Diálise do fluxo da coluna níquel-nitrolotriactica contra o tampão de diálise para reduzir a concentração de sal e purifique a amostra em uma coluna de troca de ânion por um gradiente linear de 20 a 500 mililitros de potássio no tampão de eluição. Então, concentre a proteína em um concentrador centrífuga. Injete a proteína concentrada em uma coluna de filtragem de gel Superdex 200 26/600 para verificar a homogeneidade e avaliar a pureza da proteína em 15% de SDS-PAGE.Para preparar a proteína para cristalização, concentre a amostra de proteína purificada em 10 miligramas por mililitro no concentrador centrífugo e troque o tampão para o tampão de cristalização antes do armazenamento de 80 graus Celsius. Para realizar a triagem de cristalização, use o método de difusão de vapor de gota sentado em 295 Kelvin, com vários kits de cristalização, e um sistema automatizado de manuseio líquido em um formato de 96 poços. No final do ajuste de queda, sele a placa de cristalização de 96 poços para evitar a evaporação, e para permitir o equilíbrio da gota de proteína dentro do tampão do reservatório.Coloque as placas em uma incubadora de cristal a 18 graus Celsius. Verifique periodicamente as placas sob um microscópio leve para monitorar a formação e o crescimento do cristal. Para diferenciar os cristais proteicos dos cristais de sal, adicione um microliter de corante de cristal proteico à gota alvo, e observe os cristais sob o microscópio após uma hora.Os cristais de proteína parecerão azuis. Para otimizar ainda mais os cristais, use as condições positivas de cristalização e o método de difusão de vapor de gota suspensa em placas de 24 poços, seguido de incubação na incubadora de cristais a 18 graus Celsius. Para determinar a estrutura proteica, monte os cristais em um crioloop sob um microscópio leve para resfriamento de flash em nitrogênio líquido, e coloque os cristais em um unbuck para armazenamento e transporte.Pré-tela os cristais em um difrator de raios-X interno, usando a função de centralização manual para montar e centralizar os cristais. Em seguida, use o software de difração de raios-X para coletar os dados. Para indexar, integrar e dimensionar o conjunto de dados, usando o conjunto de dados HKL-2000, primeiro, selecione o detector e carregue o conjunto de dados.Em seguida, realize a função de busca de pico para encontrar os pontos de difração. Indexe as manchas, selecione o grupo espacial certo e realize a integração máxima. Em seguida, dimensione o conjunto de dados.Ajuste o modelo de erro e dimensione novamente. Salve o arquivo de sca de saída. Para determinar a estrutura usando o pacote de software Phenix, crie um novo projeto.Primeiro, execute Extriage com o arquivo de sca para calcular o possível número de cópia de moléculas de proteína na unidade assimétrica. Em seguida, para resolver o problema de fase por substituição molecular, execute Phaser, usando o arquivo de dados de difração, o arquivo de estrutura de modelo com identidade de alta sequência e similaridade estrutural como a proteína alvo, e o arquivo de sequência de proteínas, para encontrar a solução. Execute a construção automática em Phenix para gerar o modelo inicial, usando o arquivo de saída do Phaser e o arquivo de sequência da proteína alvo.Construa manualmente a estrutura na densidade experimental modificada de elétrons usando COOT, e refine usando refinar Phenix em ciclos iterativos. Validar o modelo final utilizando as ferramentas de validação em Phenix. Neste experimento representativo, a purificação do domínio terminal final da proteína receptor de mariposa diamondback, como demonstrado, rendeu uma única banda a cerca de 21 kilodaltons pela análise STS-PAGE.O volume de elução da coluna de filtragem de gel confirmou que o domínio do receptor de ryanodo purificado para ser um monômero. Para a cristalização, as condições mais ideais sob as quais cristais em forma de placa de alta qualidade foram formados foi na presença de 1 HEPES molar de um pH de 7, e 1,6 sulfato de amônio molar. Determinação da estrutura proteica a partir do conjunto de dados de difração utilizando softwares como demonstrado revelou o domínio final do receptor de mariposa diamondback ryanodine cobrindo resíduos de 1 a 205.Proteínas com grande desordem, regiões flexíveis ou com afinidades fracas são desafiadoras para cristalizar. Nesses cenários, estratégias de engenharia de proteínas, como redução da entropia superficial, truncação de loop e ligação cruzada, podem aumentar a probabilidade de obter melhores cristais proteicos. Além de revelar estruturas proteicas de alta resolução, a cristalografia de raios-X também pode ser usada para estudar interações proteína-pesticidas, o que poderia ajudar no projeto de pesticidas baseados em estrutura.

crystal-structure-n-terminal-domain-ryanodine-receptor-from-plutella

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este artigo descreve a metodologia de microscopia crioeletrônica, que é usada para obter imagens microscópicas de alta qualidade de macromoléculas em seu estado quase nativo. O método produz imagens adequadas para processamento computadorizado adicional usando a abordagem de partícula única, concebida para gerar a reconstrução 3D de uma macromolécula.

Fazer e não fazer de Microscopia Cryo-elétron: uma cartilha sobre Preparação de Amostras e coleta de dados de alta qualidade para a Reconstrução Macromolecular 3D

β proteínas da membrana externa (OMPs) servem a muitas funções dentro das membranas externas de bactérias Gram-negativas, mitocôndrias e cloroplastos. Aqui, esperamos aliviar um gargalo conhecido em estudos estruturais, apresentando protocolos para a produção de OMPs de β barril em quantidades suficientes para determinação de estrutura por cristalografia de raios-X ou espectroscopia de RMN.

A partir de construções de Cristais - Rumo a determinação da estrutura de β-barril exterior Proteínas de Membrana

Aqui, descrevemos um método para expressar e purificar norovirus alta qualidade salientes domínios (P) em E. coli para uso em estudos de cristalografia de raios-X. Este método pode ser aplicado a outros domínios calicivírus P, bem como proteínas não estruturais, isto é., A proteína virai ligada ao genoma (VPg), protease, e polimerase de ARN dependente de ARN (RdRp).

Produção de Domínios salientes Norovirus Humanos em<em&gt; E. coli</em&gt; Para raios-X Cristalografia

A oligomerização do receptor de rianodina, um canal iônico homotetramérico que medeia a liberação de Ca2+ dos estoques intracelulares, é crítica para a contração do músculo esquelético e cardíaco. Aqui, apresentamos métodos complementares in vivo e in vitro para detectar a autoassociação de proteínas e determinar a estequiometria de homo-oligômero.

Abordagens genéticas e bioquímicas para<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; Avaliação de oligomerização da proteína: A Case Study rianodina Receptor

A prolina-prolina endopeptidase-1 (PPEP-1) é uma metaloprotease secretada e um alvo promissor do patógeno humano Clostridium difficile. Aqui descrevemos todos os métodos necessários para a produção e determinação da estrutura desta proteína.

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Descrevemos protocolos para a determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO por cristalografia de raios-X. Os métodos incluem expressão de proteína, purificação e caracterização, bem como estratégias para otimização de cristal bem-sucedida e determinação da estrutura da proteína em sua forma desvinculada.

Produção, cristalização e determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO

Este protocolo foi desenvolvido para estudar a transição dimer-dodecamer de TmPep1050, uma aminopeptidase M42, no nível estrutural. É um pipeline simples desde a purificação de proteínas até o processamento de dados de raios-X. A cristalogênese, a indexação do conjunto de dados e a substituição molecular foram enfatizadas através de um caso de estudo, a variante TmPep1050H60A H307A.

Cristalografia de Raios-X para Estudar a Transição do Estado Oligomérico da Termotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

Aqui são descritos métodos usados para estudar o efeito funcional das mutações RYR1 expressas endógenamente no Vírus Epstein Barr, linfócitos B humanos e células de satélite derivadas da biópsia muscular diferenciadas em miótubos.

Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas

Este protocolo apresenta as ferramentas disponíveis para modelar ligantes de moléculas pequenas em mapas crioEM de macromoléculas.

Modelagem de ligantes em mapas derivados da criomicroscopia eletrônica

Aprenda a determinar a estrutura cristalina do domínio N-terminal do receptor de ryanodina de Plutella xylostella usando cristalografia de raios X. Este método fornece modelos para o desenvolvimento de inseticidas específicos.

Estrutura cristalina do domínio N-terminal do Ryanodine Receptor de Plutella plutella

Explorar mais vídeos