Name: In Vitro Ensaio para estudar a agregação da proteína Tau e rastreio de drogas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Aprenda um ensaio robusto de agregação da proteína Tau para estudar doenças de Alzheimer e outras tauopatias. Este método in vitro utiliza tau recombinante altamente puro para rastreamento de drogas com alta reprodutibilidade.

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Os autores gostaria de agradecer Quirante Hector para a expressão e purificação de huTau441, Hanna Inganäs e Margot van Winsen excelente apoio técnico e Martin Koldijk para análise de dados.

1. preparação do reagente
<ol><li>
Amortecedor da reação
	<ol>
<li>Preparar o amortecedor da reação: 0.5 mM TCEP em PBS, pH 6,7, dissolvendo o pó seco TCEP (MW = 286.65 g/mol) em solução PBSstock, pH 7,4. Nota: A presença do TCEP é devido a estudos de agregação usando proteína tau de tipo selvagem que contém cisteínas-ponte. O protocolo atual, TCEP só é usado para ajustar o pH da PBS de 7,4 para 6,7 e não desempenha qualquer papel na regulação de reacções redox.</li>
		<li>Homogeneizar e filtrar a solução através de um filtro de membrana PES de tamanho dos poros estéril 0,22 μm.</li>
		<li>Alíquota e loja-80 ˚ c.</li>
		<li>Descongelar no banco e estabilizar no RT antes do uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
huTau441
	<ol>
<li>Remover huTau441 (para Apetri et al , consulte de expressão e purificação da proteína 24) do congelador de-80 ˚ c.</li>
		<li>Descongelar no banco e equilibrar a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Gire o tubo com estoque de proteínas por 5 min a 12.000 x g em 20-25 ˚ c para eliminar as bolhas de ar.</li>
		<li>Medir a concentração de absorção de huTau441by em 280 nm, utilizando um coeficiente de extinção de mL 0,31 mg-1cm-1
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Thioflavin T
	<ol>
<li>Preparar 500 μM thioflavin T (ThT) solução dissolvendo-se 10 mg de pó seco ThT (MW = 318.86 g/mol) em 35 mL de tampão de reação.</li>
		<li>Misture bem, vórtex por 20 segundos na velocidade máxima por 3 vezes e filtrar a solução através de um estéril 0,22 μm PES membrana filtrante porosidade.</li>
		<li>Determinar a concentração por medidas de absorção em 411 nm, utilizando um coeficiente de extinção de 22.000 M-1 cm-1 e ajuste ThT concentração de 500 μM. Guarde este medicamento em RT, protegido da luz. Prepare-se fresco a cada 2 meses.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Heparina
	<ol>
<li>Preparar a solução de heparina fresca 55 μM dissolvendo-se 1 mg de pó seco de HMW heparina (MW = 17-19 kDa) em 1 mL de tampão de reação no RT</li>
		<li>Agitar vigorosamente e vórtice 2 vezes durante 5 segundos.</li>
		<li>Filtrar a solução através de um estéril 0,20 μm PES membrana filtrante porosidade (seringa).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. contínuo modo ThT ensaio de agregação em um leitor de microplacas multi-modo
Nota: ThT corante é adicionado para a reação para monitorar huTau441 cinética de agregação de um modo contínuo (medições automáticas). Embora a reação pode ser seguida por um regular dados utilizando uma cubeta do convencional, a natureza manual da operação limita a frequência das medições e compromete a precisão das curvas cinéticas gravadas. Por esta razão, é utilizado um leitor de microplacas de multi-modo automático.
<ol><li>
Instrumento criado
	<ol>
<li>Ligue o computador e o leitor de microplacas multi-modo. Deixe o equipamento estabilizar por 10 minutos.</li>
		<li>Inicie o software e preparar um protocolo.<ol>
<li>Selecione o tipo de protocolo: protocolo padrão (redução de dados é executada independentemente por cada placa).</li>
			<li>Regule a temperatura em 37 ˚ c e selecione a preheatment antes de continuar o protocolo.</li>
			<li>Definir o cinético executar: 50 h de tempo de execução / intervalo de medição: 15 min.</li>
			<li>Conjunto orbital tremendo em 425 cpm (3 mm) no modo contínuo.</li>
			<li>Selecione o método de leitura: fluorescência intensidade ponto de extremidade/cinética - Monochromators comprimentos de onda: excitação 440 nm (largura de banda 20 nm) / emissão 485 nm (20 nm de largura de banda) - óptica posição: topo - Normal ler velocidade - Leia altura: 4,50 mm</li>
			<li>Comece a executar usando o protocolo criado. Nome do experimento, selecione o destino do arquivo recém-criado e permitir que o instrumento pre-equilibrar a temperatura desejada.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Conversão de huTau441 espontânea
	<ol>
<li>Prepare a amostra de reação em um tubo de 1,5 mL. Uso 200 μL de mistura por reação e pelo menos 4 repetições (volume de reação de 4 repetições = 800 μL).</li>
		<li>Prepare-se 800 μL reação amostra (no caso de 4 repetições) contendo 15 μM huTau441, de 8 μM de heparina e de 50 μM ThT. iniciar pela mistura da proteína com o amortecedor da reação, acrescentar heparina e ThT e misture bem por pipetagem e descer 5 vezes. Respeite a ordem indicada para a adição do reagente.</li>
		<li>Gire as amostras a 12.000 x g e 25 ˚ c por 5 min eliminar as bolhas de ar.</li>
		<li>Dispense a 200 µ l de amostra de reação por bem em microplacas de 96 poços (microplaca sólida preta de 96 poços, volume bem 360 μL, fundo plano). Evite a formação de bolhas de ar.</li>
		<li>Vedação de microplacas para evitar a evaporação.</li>
		<li>Coloque microplate em leitor de microplacas multi-modo e começar as medições.</li>
		<li>Após a conclusão do experimento, remover a placa do equipamento e exportar dados para um software de processamento de dados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verificação de qualidade de conversão, armazenamento e coleta de sementes.
	<ol>
<li>Remover o aferidor da placa e piscina as diferentes repetições em tubos de 1,5 mL. Misture bem a amostra de agregados em poços pipetando acima e para baixo 2 vezes antes de coletar a ele. Agregados tendem a depositar no fundo do poço.</li>
		<li>Completamente em Mix a 1,5 mL tubo pipetando subindo e descendo 5 vezes e dispensar 10-20 μL sobre uma superfície de mica para analisar os agregados por AFM (para mais detalhes ver Apetri et al . 24).</li>
		<li>Os agregados da colheita girando o tubo de 1,5 mL de 20.000 x g e 4 ˚ c durante 1 hora. Agregados formam um pellet.</li>
		<li>Separar e analisar o sobrenadante por S-MALS para confirmar a ausência de tau monomérico na amostra indica uma conversão bem-sucedida em agregados (para mais detalhes, ver Apetri et al 24).</li>
		<li>Rotule o tubo de 1,5 mL contendo os restantes agregados (pellet) indica a concentração de proteína huTau441 inicial e o volume de amostra. Snap congelar os agregados e armazenar no-80 ˚ c.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reação semeada
	<ol>
<li>Remova huTau441 agregados do congelador de-80 ˚ c. Adicione o volume de tampão de reação indicada no rótulo (volume de amostra inicial) e deixe o tubo estabilizar a RT. Ressuspender os agregados pipetando acima e abaixo de 5 a 8 vezes.</li>
		<li>Proceda à sonicação a amostra de agregados. Para uma amostra de 200 μL (huTau441 de 15 μM), proceda à sonicação no gelo usando um microtip 1/8"(de 100 μL de 10 mL) por um período total de 15 s usando pulsos de 1 s e pausas de 2 s em 30% amplitude (sonicador 250 Watts). Re-equilibrar a amostra para RT Nota: As condições de trabalhadores assalariados sonication originar uma população homogênea de fibrilas tau com comprimentos de 20 a 50 nm24.</li>
		<li>Prepare a amostra de reação nos tubos de 1,5 mL. Uso 200 μL de mistura por reação e pelo menos 4 repetições (volume de reação de 4 repetições = 800 μL).</li>
		<li>Preparar a amostra de reação 800 μL contendo 15 μM huTau441, de 8 μM de heparina e de 50 μM ThT. iniciar pela mistura da proteína com o amortecedor da reação, acrescentar heparina e ThT e misture bem por pipetagem e descer 5 vezes. Respeite a ordem indicada para a adição do reagente.</li>
		<li>Gire as amostras a 12.000 x g e 25 ˚ c por 5 min eliminar as bolhas de ar.</li>
		<li>Dispense a 200 µ l de amostra de reação por bem em 96 poços (microplaca sólida preta de 96 poços, volume bem 360 μL, fundo plano). Evite a formação de bolhas de ar.</li>
		<li>Homogeneizar cuidadosamente a amostra de fibrila pré-formadas por repetitiva acima e para baixo de pipetagem (5 vezes) e adicione a cada poço o valor correspondente a porcentagem desejada de sementes. Para um volume de bem total 200 μL, 2 μL de adição de semente pré-formada é um 1% (v/v). Mix pipetando para cima e para baixo 3 vezes quando adicionando ao poço e evitar a formação de bolhas de ar.</li>
		<li>Vedação de microplacas para evitar a evaporação.</li>
		<li>Coloque microplate em leitor de microplacas multi-modo e começar as medições.</li>
		<li>Remover a placa do equipamento e exportar dados para uma planilha.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease.</a> The New England Journal of Medicine. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative tauopathies.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 1121-1159 (2001).</li>
<li>Goedert, M., Wischik, C. M., Crowther, R. A., Walker, J. E., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+sequencing+of+the+cDNA+encoding+a+core+protein+of+the+paired+helical+filament+of+Alzheimer+disease%3A+identification+as+the+microtubule-associated+protein+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cloning and sequencing of the cDNA encoding a core protein of the paired helical filament of Alzheimer disease: identification as the microtubule-associated protein tau.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (11), 4051-4055 (1988).</li>
<li>Himmler, A., Drechsel, D., Kirschner, M. W., Martin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+consists+of+a+set+of+proteins+with+repeated+C-terminal+microtubule-binding+domains+and+variable+N-terminal+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tau consists of a set of proteins with repeated C-terminal microtubule-binding domains and variable N-terminal domains.</a> Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1381-1388 (1989).</li>
<li>Mandelkow, E., von Bergen, M., Biernat, J., Mandelkow, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+principles+of+tau+and+the+paired+helical+filaments+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Structural principles of tau and the paired helical filaments of Alzheimer's disease.</a> Brain Pathology. 17 (1), 83-90 (2007).</li>
<li>Lee, V. M., Balin, B. J., Otvos, L., Trojanowski, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A68%3A+a+major+subunit+of+paired+helical+filaments+and+derivatized+forms+of+normal+Tau%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal Tau.</a> Science. 251 (4994), 675-678 (1991).</li>
<li>Wischik, C. M., Harrington, C. R., Storey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau-aggregation+inhibitor+therapy+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Tau-aggregation inhibitor therapy for Alzheimer's disease.</a> Biochemical Pharmacology. 88 (4), 529-539 (2014).</li>
<li>Pickhardt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Small+Molecule+Inhibitors+of+Tau+Aggregation+by+Targeting+Monomeric+Tau+As+a+Potential+Therapeutic+Approach+for+Tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of Small Molecule Inhibitors of Tau Aggregation by Targeting Monomeric Tau As a Potential Therapeutic Approach for Tauopathies.</a> Current Alzheimer Research. 12 (9), 814-828 (2015).</li>
<li>Paranjape, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azaphilones+inhibit+tau+aggregation+and+dissolve+tau+aggregates+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Azaphilones inhibit tau aggregation and dissolve tau aggregates in vitro.</a> ACS Chemical Neuroscience. 6 (5), 751-760 (2015).</li>
<li>Seidler, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+inhibitors+of+tau+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-based inhibitors of tau aggregation.</a> Nature Chemistry. 10 (2), 170-176 (2018).</li>
<li>Apetri, A. C., Vanik, D. L., Surewicz, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphism+at+residue+129+modulates+the+conformational+conversion+of+the+D178N+variant+of+human+prion+protein+90-231%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polymorphism at residue 129 modulates the conformational conversion of the D178N variant of human prion protein 90-231.</a> Biochemistry. 44 (48), 15880-15888 (2005).</li>
<li>Crespo, R., Rocha, F. A., Damas, A. M., Martins, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+crystallization-like+model+that+describes+the+kinetics+of+amyloid+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A generic crystallization-like model that describes the kinetics of amyloid fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (36), 30585-30594 (2012).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (41), USA. E4376-E4385 (2014).</li>
<li>Surewicz, W. K., Jones, E. M., Apetri, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+principles+of+mammalian+prion+propagation+and+transmissibility+barriers%3A+Insight+from+studies+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">The emerging principles of mammalian prion propagation and transmissibility barriers: Insight from studies in vitro.</a> Accounts of Chemical Research. 39 (9), 654-662 (2006).</li>
<li>Jeganathan, S., von Bergen, M., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natively+unfolded+character+of+tau+and+its+aggregation+to+Alzheimer-like+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The natively unfolded character of tau and its aggregation to Alzheimer-like paired helical filaments.</a> Biochemistry. 47 (40), 10526-10539 (2008).</li>
<li>Goedert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+filaments+induced+by+sulphated+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans.</a> Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).</li>
<li>Kampers, T., Friedhoff, P., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+stimulates+aggregation+of+microtubule-associated+protein+tau+into+Alzheimer-like+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA stimulates aggregation of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like paired helical filaments.</a> FEBS Letters. 399 (3), 344-349 (1996).</li>
<li>Wilson, D. M., Binder, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+fatty+acids+stimulate+the+polymerization+of+tau+and+amyloid+beta+peptides.+In+vitro+evidence+for+a+common+effector+of+pathogenesis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer's disease.</a> American Journal of Pathology. 150 (6), 2181-2195 (1997).</li>
<li>Barghorn, S., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+unified+scheme+for+the+aggregation+of+tau+into+Alzheimer+paired+helical+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toward a unified scheme for the aggregation of tau into Alzheimer paired helical filaments.</a> Biochemistry. 41 (50), 14885-14896 (2002).</li>
<li>Friedhoff, P., Schneider, A., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+Alzheimer-like+paired+helical+filaments+from+microtubule-associated+protein+tau+monitored+by+fluorescence+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of Alzheimer-like paired helical filaments from microtubule-associated protein tau monitored by fluorescence in solution.</a> Biochemistry. 37 (28), 10223-10230 (1998).</li>
<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+features+of+tau+fibrils+from+Alzheimer%27s+disease+brain+are+faithfully+propagated+by+unmodified+recombinant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational features of tau fibrils from Alzheimer's disease brain are faithfully propagated by unmodified recombinant protein.</a> Biochemistry. 52 (40), 6960-6967 (2013).</li>
<li>Ramachandran, G., Udgaonkar, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+studies+unravel+the+complexity+inherent+in+tau+aggregation+leading+to+Alzheimer%27s+disease+and+the+tauopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic studies unravel the complexity inherent in tau aggregation leading to Alzheimer's disease and the tauopathies.</a> Biochemistry. 52 (24), 4107-4126 (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e51537(2015).</li>
<li>Apetri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+antigenic+motif+recognized+by+naturally+occurring+human+VH5-51%2FVL4-1+anti-tau+antibodies+with+distinct+functionalities%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">A common antigenic motif recognized by naturally occurring human VH5-51/VL4-1 anti-tau antibodies with distinct functionalities.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 43(2018).</li>
<li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).</li>
<li>Zhu, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+heparin+binding+to+Tau+protein%3A+implication+for+inducer-mediated+Tau+filament+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of heparin binding to Tau protein: implication for inducer-mediated Tau filament formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (6), 3592-3599 (2010).</li>
<li>Buee, L., Delacourte, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+biochemistry+of+tau+in+progressive+supranuclear+palsy%2C+corticobasal+degeneration%2C+FTDP-17+and+Pick%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathology%22%5BJournal%5D)">Comparative biochemistry of tau in progressive supranuclear palsy, corticobasal degeneration, FTDP-17 and Pick's disease.</a> Brain Pathology. 9 (4), 681-693 (1999).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apesar de inúmeros esforços, a cinética de agregação de tau relatados na literatura a falta de data do nível desejado de reprodutibilidade e/ou algumas das características de uma nucleação polimerização dependentes19,20,21 , 22 , 23 , 25. isto muitas vezes é enfatizado pela falta de uma fase de retardo, semeando ineficiente e não-fibrillar natureza dos agregados de tau. A razão para estas deficiências pode variar e inclui a qualidade de proteína tau sub-ótimo (fragmentação, presença de agregados, baixa pureza, etc.), escolha de proteína e induzindo os reagentes e/ou condições experimentais. Outro fator complicador são os dois resíduos de cisteína localizados em torno da interface de agregação de tau que podem formar intra ou inter - molecular dissulfeto pontes dependendo do ambiente de redox e afetam a eficiência da agregação do tau. Na maioria das abordagens reduzindo os reagentes como TDT ou TCEP têm sido utilizados para manter os resíduos de cisteína nas formas reduzidas e, assim, aumentar os níveis de reprodutibilidade25. Além disso, o coeficiente de extinção da tau é muito baixa o que leva a dificuldades em medições precisas da concentração da proteína.
Focamos especialmente em alguns parâmetros e atributos de qualidade que consideramos cruciais para um perfil de agregação robusto, reprodutível e representativas para proteína tau: eliminando a possibilidade de intra e interformação dissulfeto molecular, gerando um monômero de tau altamente puro e melhorar a precisão da determinação da concentração. Todos estes reagentes relacionados perguntas são potenciais pontos de atenção que consideramos fundamentais para o desenvolvimento ideal do ensaio. Para solucionar esses problemas, huTau441 comprimento total foi expressa com duas mutações, C291A e C322A e com tags N - e C-terminal. Mutação dos resíduos cisteína tem impacto mínimo na proteína tau, eliminando a outra forma muito difícil controlar pontes dissulfeto. Expressando a proteína com tags relativamente curto N - e C-terminal permitiu-na prosseguir um protocolo de purificação de afinidade de duas etapas que conduziram à altíssima pureza, integridade e conteúdo de monômero. Além disso, introduzimos uma mutação F8W que aumentou o coeficiente de extinção da proteína e permitiu muito mais precisos de medições de concentração24.
Além de utilizar reagentes de proteína de alta qualidade, outros parâmetros de ensaio também foram otimizados. O tau ideal: relação de heparina foi identificada para ser em torno de 0.5 (M/M), que está de acordo com estudos publicados anteriormente26. Além disso, mecânicas e óticas instrumentais configurações são cruciais para garantir a reprodutibilidade e os parâmetros ideais podem diferir em certa medida, dependendo do fabricante.
A agregação de tau descrito neste ensaio mostra características que estão associados com a patogênese tau em AD e relacionados Tauopatias. O processo começa com uma fase de retardo inicial correspondente à formação de núcleos de alta energia e é seguido por uma fase de rápido crescimento que corresponde ao crescimento de fibrila. O tempo de retardo é suficientemente longo para abrir uma janela ampla para estudar em detalhe o processo de preparação, cobrindo uma ampla gama de concentrações de sementes (Figura 5) enquanto ainda não demore muito para a degradação das proteínas e/ou agregação específico é evitada (Figura 2). esses eventos secundários podem acontecer especialmente quando uma proteína intrinsecamente desordenada como huTau441 é exposta por longos períodos de tempo às condições fisiológicas. A exibição de agregados obtidos tau a morfologia de resfrie isolada do cérebro dos pacientes e são muito eficientes em recrutamento tau monomérico e convertendo-a de novo gerado agregados, um processo conhecido como semeadura. O ensaio é altamente reprodutível, as curvas de cinéticas sendo virtualmente indistinguível entre poços, corridas experimentais e lotes de proteína. Embora o ensaio atual enfoca apenas o isoform tau mais longa, huTau441, o aplicativo pode ser adaptado para estudar a conversão de outras formas de tau (Ameijde et al, Acta Neuropathologica Communications, no prelo) Além disso, ele permite que estudos mecanicistas focada sobre a interacção das isoformas de tau e possivelmente lançar luz sobre as diferenças entre a patogênese tau no anúncio onde ambos 3R e 4R isoformas estão presentes em resfrie e PICK doença ou demência Frontotemporal onde patologia tau contém principalmente Isoformas de tau 3R e 4R, respectivamente,27.
A altíssima reprodutibilidade do ensaio deve permitir que os leitores para implementá-lo com relativa facilidade em suas configurações de laboratório específico. O ensaio imita o que é acreditado para ser no vivo enrolamento e agregação de tau, permitindo estudos mecanicistas que irão lançar luz sobre a patogênese da tau e constitui uma ferramenta valiosa para a seleção de candidatos a fármacos e avaliar sua interferência com as diferentes etapas do processo de patogênese.

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa devastadora histopatologicamente definido pelo acúmulo de placas senis extracelulares de agregados Amyloid beta1 e neurofibrilares intracelulares contendo agregados hyperphosphorylated tau proteína2. Tau fisiológica é monomérica e apresentou como seis isoformas exclusivas contendo 0-2 N terminais inserções e vinculação de microtubule 3 ou 4 domínios3,4 decorrentes de splicing alternativo e uma média de 2-3 phosphorylations. Acredita-se que hyperphosphorylation, enrolamento e auto-agregação em estruturas fibrilar constituem elementos-chave na patogênese da tau, como patologicamente avaliados em indivíduos dementes5,6.
Os emaranhados de tau tangles agregados são uma marca registrada não só para AD, mas também para outras Tauopatias, incluindo degeneração lobar frontotemporal (FTLD), doença de Pick, paralisia supranuclear progressiva (PSP), demência fronto-temporal (FTD) e primário relacionadas com a idade de Taupatia (parte)2. Do ponto de vista bioquímico, compreender o mecanismo de enrolamento de tau e agregação poderia lançar luz sobre os processos patológicos associados com AD e outras Tauopatias. Além do aspecto científico, robusto em vitro ensaios de agregação são ferramentas valiosas para despistagem de droga candidatos7,8,9,10. Acredita-se que a agregação de tau segue uma nucleação polimerização dependente processo (NDP)11,12,13,14. A cinética do NDP é sigmoidal e começa com um passo de nucleação energeticamente desfavoráveis, seguido de um processo de agregação rápido energeticamente em declive.
Ao contrário de outras proteínas amiloidogénicos, incluindo a proteína príon, beta amyloid e α-synuclein, tau não agregado espontaneamente sob condições fisiológicas e pHs mesmo extrema ou altas temperaturas são não-propício para agregação15. Isto é provavelmente devido as interações de hydrophylic presentes na interface de agregação de tau. No entanto, tau agrega eficientemente em concentrações fisiológicas quando indutores como heparina16 ou de17,outros polianiões18 estão sendo usados.
Esforços anteriores para configurar em vitro tau agregação ensaios têm lançar alguma luz sobre os detalhes do tau enrolamento e agregação, mas eles vieram curtos de imitar o que é acreditado para ser a cinética de agregação de tau na vivo . Na maioria dos casos, a cinética de agregação de tau estava faltando a fase de retardo inicial associada a nucleação de tau. Isso pode ter sido a consequência com as concentrações de proteína tau muito alta, presença de agregados dos preparativos de proteína tau inicial e/ou uso de fragmentos de tau com muito maior propensão de agregação que o tau mais fisiológico de comprimento total proteína19,20,21,22,23. Além disso, estudos anteriores não tratou a reprodutibilidade e o aspecto de robustez da cinética de agregação de tau.
Aqui, descrevemos um robusto em vitro tau agregação do ensaio que imita as características principais de uma polimerização dependente de nucleação com uma fase de retardo inicial correspondente a nucleação de tau, seguida por uma fase de crescimento exponencial. Além disso, os agregados de tau recombinante gerado são fibrillar na natureza e tem uma potência extremamente alta de semeadura. O ensaio é altamente reprodutível também entre lotes de tau e representa uma ferramenta valiosa para a tela para inibidores de agregação.

<table><tbody><tr><td>Tioflavina T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516-5G</td><td>pó seco (Mw = 318,86 g/mol)</td></tr><tr><td>Heparina&nbsp;</td><td>Pó seco Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>(Mw = 17-19 kDa)</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75259-1G</td><td>pó seco (MW= 286,65 g/mol)</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco-Life Technologies</td><td>10010-015</td><td>Estéril, pH 7,4 (1X)</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro estéril</td><td>Corning</td><td>431160</td><td>Membrana PES&nbsp;</td></tr><tr><td>0,20 &mu; m filtro de seringa estéril</td><td>Corning</td><td>431229</td><td>membrana PES&nbsp;</td></tr><tr><td>Microplacas de 96 poços</td><td>Thermo Scientific</td><td>9502867</td><td>Selantes de microplacas pretas, de fundo plano</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>DY992</td><td>Tiras adesivas&nbsp;</td></tr><tr><td>Leitor de Microplacas Multi-Modo Synergy Neo2</td><td>Tecnologia Híbrida Neo2 Biotek</td><td>Synergy</td><td>, Software Gen5</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>0030 120.086</td><td>tubos de 1,5 ml</td></tr><tr><td>Ultrasonics-Branson SFX250</td><td>Branson</td><td>101-063-966R</td><td>1/2" Chifre Sólido e 1/8" microtip&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro ensaio para estudar a agregação da proteína tau e rastreio de drogas

In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening

Agregação da proteína tau e formação de filamentos helicoidais emparelhados são uma marca registrada da doença de Alzheimer e outras Tauopatias. Em comparação com outras proteínas associadas com doenças neurodegenerativas, a cinética de agregação relatado em vitro para proteína tau são menos consistente, apresentando uma variabilidade relativamente alta. Aqui descrevemos o desenvolvimento de um em vitro ensaio de agregação que imita os passos esperados associados tau enrolamento e agregação em vivo. O ensaio utiliza o isoform tau mais longa (huTau441), que contém inserções de ácido N-terminal, bem como quatro domínios de ligação de microtúbulos (MBD). A agregação em vitro é desencadeada pela adição de heparina e seguida continuamente por fluorescência de thioflavin T em um formato de 96 microplacas bem. O ensaio de agregação do tau é altamente reprodutível entre diferentes poços, corridas experimentais e lotes da proteína. A agregação leva a tau PHF-como morfologia, que é muito eficiente em semeadura a formação de estruturas fibrillar de novo . Além de sua aplicação no estudo do mecanismo de enrolamento de tau e agregação, o ensaio atual é uma ferramenta robusta para a seleção de medicamentos que podem interferir com a patogênese da tau.

HuTau441 recombinante contendo as mutações C291A e C322A e N-terminal C-terminal C-marcas e a dele foi expressa e purificado como anteriormente descrito24. Os lotes huTau441 são altamente puros como visualizado em SDS-PAGE e praticamente 100% monomérico avaliada pelo S-MALS (Figura 1). A agregação de 15 µM huTau441 foi induzida pela adição de heparina HMW 8 µM e a reação foi seguida continuamente ThT fluorescência usando um leitor de microplacas multimodo. O comprimento de onda de excitação foi 440 nm (nm de largura de banda de 20) Considerando que a emissão foi medido em 485 nm (largura de banda de 20 nm). O ensaio é altamente reprodutível, com resultados de 10 poços individuais sendo virtualmente indistinguíveis (Figura 2A). As morfologias dos agregados ThT huTau441 positivos foram avaliadas após 50 h por AFM. Hutau441 agregados é uma mistura homogénea de fibrillar estruturas de diferentes comprimentos semelhantes ao relatado ex vivo morfologias (Figura 2B). Além disso, a mistura de reação final não contém monômero, sugerindo uma conversão completa em agregados, conforme mostrado pelo S-MALS as medições (Figura 2). A cinética da agregação de huTau441 em corridas experimentais independentes são muito semelhantes, como enfatizado por curvas sigmoidal semelhantes e indistinguíveis fases lag e crescimento (Figura 3). O elevado nível de reprodutibilidade é mantido quando são utilizados diferentes lotes de proteína (Figura 4). Além disso, huTau441 pré-formadas agregados são muito eficientes em recrutamento monômero de tau e induzindo a formação de agregados de tau de novo . Quantidades tão baixas quanto 0,0025% (v/v) de agregados de tau pré-formados são capazes de contornar a nucleação e geração de gatilho de fibrilhas de novo (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig1.jpg"> Figura 1: huTau441 recombinante é monomérica e altamente puro. A) avaliação de pureza sob condições em um gel de SDS-PAGE 4-12% incluindo escada de proteína padrão de peso molecular (em kDA) de desnaturação (faixa 1); fluem através da C-marca afinidade purificação etapa final (faixa 2); fração de lavagem de coluna (faixa 3), eluidos pico de proteína huTau441, antes (faixa 4) e depois de buffer de câmbio (faixa 5), respectivamente). B) análise de S-MALS do huTau441. Proteína mostra ser &gt; 99.9% monomérica com uma massa molar de 51 kDa e não contém agregações ou fragmentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig2.jpg"> Figura 2: agregação de huTau441 recombinante é altamente reprodutível e leva quantitativamente a estruturas fibrillar. A) cinética de heparina induzida huTau441 agregação monitorizada continuamente em 96 microplacas bem formato por fluorescência ThT. Concentrações de huTau441 e heparina são 15 µM e 8 µM, respectivamente. As 10 curvas individuais correspondem à conversão do mesmo lote em dez poços da microplaca a mesma proteína e caracterizam-se por uma fase de retardo médio (com SD) de 14,2 ± 0,38 h e t50 de 18,8 ± dados cinéticos de 0,40 h. era equipado com um 5-parâmetro logisti c curva com um declínio linear a assímptota superior. Atraso de fase e t50 foram calculados por interpolação entre os valores previstos por regressão linear. Fase de retardo é calculado com base no aumento de 3% do sinal de fluorescência ThT. Curva de encaixe e resumidas de estatísticas são obtidas usando o IBM SPSS versão estatísticas 20.0.0.2. B). agregados Tau mostram morfologias semelhantes a PHF conforme indicado pela imagem latente de AFM a 50 h; C). análise de S-MALS de huTau441 monoméricos (t = 0 h) e o sobrenadante da mistura de reação após a conclusão da reação (t = 50 h). No ponto de altura h 50 a mistura de reação foi centrifugada durante 1h a 20.000 X g e 4 ˚ c e o sobrenadante resultou injetado na S-MALS. O desaparecimento do pico do monômero confirma a agregação completa de tau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig3.jpg"> Figura 3: O ensaio de agregação de tau mostra grande reprodutibilidade entre execuções experimentais independentes. Os dois painéis exibem quatro traços individuais cinética para agregação espontânea huTau441 coletados em dois experimentos independentes, usando o mesmo lote de proteína huTau441. Concentrações de huTau441 e heparina são 15 µM e 8 µM, respectivamente. Cinética caracterizam-se por uma fase de retardo médio (com SD) de 12,2 ± 0,18 h e t50 de 17,8 ± 0,8 h (executar 1) e 11,6 ± 0,52 h e t50 de 17,8 ± 0,23 h (Run 2), respectivamente. Dados cinéticos foi equipados com uma curva logística 5-parâmetro com um declínio linear a assímptota superior. T50 foram calculados por interpolação entre os valores previstos por regressão linear. Fase de retardo é calculado com base no aumento de 3% do sinal de fluorescência ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig4.jpg"> Figura 4: O ensaio de agregação de tau mostra grande reprodutibilidade entre lotes diferentes da proteína huTau441. Cada painel mostra que quatro repetições correspondente a um lote específico de huTau441. A agregação de cada lote foi seguida em experimentos independentes. Concentrações de huTau441 e heparina são 15 µM e 8 µM, respectivamente. Cinética de agregação correspondente para o tau individual quatro lotes caracterizam-se por uma fase de retardo médio (com SD) de 15,3 ± 0,38 h e t50 de 21,1 ± 0,46 h (lote 1); fase de retardo de 12,5 ± 0,07 h e t50 de 19,8 ± 0,34 h (lote 2); lag fase de 15,1 ± 0,34 h e t50 de 21,9 ± 0,86 h (lote 3) e atraso de fase de ± 11,5 0,29 h e t50 de 17,8 ± 0,29 h (lote 4), respectivamente. Dados cinéticos foi equipados com uma curva logística 5-parâmetro com um declínio linear a assímptota superior. Atraso de fase e t50 foram calculados por interpolação entre os valores previstos por regressão linear. Fase de retardo é calculado com base no aumento de 3% do sinal de fluorescência ThT. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58570/58570fig5.jpg"> Figura 5: hutau441 pré-formadas agregados têm alto semeadura atividade. Para iniciar a semeadura, agregados de tau lisados foram adicionados ao monômero hutau441. De vermelho para azul, cada cor das curvas cinéticas diferentes representa a quantidade de sementes adicionadas diferente: 1,25%, 0,63%, 0,31%, 0,16%, 0,08%, 0,04%, 0,02%, 0,01%, 0,005% e 0,0025% (v/v), respectivamente. Conversão espontânea de hutau441 é representada em preto. Todas as condições foram testadas em quatro exemplares. As quatro repetições cinéticas associadas com uma determinada concentração de sementes são altamente reprodutível e na maioria dos casos indistinguíveis. Concentrações de hutau441 e heparina são 15 µM e 8 µM, respectivamente. A adição de pequenas quantidades de estruturas pré-formadas de fibrillar lisadas elimina a fase de retardo inicial observada na conversão espontânea e o efeito é proporcional com a quantidade de sementes. De vermelho a azul, a diferença de t50 observado (t50 spont.conv-t50 semeadura) é 18,9, 18.40, 17.8, 17.3, 16,6, 16.1, 15.4, 14,7, 14,2 e 13.7 horas, respectivamente. Conversão espontânea de hutau441 é caracterizada por uma média de t50 (com SD) 19.85 ± 0,54 h. dados cinéticos foi equipado com uma curva logística 5-parâmetro com um declínio linear a assímptota superior. t50 foram calculados por interpolação entre os valores previstos por regressão linear. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58570/58570fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

O ensaio de agregação de tau descrito neste manuscrito imita as características antecipadas de na vivo tau enrolamento e agregação.

In Vitro Ensaio para estudar a agregação da proteína Tau e rastreio de drogas

Aggregation of tau protein and formation of paired helical filaments is a hallmark of Alzheimer&#39;s disease and other tauopathies. Compared to other ...

O descompactamento da proteína Tau em sua auto-montagem em filamentos helicosos emparelhados é uma marca patológica da doença de Alzheimer e outras Tauopatias. Aqui apresentamos um robusto ensaio de agregação tau que poderia ajudar a elucidar o processo de patogênese tau. A conversão segue todas as etapas de um processo de polimerização dependente de nucleação e é altamente reprodutível, permitindo a triagem de medicamentos em um formato mais rigoroso que atendeu ao nível OBSI até o momento.A qualidade dos reagentes é crucial. O Tau recombinante precisa ser altamente puro e desprovido de agregados e de fragmentos. Primeiro ligue o computador e o leitor de microplacões multimodo.Depois de permitir que o equipamento se estabilize, inicie o software e selecione Protocolo Padrão como o tipo de protocolo. Defina a temperatura para 37 graus Celsius e selecione Pré-aqueça antes de continuar o protocolo. Em seguida, defina o tempo de execução cinético para 50 horas e o intervalo de medição para 15 minutos.Ajuste o tremor orbital para 425 ciclos por minuto em modo contínuo. Após isso, selecione o método de leitura como momochromators cinéticos de intensidade de fluorescência. Defina o comprimento de onda de excitação para 440 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 485 nanômetros, a posição óptica para cima, e o ganho para 80.Selecione a velocidade de leitura normal e defina a altura de leitura para 4,50 milímetros. Em seguida, validar e salvar o protocolo. Inicie a execução usando o protocolo criado.Nomeie o experimento, selecione o destino do arquivo recém-criado e permita que o instrumento se equilibre previamente à temperatura desejada. Para um experimento de conversão tau recombinante espontâneo, prepare uma amostra de reação de 1.000 microliteres com 800 microliters para fluorescência thioflavina-T, e 130 microlitres para análise SEC-MALS, misturando pela primeira vez a proteína com o tampão de reação em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione heparina e thioflavina-t e misture bem por pipetting para cima e para baixo cinco vezes.É importante executar o protocolo precisamente para garantir alta reprodutibilidade, misturar reagentes na mesma ordem e manter dentro de prazos. Gire a amostra a 12.000 x g e 25 graus Celsius por cinco minutos para eliminar bolhas de ar. Após a centrifugação dispensar 200 microliters de amostra de reação por poço em uma microplacão de 96 poços, evitando a formação de bolhas de ar.Em seguida, sele a microplacão para evitar a evaporação. Coloque a microplacão em um leitor de microplato multimode. Selecione a placa completa ou se a placa não estiver cheia, selecione os poços a serem lidos e inicie a medição.Exporte os dados para o software de processamento de dados. Em seguida, remova a microplacão do equipamento. Em seguida, remova o selador da microplacão.Misture a amostra agregada nos poços por pipetação para cima e para baixo duas vezes, e acumule as diferentes réplicas em tubos de 1,5 mililitro. Misture cada amostra cuidadosamente por pipetar para cima e para baixo cinco vezes, e dispense 10 a 20 microliters em uma superfície mica para analisar os agregados por microscopia de força atômica. Na sequência, colde os agregados girando cada um tubo de 1,5 mililitro a 20.000 x g e 4 graus Celsius por uma hora.Analise o supernatante pela SEC-MALS para confirmar a ausência de Tau monomédico na amostra, indicando uma conversão bem sucedida em agregados. Em seguida, remova todos os supernacantes restantes e rotule o tubo de 1,5 mililitro contendo os demais agregados com a concentração inicial de proteína Tau recombinante e o volume amostral. Espergue os agregados e armazene a 80 graus Celsius.Para um experimento semeado, remova os agregados tau recombinantes do congelador, adicione o volume de tampão de reação indicado no rótulo e permita que o tubo estabilize até a temperatura ambiente. Em seguida, resuspense os agregados pipetting para cima e para baixo cinco a oito vezes. Sonicar a amostra agregada de 200 microliter no gelo usando uma microfina de 1/8 polegadas por um período total de 15 segundos com pulsos de um segundo ligado e dois segundos fora com 30% de amplitude.Em seguida, prepare uma amostra de reação de 800 microliter misturando a proteína com o tampão de reação em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione heparina e thioflavina-t e misture bem por pipetting para cima e para baixo cinco vezes. Gire as amostras a 12.000 x g e 25 graus Celsius por cinco minutos para eliminar bolhas de ar.Após a centrifugação, dispense 198 microliters de amostra de reação por poço em uma microplacão de 96 poços, evitando a formação de bolhas de ar. Homogeneize a amostra de fibral pré-formada por pipetação para cima e para baixo três vezes. Adicione a quantidade correspondente à porcentagem desejada de sementes em cada poço e misture por pipetar para cima e para baixo três vezes.Em seguida, sele a microplacão para evitar a evaporação. Coloque a microplacão no leitor de microplacões multimodo e inicie a medição. Após a conclusão do experimento, remova a microplacão do equipamento.Em seguida, exporte os dados para uma planilha. Tau recombinante contendo as mutações C291A e C322A e n terminal suas e c-tags terminais são altamente puras como visualizadas na página SDS e praticamente 100% monoméricas como avaliado pela SEC-MALS. A agregação tau recombinante induzida por heparina foi seguida pela fluorescência thioflavina-T usando um comprimento de onda de excitação de 440 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 485 nanômetros.O ensaio é altamente reprodutível com resultados de 10 poços individuais sendo virtualmente indistinguíveis. Os agregados tau recombinantes são uma mistura homogênea de estruturas fibulares de diferentes comprimentos, semelhante às morfologias ex-vivo relatadas. A mistura de reação final não contém monômero, sugerindo uma conversão completa em agregados, como mostrado pelas medidas SEC-MALS.A cinética da agregação tau recombinante em corridas experimentais independentes são semelhantes, como enfatizado por curvas sigmoidal semelhantes e fases de lag e crescimento indistinguíveis. O alto nível de reprodutibilidade é mantido quando diferentes lotes de proteína são usados. Os agregados tau recombinantes pré-formados são eficientes no recrutamento do monômero Tau e na formação indutora de agregados de novo Tau, e a eficiência do processo é diretamente proporcional com a porcentagem de sementes.Valores tão baixos quanto 0,0025 por cento dos agregados tau pré-formados expressos em volume são capazes de contornar a nucleação Tau recombinante e desencadear a geração de novo fibral. O ensaio atual imita o que se acredita ser o descompacto in vivo e agregação de Tau e permite estudos mecanicistas que poderiam lançar luz sobre o processo de patogênese e constitui uma ferramenta valiosa para o rastreamento de medicamentos e estudo da interferência de candidatos a medicamentos com diferentes estágios do processo. A alta reprodutibilidade do ensaio permitirá que os cientistas o implementem com relativa facilidade em laboratório.Embora o ensaio atual se concentre apenas no mais longo tau isoform, humano Tau-441, a aplicação pode ser adaptada para estudar diferentes variantes tau. E não se esqueça, selecionar os reagentes proteicos certos e produzi-los a altos padrões de qualidade são essenciais para criar um ensaio robusto e altamente reprodutível.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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Uma técnica de citometria de fluxo FRET para detectar a agregação de proteína repórter induzida por sementes de Tau

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