Name: Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Aprenda a criar modelos Jurkat repórter para infecção por HIV-1 usando engenharia genômica baseada em CRISPR-Cas9. Este método permite integração proviral direcionada a sítios específicos do genoma humano.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a Britta Weseloh e Bettina Abel para assistência técnica. Agradecemos também Arne Düsedau e Jana Hennesen (fluxo cytometry plataforma tecnológica, Heinrich Pette Institut) para suporte técnico.

<ol><li>Hughes, S. H., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Integration+Sites+Tell+Us+about+HIV+Persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">What Integration Sites Tell Us about HIV Persistence.</a> Cell Host and Microbe. 19 (5), 588-598 (2016).</li>
<li>Marini, B., Kertesz-Farkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li>
<li>Cesana, D., Santoni de Sio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1-mediated+insertional+activation+of+STAT5B+and+BACH2+trigger+viral+reservoir+in+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HIV-1-mediated insertional activation of STAT5B and BACH2 trigger viral reservoir in T regulatory cells.</a> Nature Communications. 8 (1), 498(2017).</li>
<li>Cohn, L. B., Silva, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Integration+Landscape+during+Latent+and+Active+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Integration Landscape during Latent and Active Infection.</a> Cell. 160 (3), 420-432 (2015).</li>
<li>Han, Y., Lassen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Ikeda, T., Shibata, J., Yoshimura, K., Koito, A., Matsushita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+HIV-1+integration+at+the+BACH2+locus+in+resting+CD4%2B+T+cell+populations+during+effective+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Recurrent HIV-1 integration at the BACH2 locus in resting CD4+ T cell populations during effective highly active antiretroviral therapy.</a> The Journal of Infectious Diseases. 195 (5), 716-725 (2007).</li>
<li>Wagner, T. A., Mclaughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+of+cells+with+HIV+integrated+into+cancer+genes+contributes+to+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Proliferation of cells with HIV integrated into cancer genes contributes to persistent infection.</a> Science. 345 (6196), 570-573 (2014).</li>
<li>Maldarelli, F., Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li>
<li>Jordan, A., Bisgrove, D., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+reproducibly+establishes+a+latent+infection+after+acute+infection+of+T+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">HIV reproducibly establishes a latent infection after acute infection of T cells in vitro.</a> The EMBO Journal. 22 (8), 1868-1877 (2003).</li>
<li>Mack, K. D., Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+insertions+within+and+proximal+to+host+cell+genes+are+a+common+finding+in+tissues+containing+high+levels+of+HIV+DNA+and+macrophage-associated+p24+antigen+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Acquired+Immune+Deficiency+Syndromes%22%5BJournal%5D)">HIV insertions within and proximal to host cell genes are a common finding in tissues containing high levels of HIV DNA and macrophage-associated p24 antigen expression.</a> Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 33 (3), 308-320 (2003).</li>
<li>Byrne, S. M., Ortiz, L., Mali, P., Aach, J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-kilobase+homozygous+targeted+gene+replacement+in+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Multi-kilobase homozygous targeted gene replacement in human induced pluripotent stem cells.</a> Nucleic Acids Research. 43 (3), 1-12 (2014).</li>
<li>ZhangLab. CRISPR Genome Engineering Toolbox: Target Sequence Cloning Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf">https://www.addgene.org/static/cms/filer_public/e6/5a/e65a9ef8-c8ac-4f88-98da-3b7d7960394c/zhang-lab-general-cloning-protocol.pdf</a> (2013).</li>
<li>Moser, F. Addgene. Gibson Assembly Protocol. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/">https://www.addgene.org/protocols/gibson-assembly/</a> (2009).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by PCR. Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/">https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/</a> (2014).</li>
<li>Addgene Plasmid Cloning by Restriction Enzyme Digest (aka Subcloning). Addgene website. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ ">https://www.addgene.org/protocols/subcloning/ </a> (2013).</li>
<li>Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCTop%3A+An+intuitive%2C+flexible+and+reliable+CRISPR-Cas9+target+prediction+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+%28PLoS%29+ONE%22%5BJournal%5D)">CCTop: An intuitive, flexible and reliable CRISPR-Cas9 target prediction tool.</a> Public Library of Science (PLoS) ONE. 10 (4), (2015).</li>
<li>Lange, U. C., Bialek, J. K., Walther, T., Hauber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pinpointing+recurrent+proviral+integration+sites+in+new+models+for+latent+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Pinpointing recurrent proviral integration sites in new models for latent HIV-1 infection.</a> Virus Research. 249, (2018).</li>
<li>Bialek, J. K., Dunay, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+HIV-1+Latency+Reversal+Using+CRISPR-Cas9-Derived+Transcriptional+Activator+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted HIV-1 Latency Reversal Using CRISPR-Cas9-Derived Transcriptional Activator Systems.</a> PloS ONE. 11 (6), e0158294(2016).</li>
<li>Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+CRISPR-Cas9+design+tools+and+the+effect+of+target+site+accessibility+on+Cas9+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Examination of CRISPR-Cas9 design tools and the effect of target site accessibility on Cas9 activity.</a> Experimental Physiology. 103 (4), 456-460 (2018).</li>
<li>Jensen, K. T., Fløe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+guide+sequence+secondary+structure+affect+CRISPR-Cas9+gene+editing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and guide sequence secondary structure affect CRISPR-Cas9 gene editing efficiency.</a> FEBS Letters. 591 (13), 1892-1901 (2017).</li>
<li>Simonetti, F. R., Sobolewski, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonally+expanded+CD4+%2B+T+cells+can+produce+infectious+HIV-1+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Clonally expanded CD4 + T cells can produce infectious HIV-1 in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (7), 1883-1888 (2016).</li>
<li>Chen, H. C., Martinez, J. P., Zorita, E., Meyerhans, A., Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+effects+influence+HIV+latency+reversal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Position effects influence HIV latency reversal.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (1), 47-54 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um protocolo para gerar modelos de HIV-1-derivado Jurkat repórter com sites de integração proviral escolhido aplicando engenharia CRISPR-Cas9-baseado do genoma.
Vários pontos do protocolo requerem atenção cuidadosa durante a fase de planejamento. Primeiro, o locus ser alvo deve ser escolhido com cuidado, como alguns loci pode ser mais fácil para o alvo do que outros (por exemplo,, dependendo do estado da cromatina da região e o destino de sequências em si). Sequência...

Integração do DNA proviral no genoma hospedeiro após infecção é um passo crítico no ciclo de vida do vírus de imunodeficiência humana (HIV). Após a integração, o HIV persiste, estabelecendo a latência em subconjuntos de células T CD4 + long-lived tais como as células T CD4 + de memória. Integração do HIV parece ser não-aleatória1,2. Um número de hotspots genômicas com DNA proviral recorrentemente integrado foi detectado em vários estudos através do sequenciamento de sites de integração em indivíduos infectados agudamente e cronicamente2,3,4 ,5,6,7,8. Curiosamente, em alguns destes sites de integração, o mesmo locus foi detectado em uma grande fração de células infectadas, levando à ideia de que integração em locais recorrentes pode afetar positivamente a expansão clonal1.
Para avançar a nossa compreensão da importância de sites de integração recorrentes, escolha de local de integração proviral deve ser explorada. No entanto, vários aspectos técnicos dificultam a integração de HIV estuda site escolha e as consequências. Amplamente utilizados modelos de cultura celular de latência do HIV, como linhas de célula JLat não refletem integração recorrentes clinicamente relevantes sites9. Estudos em células derivado de paciente primários, por um lado, permitem a descrição da paisagem local de integração de sequenciação mas não permitem análises funcionais. A nosso conhecimento, nenhum modelo experimental adequado está disponível para analisar funcionalmente sites selecionados de integração clinicamente relevantes.
Aqui nós apresentamos um fluxo de trabalho detalhado para gerar novos modelos para a infecção pelo HIV, utilizando tecnologia de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma. O fluxo de trabalho aqui descrito pode ser usado para gerar linhas de células de repórter derivado de células T que modelam a infecção pelo HIV, carregando um repórter proviral integrado genomically em um site de integração escolhido. Assim, estão servindo como novas ferramentas para explorar como o site de integração proviral pode afetar a biologia do HIV, e como o pró-vírus responde às estratégias de tratamento diferentes (por exemplo,, inducibility por agentes de inversão de latência). Nosso método usa as vantagens de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma, no qual a integração do repórter sequência por recombinação homóloga é facilitada por uma quebra Cas9 induzida por nuclease dobro-costa no local de destino. Sites de destino para a integração são escolhidos de acordo com a proximidade aos locais descritos integração recorrentes de estudos em indivíduos infectados pelo HIV e a presença de motivos de PAM apropriados para engenharia de genoma Cas9-mediada.
Em nossos resultados exemplares, enfocamos o locus de gene BACH2, quais códigos para o regulador transcricional BTB e homologia de CNC 2. Em indivíduos cronicamente infectadas com o HIV em terapia anti-retroviral, BACH2 é um dos loci mostrando o enriquecimento de integrado HIV-1 sequências3,6,7,8,10. Nós escolhemos um repórter HIV-derivado mínimo consistindo de HIV-1-derivado longo terminal repetição (LTR), a sequência de código tdTomato e hormônio de crescimento bovino (BGH) sinal de poliadenilação (PA), que podemos ter como alvo a dois locais específicos em BACH2 intron 5. O protocolo apresentado é otimizado para células Jurkat, uma humana CD4 + linha celular suspensão derivado de células T, mas outras células linhas podem ser utilizadas e o protocolo adaptado em conformidade. Apresentamos um fluxo de trabalho detalhado para a seleção do local de destino, a construção do vetor de alvo com braços de homologia, CRISPR Cas9-mediada por direcionamento do repórter no local escolhido genômico, geração e seleção de linhas clonais e abrangentes verificação linha de celular do repórter recém-gerado, alvo.

<table><tbody><tr><td>pX330-U6-Chimeric_BB-cBh-hSpCas9</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>vetor para expressão de SpCas9 e gRNA</td></tr><tr><td>pMK</td><td>GeneArt</td><td></td><td>vetor de expressão de mamíferos para clonagem</td></tr><tr><td>de cDNA3.1</td><td>Invitrogen</td><td>V79020</td><td>vetor de expressão de mamíferos para clonagem</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0539S</td><td>enzima de restrição</td></tr><tr><td>NEBuilder Hifi DNA Kit de clonagem de montagem</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520S</td><td>Kit de clonagem de montagem usado para geração de vetor alvo</td></tr><tr><td>Sistema de PCR de precisão TaqPlus</td> DNA polimerase <td>Agilent Technologies</td><td>600210</td><td>com atividade de revisão usada para amplificação de braços de homologia (etapa 1.2.2.2), verificação do local de integração e sequência repórter (etapa 3.3.3 e 3.3.5), geração de sonda genômica para Southern blot (etapa 3.4.1.5) e análise de eventos fora do alvo (etapa 3.5.4)</td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 96 poços (fundo redondo)Placas de</td> cultura de tecidos <td>TPP</td><td>92097</td><td>para revestimento de diluição</td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerase de alta fidelidade</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530 L</td><td>DNA polimerase usada para detecção de eventos de direcionamento (etapa 2.4.2) e geração de sonda específica do repórter para Southern blot (etapa 3.4.1.4)</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9170</td><td>dimetilsulfóxido como PCR solução aditiva</td></tr> de <tr><td>cloreto de magnésio (MgCl2)</td><td>Solução de</td><td></td><td>MgCl2 como aditivo de PCR</td></tr><tr><td>Mistura de solução de desoxinucleotídeo (dNTP)</td> New <td>England Biolabs</td><td>N0447S</td><td>mistura dNTP com 10 mM de cada nt para reações de PCR</td></tr><tr><td>5PRIME HotMasterMix</td><td>5PRIME</td><td>2200400</td><td>mistura de PCR pronta para uso usada para triagem de PCR (etapa 3.2.11)</td></tr><tr><td>Mini kit de sangue de DNA QIAamp</td> Kit de <td>isolamento e purificação de DNA</td><td>Qiagen</td><td>51106</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td> Kit de <td>purificação de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td></tr><tr><td>RPMI 1640 sem glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE12-167F</td><td>meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Soro bovino fetal África do Sul Charge</td><td>PAN Biotech</td><td>P123002</td><td>suplemento</td></tr> <tr><td>de meio de cultura de célulasL-glutamina</td><td>Biochrom</td><td>K 0282</td><td>suplemento de meio de cultura celular</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 10.000 U/mL/ 10.000 &micro; g/mL</td><td>Biochrom</td><td>A 2212</td><td>suplemento de meio de cultura de células</td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM Meio de soro reduzido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985062</td> meio de <td>cultura de células com concentração de soro reduzida otimizado para transfecção</td></tr><tr><td>TransIT-Jurkat</td><td>Mirus Bio</td><td></td><td>MIR2125 reagente de transfecção</td></tr><tr><td>forbol 12-miristato 13-acetato Sigma-Aldrich</td><td></td><td>P8139-1MG</td><td>cultura de células reagente</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634-1MG</td><td>reagente de cultura de células</td></tr><tr><td>Unidade de filtro acionada por seringa, membrana PES, 0,22 &micro; m</td> Unidade <td>de filtro SLGP033RB</td><td>Millex</td><td>para filtração estéril</td></tr><tr><td>Incubadora Heracell 150i Incubadora</td> de cultura de <td>tecidos</td><td>51026280</td><td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Amershan Hybond-N+</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN1520B</td><td>membrana de nylon carregada positivamente para blotting de DNA e RNA</td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Reticulador UV</td></tr><tr><td>High Prime</td><td>Kit</td><td>de 11585592001</td> Roche <td>para marcação de DNA com dCTP radioativo usando oligonucleotídeos aleatórios como primers</td></tr><tr><td>illustra ProbeQuant G-50 Micro Colunas</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9034-08</td><td>colunas de rotação de cromatografia para purificação de DNA marcado</td></tr></tbody></table>

baseados em crispr-cas9 genoma engenharia para gerar modelos jurkat repórter para a infecção de hiv-1 com sites selecionados proviral integração

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

Vírus de imunodeficiência humana (HIV) integra o DNA proviral não aleatoriamente no genoma da célula de acolhimento em sites recorrentes e genômicas hotspots. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a geração de novos modelos in vitro para a infecção pelo HIV com sites de integração genômica escolhido usando tecnologia de engenharia baseados em CRISPR-Cas9 genoma. Com este método, uma sequência de repórter de escolha pode ser integrada em um locus genômico escolhido, alvo, refletindo sites integração clinicamente relevantes.
No protocolo, o design de um repórter de HIV-derivado e escolhendo de uma sequência de site e gRNA de destino são descritos. Um vetor de direcionamento com braços de homologia é construído e transfectado em células Jurkat T. A sequência de repórter é direcionada para o site selecionado genômico por recombinação homóloga, facilitada por uma quebra de dobro-costa Cas9-mediada no local de destino. Clones de célula única são gerados e examinados para segmentação de eventos por citometria de fluxo e PCR. Os clones selecionados são então expandidos, e direcionamento correto é verificado pela PCR, sequenciamento e mancha do Sul. Eventos fora do alvo potencial de engenharia CRISPR-Cas9-mediada do genoma são analisados.
Usando este protocolo, sistemas de cultura de células de novela essa infecção de HIV modelo em sites de integração clinicamente relevantes pode ser gerada. Embora a geração de clones de célula única e verificação de integração de sequência correto repórter são demorados, as linhas clonais resultantes são ferramentas poderosas para analisar funcionalmente a escolha do local de integração proviral.

Neste experimento representativos, optámos por um repórter de HIV-1-derivado mínimo consistindo de um LTR, sequência tdTomato-codificação e sequência de polyA-sinal para dois loci no intron 5 do gene BACH217-alvo. Os Locus para o direcionamento foram escolhidos de acordo com a proximidade de sites publicados integração recorrentes encontrados em diferentes estudos primários células T de pacientes infectados pelo HIV2,<sup class="x...

Nós apresentamos um fluxo de trabalho de engenharia do genoma para a geração de novos modelos in vitro para a infecção de HIV-1 que recapitular integração proviral em locais seleccionados genômicas. Segmentação dos repórteres HIV-derivado é facilitada pela manipulação de genoma CRISPR-Cas9-mediada, site-specific. Protocolos detalhados para geração de clone de célula única, triagem e verificação de direcionamento correta são fornecidos.

Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Este método pode ajudar a responder à questão de como a integração do provírus do HIV influencia a expressão genética andrógina, e por que certos locais de integração genômica estão sendo selecionados em células ultimamente infectadas pelo HIV. A principal vantagem dessa técnica é que podem ser produzidos modelos in vitro para infecção pelo HIV, que carregam repórteres pró-virais direcionados aos locais de integração escolhidos usando a engenharia de genoma baseada em CRISPR/Cas9. Demonstrando o procedimento estarão Thomas Walther, um estudante de doutorado, e Julia Bialek, uma pós-doutora do meu laboratório.Comece usando o Navegador de Genoma UCSC para extrair in-silico-extraindo a sequência genômica do lócus genômico desejado para ser alvo. Para escolher o guia RNAs de 20 nucleotídeos para direcionamento do lócus genômico escolhido, use a ferramenta web E-CRISP. Em seguida, selecione, Homo Sapiens Genoma Humano do Consórcio de Referência do Genoma:Construa 38.Genoma de referência como o organismo e entrada 2.000 pares de base da sequência genômica, cobrindo o lócus genômico desejado anteriormente extraído. Inicie uma pesquisa guia-RNA usando configurações médias de aplicativos com qualquer PAM, qualquer base cinco-prime, off-targets toleram incompatibilidades e excluídos introns e ilhas CPG. Da lista com possíveis designs de guia-RNA que aparece, selecione um RNA guia com uma pontuação alta para especificidade e eficiência, que está perto o mais possível do lócus genômico desejado a ser alvo.Abra o navegador NCBI Blast para explodir a sequência guia-RNA escolhida contra o genoma de referência. Para verificar a exclusividade do site de ligação guia-RNA selecionado, primeiro selecione humano como o genoma e, em seguida, insira a sequência guia-RNA como a sequência de consulta. Em seguida, selecione sequências altamente semelhantes ou Mega Blast como o programa para garantir que a sequência guia-RNA seja única.Depois disso, selecione in-silico 1.000 pares de base, upstream e downstream de sequência guia-RNA a partir de sequência genômica extraída no início. Use estes 1.000 pares de base selecionados, rio acima e rio abaixo como braços de ecologia de cinco e três primos para direcionar a construção de vetores e a sequência de repórteres adjacentes a serem alvo. 24 horas antes da transfecção de células T jurkat, prepare uma placa completa de 6 poços das células para um único experimento de alvo.Para começar, placa 1, 250.000 células em 2,5 mililitros de RPMI 1640 com suplementos e sem antibióticos, por poço. No dia seguinte, adicione aos microgramas de vetor circular de alvo e dois microgramas de Cas9 e expressão guia-RNA plasmid por poço, a 250 microliters de meio RPMI comercial otimizado para transfecção, em um tubo de reação e misture bem por vórtice. Em seguida, adicione lentamente 12 microliters de agente de transfecção ao meio de DNA sem tocar na parede do tubo.Flick o tubo e incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Adicione a mistura dropwise a um poço de células. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.E 72 horas após a transfecção, puxe as células transfeccionadas, conte-as e prepare-se para o enriquecimento pela FACS. Depois de confirmar os eventos de segmentação na população de células-alvo mistas, comece a gerar clones de células únicas preparando o meio em condição de jurkat com antecedência, coletando RPMI com antibióticos de células T jurkat saudáveis e não tratadas. Centrifugar os tubos por 5 minutos a 300 G, e filtrar o supernascer com uma seringa de 25 mililitros, usando um filtro de 0,22 micrômetros em novos tubos cônicos de 50 milímetros.Conte as células-alvo previamente enriquecidas pelo FACS, 10 a 14 dias após a expansão, e depois dilui-as em RPMI com antibióticos para uma concentração de 100.000 células por mililitro. Diluir 100 microliters desta diluição celular com 9,9 mililitros de média para atingir 1.000 células por mililitro. Em seguida, diluir um mililitro desta diluição com nove mililitros de média a uma concentração de 100 células por mililitro.Para a placa 96 placas de poço para conter uma célula por poço, misture suavemente um mililitro de solução de 100 células por mililitro com cinco mililitros de condição média e quatro mililitros de meio fresco, em um reservatório de reagente estéril. Em seguida, use uma pipeta multicanal para adicionar 100 microliters da respectiva diluição celular por poço de novas placas de fundo redondas de 96 poços para alcançar uma e duas células por diluições de poço. Empilhe as 96 placas do poço e cubra cada pilha com uma placa de seis poços contendo três mililitros de PBS por poço.Incubar as placas a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono, por três semanas. Após a incubação completa, confirme visualmente a presença de colônias cultivadas usando microscopia leve com ampliação quatro vezes, e marque os poços com colônias cultivadas. Células suavemente resuspendas de uma marcada bem por pipetação.Transfira 100 microliters desta suspensão celular para um poço de placa de fundo redonda recém-preparada com 100 microliters de RPMI com antibióticos, por poço e repita para todos os poços marcados, misture suavemente por pipetação. Para duplicar a placa, transfira 100 microliters desta suspensão celular para uma segunda placa vazia de fundo redondo de 96 poços e repita este processo para todos os poços marcados. Finalmente, preencha os poços em branco com 200 microliters de RPMI com antibióticos.Incubar as placas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Depois que a placa duplicada tiver incubado por 24 a 48 horas, duplique-a novamente adicionando 100 microliters de RPMI com antibióticos a cada poço. Use uma pipeta multicanal para misturar suavemente e transferir 100 microliters para cada poço de uma nova placa de fundo redondo de 96 poços.Coloque uma dessas duas placas duplicadas na incubadora. Use a segunda das novas placas duplicadas para citometria de fluxo, adicionando primeiro cinco microliters de PMA/Ionomicina Master Mix por poço, para estimular as células. Incubar por 24 horas e preparar as células para citometria de fluxo, conforme descrito no texto.Adsia todas as células únicas viáveis com base no tamanho da dispersão para a frente e para o lado. Analise a expressão genética do repórter fluorescente por citometria de fluxo. Para selecionar clones unicelulares por PCR, os primers de design P5 e P6 para a triagem de PCR com base na sequência de repórteres escolhida, para amplificar 500 a 800 pares base da sequência de repórteres.Para controle positivo PCR, primers de design P7 e P8 que amplifica 630 pares de base de um lócus genômico de tipo selvagem e não-direcionado. Projete um terceiro par de primer que amplifica 500 a 600 pares de base da espinha dorsal do vetor de alvo como um controle para integração inespecífica de sequências de backbone de vetor de alvo. Uma vez que os clones na segunda placa duplicada tenham crescido suficientemente, prepare-os para a triagem pcr pela primeira centrifugação da placa por 10 minutos a 300-G à temperatura ambiente.Retire cuidadosamente o supernasce, certificando-se de não perturbar a pelota celular. Lave as células com 100 microliters de PBS por tubulação suave, centrifugando a placa por cinco minutos a 300 G à temperatura ambiente. Remova o PBS e adicione 200 microliters de tampão de lise por poço.Pipeta suavemente para misturar e transferir a suspensão para uma nova placa PCR. Sele a placa com filme de parafina e incubar por uma hora a 55 graus Celsius em um termociclador. Depois de centrifugar detritos celulares em velocidade máxima por 10 minutos, transfira o supernatante para uma nova placa PCR.Adicione 10 microliters deste lysate celular a cada poço de uma placa PCR de 96 poços cheia com 110 microliters de H2O destilado, por poço. Em seguida, incubar por 10 minutos a 99 graus Celsius em um termociclador, para inativar proteinase K.Use 2 microliters deste lysate celular como modelo e use uma mistura comercial pcr master para triagem, controle e BACKBONE PCR. Execute PCR para 38 a 40 ciclos de amplificação PCR em um formato de 96 poços.Use cinco microliters de produtos PCR e execute-os em um gel TAE de 1,5% para analisar e combinar os resultados de citometria de fluxo e PCR, para confirmar clones de células únicas. A expressão genética do repórter após a indução de PMA/Ionomicina foi confirmada tanto pela citometria de fluxo quanto pela PCR em quatro a 12% das células, dependendo do local de integração. A análise pcr do DNA genômico usando primers para junção de integração de cinco prime e três primes, confirmam que os eventos de alvo ocorreram.Após a triagem de clones de células únicas para direcionamento correto por citometria de fluxo, foram observados clones com expressão genética de repórteres alto, baixo e sem expressão genética fluorescente. Clones de células únicas também foram confirmados pelo PCR usando primers específicos para repórteres e primers de controle. Clones confirmados positivos na triagem PCR foram gastos e ainda analisados para o direcionamento correto pela mancha sulista, usando uma sonda específica para repórteres e uma sonda genômica de ligação fora do repórter.Apenas uma porção mostrou tamanhos corretos de banda na análise de manchas do Sul e tinha enfatizou heterozygously o repórter, mostrando que é importante verificar os resultados da PCR pela mancha sulista. Clones também foram analisados por sequenciamento para confirmar ainda mais clones positivos unicelulares. Sequenciamento do local alvo:alelo homólogo, se o repórter não tivesse integrado, revelou mutações induzidas por Cas9.Uma vez dominada, a geração de linhas de repórteres do HIV pode ser realizada em dois ou três meses. Antes de segmentar, é importante gastar tempo suficiente escolhendo um site de integração e repórter apropriado, dependendo da pergunta de pesquisa que você gostaria de abordar. Os repórteres podem, por exemplo, incluir diferentes elementos regulatórios do HIV, se desejar.Após esse procedimento, as linhas de celular podem, por exemplo, ser usadas para testar o efeito de diferentes agentes de elevação da latência na atividade transcricional do TR repórter, dependendo do seu site de integração. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar linhas de repórter hiv específicas do local de integração para projetar RNAs guia e segmentar vetor, realizar engenharia de genoma baseada em CRISPR/Cas9 em células jurkat, produzir clones de células únicas e selecionar para clones direcionados corretamente por facs e triagem PCR. Não se esqueça, que se você optar por trabalhar com um repórter de HIV competente para replicação, você precisa trabalhar sob condições de segurança BSL3.

crispr-cas9-based-genome-engineering-to-generate-jurkat-reporter

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Atuais estratégias de HIV-1 agem para suprimir o ciclo de vida viral, mas não efetivamente erradicar a infecção. Aqui, demonstramos que uma recombinase engenharia podem eficientemente consumo DNA integrado HIV-1 proviral do genoma das células infectadas.

Entrevista: HIV-1 DNA proviral Excisão Usando um Recombinase Evolved

Ferramentas de edição de genoma, como o sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (associado a CRISPR), melhoraram muito a eficiência do direcionamento de genes em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). Este manuscrito descreve um protocolo para geração de repórter hiPSC específico de linhagem usando recombinação homóloga assistida por sistema CRISPR/Cas.

Geração eficiente de hiPSC Neurais Lineage Repórteres Knockin específica usando o CRISPR / Cas9 e Cas9 Duplo Nickase Sistema

O sistema / Cas9 CRISPR oferece o potencial para fazer genoma segmentado edição acessível e disponível para a comunidade científica. Este protocolo destina-se a demonstrar como criar vírus que vai nocaute um gene de interesse utilizando o sistema / Cas9 CRISPR, e depois injetá-las estereotáxicamente no cérebro do rato adulto.

Concepção, embalagem, entrega e de alto título CRISPR retro e lentivírus via estereotáxica Injection

Descrevemos um protocolo para amplificar locais de integração retroviral a partir do DNA genômico de células infectadas, sequenciando as junções amplificadas vírus-hospedeiro e, em seguida, mapeando essas sequências para um genoma de referência. Também descrevemos técnicas para quantificar a distribuição de locais de integração em relação a várias anotações genômicas usando BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

O cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repetições/CRISPR associado da proteína 9 (CRISPR/Cas9) sistema fornece uma ferramenta promissora para a engenharia genética e abre a possibilidade de integração específica de transgenes. Descrevemos um fim mediada por homologia, juntar-se (HMEJ)-baseado estratégia eficiente DNA alvo integração na vivo e alvo de terapias do gene usando CRISPR/Cas9.

Integração de alvo CRISPR/Cas9-mediada na Vivo usando uma estratégia de baseada em juntar-se mediada por homologia final

Descrevemos a estratégia de produção de vetores de Lentivirus integrase deficiente (IDLVs) como veículos para a entrega CRISPR/Cas9 para as células. Com uma capacidade de mediar a edição de gene rápido e robusto nas células, IDLVs apresentar um mais seguro e plataforma de vector igualmente eficazes para a entrega do gene comparado com vetores integrase-competentes.

Um protocolo para a produção de Lentivirus vetores Integrase deficiente CRISPR/Cas9-mediada Gene nocaute em dividir células

Descrevemos um ensaio baseados em células para relatório sobre HIV-1 fusão através da expressão da proteína verde fluorescente detectável por microscopia de fluxo cytometry ou fluorescência. Ele pode ser usado para testar a inibidores de entrada viral (especificamente na etapa de fusão) em sistemas de infecção sem célula e célula a célula.

Um elevado-throughput Cre-Lox ativado ensaio de fusão da membrana Viral para identificar inibidores de fusão da membrana Viral do HIV-1

Alvo de DNA Epigenoma edição representa uma poderosa abordagem terapêutica. Este protocolo descreve a produção, purificação e concentração de vetores Lentivirus all-in-one, abrigando o transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicativos de edição de Epigenoma em células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSC)-derivado de neurônios.

Vetor de Lentivirus de plataforma para a entrega eficiente de ferramentas de edição de Epigenoma em humanos induzida por modelos de doenças derivadas de células-tronco pluripotentes

São descritos protocolos para a edição altamente eficiente do genoma da haste hematopoiética Murina e das células progenitoras (HSPC) pelo sistema CRISPR/Cas9 para desenvolver rapidamente sistemas modelo de camundongo com modificações genéticas específicas do sistema hematopoiéticas.

Edição do genoma mediado por Lentivirus CRISPR/Cas9 para o estudo de células hematopoiéticas em modelos de doenças

Aqui fornecemos um protocolo detalhado passo a passo para a engenharia do genoma baseada em CRISPR/Cas9 das células B humanas primárias para nocaute genético (KO) e knock-in (KI) para estudar funções biológicas de genes em células B e o desenvolvimento de terapêuticas de células B.

Engenharia de Genoma de Células B Humanas Primárias Usando CRISPR/Cas9

Apresentamos um protocolo para transdução retroviral de RNA guia em células T primárias de camundongos transgênicos Cas9, fornecendo uma alternativa eficiente para edição gênica no estudo da diferenciação Th17.

Direcionamento de genes mediados por CRISPR/Cas9 retroviral para o estudo da diferenciação Th17 in vitro

Aprenda a criar modelos Jurkat repórter para infecção por HIV-1 usando engenharia genômica baseada em CRISPR-Cas9. Este método permite integração proviral direcionada a sítios específicos do genoma humano.

Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração (Vídeo) | JoVE Journal

Baseados em CRISPR-Cas9 genoma engenharia para gerar modelos Jurkat repórter para a infecção de HIV-1 com Sites selecionados Proviral integração

Explorar mais vídeos