Name: Um modelo de Mouse controlado para sepse Neonatal Polymicrobial (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: Aprenda a preparar e injetar cecal slurry em camundongos neonatais para estudar sepse polimicrobiana. Este protocolo padronizado permite identificar filhotes moribundos precocemente através de abordagem baseada em dados.

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Agradecimento especial a Claire Harrison e a Animal conta facilidade em British Columbia infantil Hospital Research Institute (BCCHR) pelo seu apoio no trabalho animal, bem como Dr. Po-Yan Cheng para sua orientação e entrada no monitoramento de animais e o bem-estar.

<ol><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+regional%2C+and+national+causes+of+child+mortality+in+2000-13%2C+with+projections+to+inform+post-2015+priorities%3A+an+updated+systematic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis.</a> The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+mortality+and+altered+immunity+in+neonatal+sepsis+produced+by+generalized+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis.</a> Shock. 28 (6), 675-683 (2007).</li>
<li>Fink, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Animal models of sepsis.</a> Virulence. 5 (1), 143-153 (2014).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+innate+immunity+predisposes+murine+neonates+to+poor+sepsis+outcome+but+is+reversed+by+TLR+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists.</a> Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+CXC+ligand+10%2FCXC+receptor+3+signaling+in+the+murine+neonatal+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis.</a> Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+immunity+and+defects+in+the+neonatal+and+elderly+immune+response+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis.</a> Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).</li>
<li>Cuenca, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+emergency+myelopoiesis+following+polymicrobial+sepsis+in+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immunity%22%5BJournal%5D)">Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates.</a> Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).</li>
<li>Gentile, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+emergency+myelopoiesis+and+survival+in+neonatal+sepsis+by+caspase-1%2F11+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation.</a> Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).</li>
<li>Wynn, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+IL-17A+attenuates+neonatal+sepsis+mortality+induced+by+IL-18%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).</li>
<li>Fallon, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Program+Cell+Death+Receptor-1-Mediated+Invariant+Natural+Killer+T-Cell+Control+of+Peritoneal+Macrophage+Modulates+Survival+in+Neonatal+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1469(2017).</li>
<li>Young, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+after+induction+of+sepsis+by+cecal+slurry+in+PD-1+knockout+murine+neonates%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates.</a> Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).</li>
<li>Rincon, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adjuvant+pretreatment+with+alum+protects+neonatal+mice+in+sepsis+through+myeloid+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation.</a> Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).</li>
<li>Starr, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+cecal+slurry+preparation+protocol+with+improved+long-term+reproducibility+for+animal+models+of+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis.</a> PLoS ONE. 9 (12), e115705(2014).</li>
<li>Hansen, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+in+milk+fat+globule-epidermal+growth+factor-factor+8+exacerbates+organ+injury+and+mortality+in+neonatal+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).</li>
<li>Fujioka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+heme+oxygenase-1+attenuates+the+severity+of+sepsis+in+a+non-surgical+preterm+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model.</a> SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).</li>
<li>Al Asmari, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effect+of+quinacrine+against+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> BMC Nephrology. 18, PMC5273840(2017).</li>
<li>Geng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+gene+expression+profiles+and+signaling+pathways+in+rhabdomyolysis-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Pathology%22%5BJournal%5D)">Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+depletion+ameliorates+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Experimental+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice.</a> Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).</li>
<li>Nara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluations+of+lipid+peroxidation+and+inflammation+in+short-term+glycerol-induced+acute+kidney+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).</li>
<li>Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure%3A+determinants+and+characteristics+of+the+injury-induced+hyperinflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+Endpoints+for+Infectious+Disease+Animal+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Canadian Council on Animal Care. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+on%3A+choosing+an+appropriate+endpoint+in+experiments+using+animals+for+research%2C+teaching+and+testing%22">Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing</a>. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).</li>
<li>Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+endpoints+in+shock+research%5BTitle%5D)+AND+%22SHOCK%22%5BJournal%5D)">Humane endpoints in shock research.</a> SHOCK. 21 (1), 17-25 (2004).</li>
<li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+approach+for+establishing+humane+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">A systematic approach for establishing humane endpoints.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).</li>
</ol>

Dr. James Wynn recebe apoio do National Institutes of Health (NIH) / National Institute de ciências médicas gerais (R01GM128452) e o NIH /Eunice Kennedy Shriver National Instituto de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES) ( R01HD089939).

Pós-natal ratos neonatais tem muito limitada mobilidade e falha de corrigir-se após serem colocados em suas costas, mesmo quando sob ameaça. Por DOL 7, a idade dos ratos desafiada neste modelo, uma gama de movimento desde a fase de direitos-Mobile para FTR-Mobile foi observada em ratos incontestados, com uma diferença importante, ou seja que um rato incontestado nesta idade não exibir comportamento FTR-letárgico. Só ratos desafiados com sepse polymicrobial foram observados para se tornar FTR-letárgico; Portanto, esta resposta pode ser um marcador de gravidade da doença. Estar atento para o corte de um ângulo de 90° da horizontal para o movimento de quadril permite a atribuição consistente e exata do movimento de quadril letárgico ou móvel em camundongos. O período de tempo de 4 s para ver se um rato pode certo em si foi selecionado porque incontestada de ratos foram capazes de direito-se consistentemente dentro deste prazo. Repetir a medição do mouse mesmo foi evitada, enquanto o tempo para si mesmo e a medida da mobilidade do quadril foi limitada a 4 s, para evitar excessivamente cansativo o mouse, o que pode afetar sua capacidade de obter alimento e calor e pode afetar sua prognóstico melhor. Corrigindo-se da esquerda e o lado direito foram observados, e a maior das pontuações foi usado para determinar se o mouse foi um ponto de extremidade humana, porque alguns ratos foram encontrados para exibir FTR-Nonmobile de um lado tem ainda uma maior mobilidade do outro lado e b e capaz de recuperar eventualmente.
O sistema de Pontuação utilizado para avaliar a saúde do rato baseou-se sobre a aplicação de cortes categóricos ao que é um espectro de movimento e, portanto, pode ser propenso a polarização individual. Pessoal foi treinado juntos para garantir que cada pessoa marcou os ratos o mesmo; no entanto, provavelmente continuarão a existir um nível de subjetividade, levando à variação. A consistência da pontuação foi avaliada por ter sete pesquisadores que não tinham anteriormente realizado o monitoramento do rato neonatal aprender os requisitos descritos no presente protocolo e vídeo e, em seguida, independentemente atribuir comportamentos e determinar humanos ponto de extremidade. Observou-se uma precisão de 97% com a pontuação executada em 60 ratos desafiados, sugerindo que o viés individual não desempenhar um papel substancial nas atribuições comportamentais deste modelo. O protocolo de monitoramento comportamental apresentado é baseado em observações de animais desafiados em DOL 7, ainda ratos mais jovens que 6 dias em um estado saudável incontestado consistentemente se não podem, certo. Assim, os critérios de ponto de extremidade humano descrito não podem ser aplicados diretamente aos ratos mais jovens. Se os ratos mais jovens são usados neste modelo experimental, ou se for aplicado um modelo diferente de desafio com cinética de doença diferente, então critérios adequados endpoint humana devem ser desenvolvidos e pilotados para evitar a eutanásia de ratos que seria caso contrário, eventualmente, Recupere-se. O sistema de Pontuação exibe um método robusto, de melhorar a classificação de ponto de extremidade humana que, com testes e confirmação, potencialmente poderia ser aplicada a outros modelos.
Cada preparação de chorume cecal ou o uso de uma Nova cepa de rato necessária a retitration da dose cecal chorume para administrar para atingir uma dose letal semelhante. Cada preparação foi padronizada pela leitura de interesse, ou seja, sobrevivência, ao invés de dar a mesma contagem bacteriana. Concentração de bactérias viáveis do cada preparação chorume cecal, variada ligeiramente, possivelmente devido a diferenças na bactéria comensal do doador ou devido a variações no peso deixou no filtro célula de postfiltration de estoque o chorume cecal. Durante a titulação do chorume cecal, as duas primeiras ninhadas foram divididas em dois grupos e cada metade da ninhada foram desafiados com uma das duas doses para que cada uma das doses seria testada em duas ninhadas. Se a taxa de sobrevivência resultante não combina com o nível exigido, então a dose de desafio foi aumentada ou diminuída de 5% - 10% e repetiu o experimento. Várias ninhadas foram usadas para explicar diferenças de maca-para-lixo que poderiam causar resistência ou aumentaram a susceptibilidade à infecção através de uma ninhada. Era importante com precisão o título o estoque de chorume cecal com cada nova preparação para garantir que a nova titulação de chorume cecal era comparável às preparações de chorume cecal anterior. Períodos de excesso ruído e vibração, especificamente durante a compactação de asfalto e a construção de um prédio vizinho e estrada, observou-se que aumentam o estresse em barragens. Esta correlacionada com o aumento das taxas de canibalização e afetou a mortalidade dos experimentos sobrevivência, afetando mesmo ratos incontestados, indicando que pode haver impactos externos a sobrevivência neonatal, que também precisam ser controlados para.
Métodos anteriores para preparação da pasta cecal incluem o uso do chorume cecal fresco ou a preparação de chorume cecal congelado, usando uma variedade de métodos, incluindo o armazenamento em glicerol que inevitavelmente seria transferido durante o desafio. Enquanto o uso do chorume cecal fresco fornece a vantagem de ter uma composição bacteriana mais próxima ao original conteúdo cecal, há o risco de variação entre ratos de doadores individuais, devido a variação de bactérias comensais. Enquanto isso foi minimizado usando cecal doadores do mesmo fornecedor com menor tempo entre a chegada e a progressão do experimento, isto poderia tornar-se uma opção de custo proibitivo para alguns laboratórios e apresentou outro desafio de logística de sincronismo em ter idade-combinadas ratos disponíveis quando iniciar um chorume cecal experiência em camundongos neonatais que eram 7 dias de idade. Foi utilizado um método alternativo ao uso de chorume cecal fresco, onde conteúdo cecal de múltiplos doadores adultos foram agrupado, resuspended em D5W, congelado a-80 ° C sem glicerol e descongelado uma alíquota de cada vez para experimentos. A utilização de dejetos cecal de doador adulto para estudar sepse neonatal poderia potencialmente transferência de espécies de bactérias presentes no chorume cecal que o rato neonatal não tem sido exposto a, mas é uma estratégia que permite o estudo da sepse em camundongos Neonatais e tem sido usada para estudar Biologia rato neonatal nos últimos14,13,15. Cecal chorume foi diluído em D5W para fornecer nutrição para as bactérias, o que permitiu o estabelecimento de uma infecção activa, uma vez que as bactérias foram injetados e foi feito para imitar a disponibilidade de nutrientes no interior da cavidade peritoneal durante necrosante enterocolite. Glicerol não foi incluído como um agente de estabilização no congelamento de bactérias devido os potenciais efeitos colaterais negativos que poderiam decorrer de injeção de glicerol sozinha. Se glicerol tinha sido incluído na preparação da pasta cecal, então o dano potencial que glicerol sozinho poderia induzir iria precisar de ser testado, incluindo um somente glicerol (faltando cecal chorume) injeção em ratos, que teriam aumentado mouse uso. A viabilidade de bactérias das populações de chorume cecal foi testada após a congelação o estoque de chorume cecal sem glicerol e foi encontrada para ser constante, com nenhuma mudança na concentração de bactérias em alíquotas diferentes da mesma preparação de chorume cecal armazenada a-80 ° C por um 6 período de meses. Isto sugere que o armazenamento sem glicerol é viável em fornecer um resultado consistente e biológico. O uso de um preparado de granel congelado estoque cecal chorume também permitiu o uso de ratos criados internamente, reduzindo custos e, portanto, utilizando camundongos machos que seriam excesso de reprodução, reduzindo o desperdício de rato.
A identificação dos desafios falhou em camundongos foi importante para evitar a adição de ruído extra ao sistema. Depois de ser submetido a uma injeção intraperitoneal de chorume cecal, os ratos foram observados a presença de uma protuberância sob a pele, que indicou uma injeção de falha que era na verdade subcutânea. Os ratos foram observados vazamentos no local da injeção, imediatamente após a remoção da agulha e depois que lhes permite dar um passo após a injeção, porque os ratos que às vezes (raramente) vazamento apenas depois de mover o membro do local da injeção por dar um passo. A presença de uma protuberância ou vazamento após a injeção resultou na remoção do mouse a partir da análise. Afinal, qualquer um destes pode resultar em um resultado diferente devido a quantidade incorreta de chorume cecal injetado como uma diferença de 5% na dose de desafio tem sido observada para afetar a sobrevivência subsequente.
Desafio de chorume cecal experimentos frequentemente necessário letais alvo doses variando com diferentes doses de peso ajustado. Devido a isto, os volumes de injeção podem variar de tão pouco como 20 µ l e até 100 µ l. O erro experimental proporcional associado com agulha morta volume também altera junto com o volume de injeção, aumentando a dificuldade de comparar diretamente doses diferentes. Com a simples modificação de padronizar o volume de injeção, esta fonte de variância é removido do experimento.
Sistema de monitoramento comportamental do rato neonatal, utilizado neste protocolo é o primeiro de seu tipo. Intenção de pesquisadores na realização de pesquisas éticas com ratos recém-nascidos são frequentemente confrontados com a falta de um desafio de recursos para avaliar o bem-estar do animal nesta idade. O sistema de controlo intuitivo e consistente apresentado começa a resolver esta lacuna de conhecimento. Importante, esta abordagem baseada em evidência não só aumenta a qualidade dos dados experimentais obtidos, mas, ao mesmo tempo, também reduz o sofrimento dos animais experimentais.

Sepse é das principais causas de mortes infecciosas recém-nascido humano1. Porque a sepse neonatal é mal compreendido, pequenos progressos em ambos a identificação dos recém-nascidos em situação de risco mais cedo durante a doença e o desenvolvimento de tratamentos eficazes ou profilaxias. Isto exige a utilização de modelos animais de sepse para entender melhor os processo e teste possíveis intervenções. Além disso, roedores adultos respondem de forma diferente de sepse, com diferenças estatisticamente significativas no número de bactérias para administrar para obter a mesma dose letal (LD) e diferenças na resposta do hospedeiro a resultante em comparação com recém-nascidos2. Assim, sepse neonatal deve ser estudado em neonatos. Vários modelos de sepse adultos têm sido utilizados na investigação de sepse. Estes incluem um desafio por via venosa com organismos específicos implicados na sepse humano adulto ou ligadura e perfuração cecal (CLP). CLP é um modelo endógeno de desafio onde o ceco é cirurgicamente isolado, ligado e perfurado para permitir o vazamento do conteúdo intestinal no peritônio, eventualmente conduzindo à disseminação sistêmica de micróbios e seus produtos3. No entanto, o procedimento cirúrgico necessário para estabelecer o CLP é letal para animais recém-nascidos; Portanto, um método alternativo é necessário imitar o desafio de polymicrobial do CLP para induzir sepse neonatal. O modelo de chorume cecal para sepse neonatal polymicrobial foi desenvolvido para atender a essa necessidade, pelo qual o conteúdo cecal de animais é colhido, suspenso em estéril de dextrose 5% em água (D5W) e injetado intraperitonealmente em camundongos recém-nascidos2. Isso, desde então, tornou-se um modelo cada vez mais popular para estudar sepse em animais recém-nascidos e adultos e avançou substancialmente mecanicistas insights em processo4,5,6,7 a doença ,,8,9,10,11,12,13,14,15.
Dada a crescente utilização desse modelo e desejo dos pesquisadores para comparar diretamente os resultados através de publicações, é necessário para ser bem descrita e padronizada através de estudos, os aspectos técnicos. Padronização aplica-se a três aspectos do modelo, ou seja, i) a preparação da unidade populacional de chorume cecal, ii) a preparação de alíquotas o desafio para injeção em animais experimentais e iii) a definição do ponto de extremidade humana pelo qual os animais são considerados nonsurvivors em experimentos de desafio. Especificamente, métodos para preparar o estoque de chorume cecal são muitas vezes referenciados para o artigo original, introduzindo o modelo2. Um breve resumo desse modelo é que conteúdo cecal de ratos adultos foram colhido, suspenso em D5W estéril para uma concentração de 80 mg/mL e usado até 2 horas para injetar os animais experimentais. Este modelo original usado ratos da mesma idade, no mesmo local do fornecedor, que estavam alojados em suas instalações de pesquisa respectivo para menos de 2 semanas antes da colheita de conteúdo cecal. O uso de ratos criados internamente, embora reduzindo o custo de entrega do fornecedor regular e permitindo o uso de ratos em excesso de uma gama mais ampla de sexo e idade, também substancialmente aumentado variabilidade de doador-para-doador. Isto motivou o desenvolvimento de uma técnica alternativa, segundo a qual o conteúdo cecal de vários mouses foram agrupado para preparar um grande estoque, que era então aliquotadas e armazenado a-80 ° C13. Este método alternativo foi adaptado por vários grupos de14,15. No entanto, que a adaptação resultou em algumas variações técnicas, tanto da mídia de armazenamento usada (10% ou 15% de glicerol, ou D5W sozinho) e na estratégia de filtração para remover partículas (multicelular filtração através um 860 µm e, em seguida, um 190 µm filtro ou indivíduo filtrações através de 100 µm ou 70 µm filtros)13,14,15. A injeção de glicerol sozinho poderia potencialmente causar danos, dado que as injeções de glicerol de 25-50% têm sido usadas como um modelo roedor de lesão renal16,17,18,19, 20. Para evitar efeitos colaterais não intencionais de glicerol, a preparação da pasta cecal para ratos neste estudo é congelada no D5W sem glicerol, e são realizados testes de viabilidade bacteriana do armazenamento a-80 ° C. A estratégia de filtração utilizada neste estudo é uma passagem através de um filtro de 70 µm, que não tem sido comparado diretamente com as outras estratégias de filtração listadas.
Doses de peso ajustado letais de chorume cecal injetado podem variar de instalação para instalação e devem ser tituladas para fora para a letalidade desejada para grupos individuais. Com doses diferentes de desafio, os volumes de desafio que acompanha mudam por necessidade. No entanto, esse detalhe metodológico não foi relatado antes. Além disso, estratégias para procedimentos padrão, tais como a injeção intraperitoneal, raramente são elaboradas na dentro da literatura, mas técnicas individuais podem afetar se ratos recém-nascidos vazam quando injetado e impacto de seus resultados finais.
Bem-estar dos animal, incluindo uma definição de ponto de extremidade do humano, é um aspecto central deste modelo e em qualquer modelo de infecção e inflamação em roedores21. Em 1998, o Conselho canadense no cuidado Animal (CCAC) publicou extensas diretrizes para seleção de ponto de extremidade humana, definindo o ponto de extremidade humano como "qualquer real ou potencial de dor, angústia ou desconforto deve ser minimizado ou atenuado, escolhendo o mais cedo ponto de extremidade que é compatível com os objectivos científicos da pesquisa"22. Outros também atenção que os pontos de extremidade humanos devem ser estabelecidos com base na justificação científica em vez de uma interpretação subjetiva do animal estado sozinho21. Enquanto há uma riqueza de recursos para clínicos, comportamentais e critérios baseados em sinal de corpo-condição humana ponto de extremidade, mesmo no contexto de infecção e inflamação especificamente21,23,24, nenhum destes , incluindo as orientações do CCAC para ponto de extremidade humano22, mencionar ratos recém-nascidos. Assim, objetiva e cientificamente justificados os pontos de extremidade humanos são muito mais difíceis de estabelecer para animais recém-nascidos, dado tanto suas limitadas capacidades comportamentais e a falta de evidência de critérios como perda de peso, que é comumente usado para adulto ratos. Atualmente, os critérios para o ponto de extremidade humano usado para os ratos neonatais 5 - a 12 dias de idade, na literatura de chorume cecal todas as referências para o manuscrito original que introduziu o modelo2. Neste trabalho original, a definição de ponto de extremidade humana para animais recém-nascidos baseou-se em dois critérios; ou seja, a localização do mouse fora do ninho (dispersão) e a falta de pontos de leite tinham sido vistos a resultar em morte dentro de horas. Uma questão complicador na atribuição de um ponto de extremidade humano é que manchas de leite torna-se difícil ver em cepas de rato com pelo escuro, tais como a tensão C57BL/6J comumente empregado, após a primeira semana de vida, enquanto os animais doentes são monitorados até o 14º dia de vida (DOL). Animais mortos, mais podem ser encontrados postchallenge ao aplicar esses critérios (própria observação; não publicado); assim, uma definição mais rigorosa do ponto de extremidade humana é necessária para aliviar o sofrimento de animais experimentais e evitar a mortalidade em situações onde o resultado poderia ser com precisão discerniu anteriormente.
Todos os três aspectos metodológicos do modelo cecal chorume são apresentados em um procedimento de rotina, detalhando a preparação de ações de chorume cecal, um método de injeção de animais experimentais que mantém constante do volume de injeção entre as doses e reduz o risco de vazamentos e uma definição de ponto de extremidade humana para ratos de 7 a 12 dias de idade, baseada em um sistema de modelagem comportamental. Informações comportamentais dos escores de saúde rato de mais de 240 animais experimentais foi coletadas e agrupadas por resultado de sobrevivência final, demonstrando uma definição baseada em evidência de ponto de extremidade humana. O sofrimento dos animais experimentais é reduzido através da identificação de ratos neonatais moribundos no ponto mais tempo possível, enquanto resultados de sobrevivência biologicamente significativa podem ser inferidos pela observação de variáveis-chave. A representação visual da preparação da pasta cecal e comportamentos do mouse neonatal irá servir como um excelente recurso para qualquer grupo estudando sépsis ou recém-nascido desafio modelo animais.

<table><tbody><tr><td>0,1 - 20 &mu; Ponteiras de pipeta L</td><td>VWR</td><td>732-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 1,8 mL</td><td>Costar</td><td>3621</td><td></td></tr><tr><td>100 - 1000 &mu; Ponteira de pipeta L</td><td>VWR</td><td>732-0801</td><td></td></tr><tr><td>1 - 200 &mu; Pontas de pipeta L</td><td>VWR</td><td>732-0800</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo de centrífuga</td><td>FroggaBio</td><td>TB15-25</td><td></td></tr><tr><td>23G1 agulhas</td><td>Becton Dickinson</td><td>305145</td><td>apenas a agulha, não a seringa, usada para prender o mouse ao isopor</td></tr><tr><td>28G 0,5 mL Seringa de insulina</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>frasco criogênico de 2 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo de centrífuga</td><td>Fisher scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>pipeta de 5 mL</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>6 - 10 semanas C57BL/6J camundongos adultos</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>7 + dia C57BL/6J camundongos neonatais</td><td>Criados em casa</td><td>n.a</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; Filtro de células m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Sangue de Ovelha Desfibrinado</td><td>Dalynn</td><td>HS30-500</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose 5% Água (D5W)</td><td>Baxter</td><td>JB0080</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de dissecação</td><td>VWR</td><td>&nbsp; 82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecação, Ponta Afiada</td><td>VWR</td><td> 82027-592</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de dissecação, ponta afiada/romba</td><td>VWR</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (HistoPrep 95% Álcool etílico desnaturado)</td><td>Fisherbrand</td><td>HC11001GL</td><td>diluído a 70% com água duplamente destilada</td></tr><tr><td>Marcador à prova de etanol; Marcador de laboratório</td><td>VWR</td><td>52877-310</td><td></td></tr><tr><td>EZ Anestesia Vaporizador</td><td>EZ Anestesia</td><td>EZ-155</td><td></td></tr><tr><td>Germinador 500, Instrumento cirúrgico de esterilização a seco (Esterilizador de esferas quentes)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td></td></tr><tr><td>Micro Espátula</td><td>Chemglass</td><td>CG-1983-12</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta-Aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Rainin Classic PR-1000</td><td>Pipeta</td><td>Rainin 17008653</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Classic PR-20</td><td>Pipeta</td><td>Rainin 17008650</td><td></td></tr><tr><td>Classic Rainin PR-200</td><td>Rainin</td><td>17008652</td><td></td></tr><tr><td>Scale</td><td>Sartorius</td><td>BL 150 S</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de espécime</td><td>VWR</td><td>82027-440 / 82027-442</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de armazenamento quadrada de 1000 mL</td><td>Corning</td><td>431433</td><td></td></tr><tr><td>placa de isopor</td><td>Qualquer</td><td>câmara</td> de eutanásia de rato/rato Sure-Seal <td></td></tr><tr><td></td><td>Euthanex</td><td>EZ-178</td><td></td></tr><tr><td>Ágar Soja Tríptica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22091-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>VX-200 Misturador de Vórtice de Laboratório</td><td>Labnet International</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>pesa papel</td><td>Fisherbrand</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo de mouse controlado para sepse neonatal polymicrobial

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Sepse neonatal continua a ser um fardo global. É necessário um modelo de pré-clínicos para intervenções terapêuticas ou profiláticas eficazes tela. Sepse polymicrobial de rato neonatal pode ser induzida por injeção de chorume cecal intraperitonealmente em dia de ratos de vida 7 e monitorá-los para a semana seguinte. Aqui apresentados são os passos detalhados necessários para a implementação deste modelo de sepse neonatal. Isso inclui fazer um estoque de chorume cecal homogênea, diluindo-a uma dose de peso e maca-ajustado, um esboço do programa de monitoramento e uma definição das categorias de saúde observado usado para definir pontos de extremidade do humanos. A geração de um estoque de chorume cecal homogênea de doadores em pool permite a administração em muitas ninhadas ao longo do tempo, reduzindo a variação entre os doadores e evitar o uso de glicerol potencialmente tóxico. A estratégia de monitorização utilizada permite a antecipação do resultado de sobrevivência e a identificação dos ratos que mais tarde iria progredir até a morte, permitindo uma identificação anterior do ponto de extremidade humana. Duas principais características comportamentais são usadas para definir as pontuações de saúde, ou seja, a capacidade dos ratos neonatais para si quando colocados em suas costas e seu nível de mobilidade. Estes critérios potencialmente poderiam ser aplicados a morada humana os pontos de extremidade em outros estudos de doença neonatal em ratos, enquanto um estudo piloto é realizado para confirmar a exatidão. Em conclusão, essa abordagem fornece um método padronizado para sepse neonatal do modelo em ratos, proporcionando recursos para avaliar o bem-estar dos animal usado para definir o início humanos pontos de extremidade para animais desafiados.

Viabilidade de chorume cecal armazenada a-80 ° C pode ser testada ao longo do tempo por serialmente diluindo e chapeamento alíquotas de estoque de chorume cecal no ágar de tryptic soy de sangue de carneiro 5% seguido por 24h de aeróbia incubação a 37 ° C. Subsequente contagem dos viáveis conteúdo unidade (CFU) formadoras de uma preparação de chorume cecal foi encontrada para não mudar ao longo de um período de 6 meses, e a viabilidade não foi afetada pelo armazenamento prolongado a-80 ° C (Figura 2). Cada rato doador resultou, em média, em suficiente cecal chorume para desafiar três ou quatro ninhadas (dados não mostrados).
Camundongos desafiados no DOL 7 com chorume cecal a induzir sepse polymicrobial começaram a atingir o ponto de extremidade humano até 12 horas após o desafio, e sepse polymicrobial principalmente foi resolvido por postchallenge de 48 h, como observado em uma curva de sobrevivência de Kaplan-Meier combinada de dados de mais de 200 ratos desafiados (figura 1A). A letalidade foi dependente da dose de desafio administrada, com uma mudança de 5% na dose de desafio, resultando em uma cerca de 15% de diferença na taxa de sobrevivência (figura 1B). O peso do corpo do mouse foi medido em cada visita de controlo. Perda de peso foi vista em todos os animais desafiados, sendo não-discriminatório entre ratos que acabaram por sobreviver e aqueles que não durante os primeiros 24 h postchallenge (Figura 1). Após 24h, animais mais sobreviventes começaram a recuperar o seu peso, enquanto todos os nonsurvivors continuaram a perder peso e mudou-se para seu ponto de extremidade humano. No entanto, uma pequena proporção de animais que tinham mantido seu braço endireitante reflexo também continuou a perder peso ou falha ao ganho de peso, até o final do experimento, mesmo perdendo tanto quanto 20% do seu peso inicial dentro de 40 h do desafio de sobreviver. Como havia uma sobreposição de perda de peso entre os ratos que acabaram por sobreviver e aqueles que não o fez, a mudança de peso ou um limite de perda de peso pode não ser usado como critério para ponto de extremidade humano mantendo ainda o objetivo de dividir com precisão os sobreviventes de nonsurvivors.
O comportamento dos ratos foi monitorado conforme descrito no protocolo e na tabela 2. Instantâneos da saúde categorias são exibidas (Figura 3A-C). Estas fotos mostram as categorias de saúde diferentes dos ratos que não conseguiram se após serem colocados em suas costas e delinear a diferença entre móvel-FTR e FTR-letárgico, que é uma distinção importante. Incontestada ratos saudáveis desta idade não exibem atividade FTR-letárgico; Portanto, esta categoria de saúde é um marcador de doença e uma resposta ao desafio. Doente de ratos exibido sintomas FTR-letárgico (Figura 3B) e podem regredir em direção a FTR-Nonmobile (Figura 3), onde a coxa permanece paralela com a perna inferior, com pouco ou zero quadril balançar o movimento, que é um dos critérios para humana, ponto de extremidade. Os ratos também podem recuperar, ganhando maior movimento de quadril e se tornando FTR-Mobile (Figura 3A). Determinou-se o braço endireitante reflex e golo de mobilidade para a esquerda e o lado direito do mouse cada, e a maior pontuação foi utilizada para determinar se o mouse tinha atingido um ponto de extremidade humano. Informações comportamentais foi coletadas de mais de 240 animais desafiados com uma dose letal (LD60) de 60 de chorume cecal e 144 pontos de extremidade humanos foram observados (Figura 3D-F e tabela 1). Esta abordagem baseada em evidência foi usada para definir e refinar o ponto de extremidade humano através de quatro estágios da doença, categorizados pelos experimentadores com base em ambas as diferenças comportamentais entre sobreviventes e nonsurvivors e pela fração de pontos de extremidade humanos alcançado durante cada período de tempo. Durante as primeiras experiências, ratos FTR-Nonmobile que não tinha nenhum movimento de quadril consistentemente foram encontrados mortos dentro de 4-6 h deste comportamento que está sendo observado. Na coleção da informação apresentada, uma pontuação de saúde FTR-Nonmobile foi usada como critério para uma empresa de humana. De postchallenge de 12-21 h, enquanto os ratos FTR-Nonmobile foram sacrificados, animais sobreviventes e nonsurviving exibido padrões comportamentais muito semelhantes e não poderiam ser distintos de qualquer outra forma (Figura 3D). De postchallenge 21-48 h, a maioria dos sobreviventes ratos recuperou seu braço endireitante reflexo, enquanto menos de 1% dos comportamentos FTR observados foram em animais que iria sobreviver o experimento (Figura 3E). Assim, os ratos que não conseguiram se direito de ambos os lados tornou-se um critério adicional para ponto de extremidade humano durante este tempo. Entre 12 e 20 h postchallenge, 12,5% do número total de pontos de extremidade humanos foram observados, versus 80,5% entre 20 e 48 h e 7% após 48 h (tabela 1). Uma característica distintiva entre ratos que acabou por sobreviver e que eventualmente se agravou a um ponto de extremidade humano foi a perda do braço endireitante reflexo, independente de mobilidade de quadril (Figura 3F). Com efeito, entre 20 e 48 h após o desafio, um total de 121 ratos tinha falhado ao certo se de ambos os lados, com 116 destes ratos eventualmente progredir a um ponto de extremidade humano (o que representa uma precisão de 96% na identificação de ratos que não recuperariam). Para além de 48 h após o desafio, observaram-se 11 ratos falhem ao certo se de ambos os lados e 10 destes progrediu para um ponto de extremidade humano (um 91% de precisão). Além de 20 h após o desafio, o número de ratos que perdeu o braço endireitante reflexo para ambos os lados prediz o resultado final com uma precisão de mais de 90%; Portanto, este foi adicionado aos critérios de ponto de extremidade humana, para identificar os ratos nonrecovering mais cedo e reduzir rato sofrendo (tabela 1).
A frequência que os ratos precisam de monitoramento muda ao longo do tempo, devido às diferentes taxas de postchallenge de morte e é descrita na tabela 1. Um rato foi considerado em sua extremidade humana em qualquer momento se tinha falhado para a direita se exibido nonmobile movimento de quadril de ambos os lados, ou se o mouse foi encontrado espalhada do ninho, foi incapaz de direito próprio e tinha movimento de quadril letárgico. Ratos com uma dessas condições não eram esperados para ser capaz de voltar para a maca e foram observados para ser FTR-Nonmobile dentro de 4-6 h h 20 começando após o desafio, um novo ponto de extremidade humano foi adicionado porque a informação apresentada mostra que o vasto maioria dos ratos que FTR de ambos os lados acaba por sucumbir à doença.
Os vídeos, tabelas e recursos apresentados neste manuscrito são um recurso de ensino eficazes para a correta atribuição comportamental de ratos desafiados. Sete experimentadores foram convidados a assistir ao vídeo de treinamento e ler o protocolo e as tabelas antes de atribuir comportamentos para 60 animais desafiados. A identificação de atribuição de ponto de extremidade humano foi precisa tanto para ratos de FTR-Nonmobile distintivos dos ratos que exibidos os outros comportamentos (Figura 4A) e FTR ratos de ratos que foram capazes de corrigir-se dentro o frame de tempo permitido ( Figura 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig1.jpg"> Figura 1 : Curva de sobrevivência Kaplan-Meier, titulação de dose de chorume cecal e mudança de peso seguindo o desafio de chorume cecal. (A) resultado de sobrevivência de neonatais camundongos C57BL/6J, desafiado com uma injeção intraperitoneal de chorume cecal no DOL 7. Os dados para esta figura foram combinados de experimentos independentes usando o desafio de múltiplas doses, que variam de 0,7 a 1,3 mg de chorume cecal por grama de peso corporal foi administrados a estes ratos. (B) ratos Neonatal desafiados com 0,80 a 0,95 mg de chorume cecal por grama de peso corporal de uma preparação de chorume cecal exibem uma relação dose-dependente entre a quantidade de chorume cecal dada e a porcentagem de sobrevivência. (C) a percentagem de mudança de peso em relação ao peso do desafio, com a linha pontilhada que indicam uma perda de 20% do peso do tempo do desafio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig2.jpg"> Figura 2 : Concentração de UFC no chorume cecal estoque armazenado a-80 ° C não muda ao longo de um período de 6 meses. O efeito da idade do chorume cecal na concentração de UFC foi testado usando a regressão linear. Cada ponto representa uma parte alíquota da mesma preparação de chorume cecal, serialmente diluída e banhado por um período de 6 meses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig3.jpg"> Figura 3 : Categorias de mobilidade dos ratos que deixam de si mesmo e de comportamentos animais em diversos momentos postchallenge no quadril. Ratos que têm sido desafiados com sepse, quando colocado em suas costas, irão exibir sinais de morbidade que pode ser medido pelo grau de movimento do quadril. (A), A falha para a direita (FTR)-rato móvel mostra hip movimento oscilatório de sua coxa superior a 90º de horizontal. (B) An FTR-letárgico mouse quadril mostra movimento de balanço mas não exceda o ângulo de 90 ° da horizontal em qualquer momento durante o 4 s de acompanhamento. (C) alguns FTR-Nonmobile ratos estenderá sua perna, dobra no joelho, mas irão mostrar muito pequeno (menos de ângulos de 10 °) para zero quadril em movimento e as pernas balançando permanecerão paralelo uns aos outros. (D) comportamentos animais h 12-21 postchallenge mostrar que somente a comportamentos FTR-Nonmobile separar sobreviventes do nonsurvivors. (E) de 21 a postchallenge de 48 h, apenas 4 fora os 592 comportamentos FTR observados (0,67%) pertencem aos sobreviventes, permitindo que o endireitamento reflexo para prever o resultado final e ser usado como um novo critério para humano de ponto de extremidade. Postinfection (F), além de 48 h, 6 de 131 ratos (4,55%) que tinham um braço endireitante reflexo passou a integrar o grupo FTR e sacrificaram-se até ao final do experimento, justificando acompanhamento sustentado ao longo do curso de recuperação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58574/58574fig4.jpg"> Figura 4 : Recursos instrucionais conduzir exata classificação comportamental por experimentadores independentes. Experimentadores treinados por assistir o vídeo que acompanha este protocolo Categorizado vídeos de 60 ratos neonatais em grupos diferentes saúde. (A), a capacidade de distinguir um ponto de extremidade humano foi determinada e uma média de 97% dos comportamentos foi com precisão categorizada como FTR-Nonmobile ou não, enquanto apenas 1% dos ratos FTR-Nonmobile foram identificados incorretamente. Dois por cento dos ratos foram falsamente identificados como FTR-Nonmobile. (B) a identificação do ponto de extremidade humana segunda critério de distinguir correctamente entre ratos FTR ou aqueles que têm a capacidade de corrigir-se dentro de 4 s de serem colocados nas costas foi atribuído corretamente em 97% do escore, enquanto única 0,96% dos ratos foram incorretamente atribuído como corrigir-se e 2% dos ratos foram incorretamente atribuído como FTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58574/58574fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Estágio de doença</td>
			<td>R: elevada morbilidade, a mortalidade não</td>
			<td>B: alta morbidade, baixa mortalidade</td>
			<td>C: alta taxa de morbidade, mortalidade elevada</td>
			<td>D: baixa morbidade, baixa mortalidade</td>
		</tr>
<tr>
<td>Horas pós desafio</td>
			<td>0−12</td>
			<td>12−20</td>
			<td>20−48</td>
			<td>&gt; 48</td>
		</tr>
<tr>
<td>Frequência de monitoramento</td>
			<td>desafio de h 2 post</td>
			<td>cada 4−6 h</td>
			<td>Cada 4−6 h, 8 h, durante a noite desacompanhado</td>
			<td>1−2 vezes ao dia, mais se necessário</td>
		</tr>
<tr>
<td>Proporção de pontos de extremidade humanas totais observado</td>
			<td>0/144</td>
			<td>18/144</td>
			<td>116/144</td>
			<td>10/144</td>
		</tr>
<tr>
<td>Percentagem de pontos de extremidade humanos observado</td>
			<td>0%</td>
			<td>12,5%</td>
			<td>80,5%</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Critérios de ponto de extremidade humana</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile em ambos os lados</td>
			<td colspan="2">1. FTR−Nonmobile em ambos os lados</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2. espalhados de ninho e é FTR−Lethargic</td>
			<td colspan="2">2. espalhados de ninho e é FTR−Lethargic</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">3. FTR em ambos lado esquerdo ou direito (com qualquer pontuação de mobilidade)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: frequência dos critérios de ponto de extremidade de monitoramento e humana nas diferentes fases da doença. Frequência de monitoramento, pontos de extremidade humanos observada, a percentagem de pontos de extremidade do humanos e critérios de ponto de extremidade humana durante diferentes estágios da doença de.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reflexo de endireitamento</td>
			<td>Mobilidade</td>
			<td>Limite de tempo para a direita após serem colocados na traseira</td>
			<td>Limite de tempo para medida de quantidade de movimento (móvel / letárgico / nonmobile)</td>
			<td>Critérios de Pontuação de mobilidade</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Direitos</td>
			<td>Móvel</td>
			<td rowspan="6">4 s</td>
			<td rowspan="3">Um adicional de 8 s</td>
			<td>O rato leva várias etapas consecutivas, mantendo o impulso para a frente e explora o seu ambiente. Filhote de cachorro não vai cair.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Letárgico</td>
			<td>O mouse pode dar um passo, mas irá parar e pausar antes de tomar outro. Filhote pode cair.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile</td>
			<td>O mouse não tome quaisquer medidas após corrigir em si. Filhote pode cair.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Falhar para a direita</td>
			<td>Quadris móveis</td>
			<td rowspan="3">O mesmo 4 s usado para medir o braço endireitante reflex</td>
			<td>Tem movimento enérgico de quadril com a perna superior rotativa para além de 90° da horizontal pelo menos uma vez dentro de 4 s.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Quadris letárgicos</td>
			<td>Movimento de quadril até, mas não para além de 90° da horizontal.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nonmobile ancas</td>
			<td>Os membros podem mover-se estendendo e retraindo mas os quadris não rodará. Filhote de cachorro está muito doente.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: tabela e critérios para determinar a pontuação de saúde dos ratos de monitoramento. Os critérios fornecidos foram usados para definir grupos de categorias de saúde aos ratos e para reduzir a variação individual na atribuição de escores de saúde.

Este protocolo fornece as etapas necessárias para estabelecer e avaliar a sepse neonatal em ratos de 7 dias de idade.

Um modelo de Mouse controlado para sepse Neonatal Polymicrobial

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

O modelo de chorume cecal para sepse polimicrobiana é uma poderosa ferramenta para dissecar a fisiopatologia neonatal única. Pode ser variável, e os pontos finais humanos não são bem descritos. Aqui apresentamos nosso procedimento altamente padronizado para preparar um chorume cecal e injetar em animais experimentais.Além disso, usamos uma abordagem baseada em dados para identificar filhotes moribundos o mais cedo possível. Vamos começar preparando um caldo de chorume cecal congelado. Isso é feito agrupando concent cecal de pelo menos cinco ratos adultos, suspendendo em água dextrose estéril, e armazenando a menos 80 para uso posterior.Você pode usar machos ou fêmeas, mas o sexo, idade e fundo de ratos para seus experimentos devem ser mantidos constantes. Primeiro, vamos preparar nossas ferramentas para dissecção. Estes incluem um conjunto de tesouras e fórceps para a pele e um segundo conjunto para os órgãos internos.Ligue o esterilizador de contas quentes pelo menos 30 minutos antes de usar. Mergulhe as ferramentas em 70% de etanol e depois submerse-as no esterilizador de contas quentes por pelo menos um minuto. Pulverize um tapete de toalhas de papel com 70% de etanol e remova as ferramentas do esterilizador sem tocar na parte esterilizada da ferramenta para as alças não estéreis de outras ferramentas.Coloque-os na toalha de papel para esfriar. Dissecar os ratos em um armário de segurança biológica. Fixe as pernas do rato em uma placa de isopor usando agulhas de 23 medidores para que o rato esteja com o abdômen para cima.Pulverize o abdômen com 70% de etanol. Usando fórceps estéreis e tesouras, corte a pele, solte a pele do revestimento peritônio com a tesoura e abra uma região retangular da virilha para o esterno e do lado esquerdo para o lado direito. Remova qualquer pele ao redor do peritônio.Mude para um novo par de ferramentas estéreis para cortar o peritônio, também fazendo uma abertura retangular. Identifique o ceco, que deve estar correndo do lado esquerdo para o lado direito através do corpo. Interrompa o tecido conjuntivo para identificar os ramos ceco dos intestinos e corte o ceco longe dos intestinos.Coloque-o em uma folha esterilizada de papel de pesar. Usando ferramentas estéreis, corte as duas extremidades do ceco. Segure o meio do ceco com fórceps e use uma espátula de metal plana para empurrar suavemente o conteúdo cecal para fora das extremidades usando um movimento de rolamento.Colete o conteúdo e coloque-os em um tubo de centrífuga de 15 mililitros pré-pesado. Teor de cecal da piscina de um máximo de cinco ratos no mesmo tubo. Pesar o tubo novamente uma vez que todo o conteúdo foi adicionado.Para calcular o volume de água dextrose para adicionar ao conteúdo cecal em cada tubo, divida o peso do conteúdo cecal no tubo pela concentração desejada em miligramas por mililitro. Mantenha uma alíquota de água dextrose no gelo para a re-suspensão do conteúdo cecal. Adicione a quantidade necessária de água dextrose ao tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo conteúdo cecal.Vórtice o tubo vertical e horizontalmente por cerca de 30 segundos. Observe para a presença de partículas com mais de alguns milímetros de diâmetro, e se presente, continue o vórtice até que todas as partículas sejam visivelmente desaparecedas. Coloque um tubo de centrífuga de 50 mililitros no gelo para coletar o filtrado e instale um filtro de células estéril de 70 micrômetros por cima.Pipeta quatro mililitros de chorume re-suspenso de um tubo de 15 mililitros sobre o coador de células e para o tubo de coleta. Suspenda as partículas se esticando duas a três vezes. Extrude suavemente bolhas para aumentar a velocidade de filtragem enquanto mexe o conteúdo com a ponta da pipeta até que não haja mais líquido sendo filtrado.Isso deve levar cerca de 30 segundos. Altere os filtros celulares entre cada tubo de chorume cecal, mas cole toda a conteúdo no mesmo tubo de coleta de 50 mililitros. Se o seu estoque exceder 40 mililitros, então o vórtice por 15 segundos, e coloque 20 mililitros em um novo tubo de centrífuga.Divida o chorume em frascos criogênicos de 500 alíquotas de microliter cada. Vórtice o chorume entre cada três frascos. Mantenha o estoque mestre em frascos no gelo.Ao armazenar alíquotas a menos 80, a concentração da unidade de formação da colônia aeróbica em uma preparação de chorume cecal não muda durante um período de seis meses. Agora que o chorume cecal está preparado, podemos usá-lo para desafiar uma ninhada de camundongos de sete a oito dias de idade com uma dose de chorume cecal ajustada de peso. A letalidade do chorume é dependente de dose.Você terá que determinar a dose letal desejada em sua instalação para cada novo estoque com uma nova dose de titulação. Uma alíquota de injeção de chorume cecal é preparada por ninhada. Normalizamos o inóculo para um volume de 100 microlitres, arredondando para os 10 microliters mais próximos para cada animal na ninhada.Preparar a alíquota do desafio requer três cálculos, o volume de caldo necessário, o volume adicional de água de dextrose e o volume arredondado para cada filhote na ninhada. Detalhes sobre como realizar cada cálculo podem ser encontrados na seção três do protocolo. Realizar esses cálculos manualmente para cada experimento pode ser demorado e contribuir para erros experimentais, assim, uma planilha pode ser baixada juntamente com o protocolo onde você insira sua concentração de estoque, dose desejada e peso de sua ninhada, e a quantidade de caldo de chorume, volume de água de dextrose e volume real por filhote é automaticamente devolvida.Você pode imprimir esta folha e levá-la com você quando estiver pronto para desafiar seus animais. Prepare a alíquota de injeção em um armário de segurança biológica e mantenha-a no gelo. Antes de carregar a seringa, misture o tubo de microcentrífuga mexendo 20 vezes.Os filhotes são desafiados com uma seringa de insulina calibre 28. Antes de elaborar a chorume, misture a alíquota inspirando e ejetando de 300 a 500 microliters do desafio aliquot dentro e fora do tubo de microcentrifuuge. Em seguida, elasenhe cerca de 150 microliters da alíquota do desafio.Isso deve ser maior do que o volume de injeção para qualquer filhote de sete a oito dias de idade. Bata na seringa para desalojar bolhas do êmbolo e puxe ligeiramente para trás na seringa para expulsar quaisquer bolhas de ar. Não toque na agulha ou no eixo do êmbolo durante este processo.Dispense o excesso de chorume cecal de volta ao tubo de microcentrifuuge até que a quantidade calculada de chorume cecal para o rato seja carregada na seringa. O chorume cecal é administrado com uma injeção intraperitoneal. Faça isso de acordo com o protocolo em sua instituição de cuidados com animais.Para minimizar os vazamentos, incline o filhote para o rosto para baixo e insira a agulha entre a perna e a genitália, mantendo a agulha rasa e subcutânea. Depois de inserir a agulha cerca de um centímetro, pressione para baixo e para frente até sentir a agulha perfurar o peritônio, em seguida, lentamente deprimir o êmbolo. Retire cuidadosamente a agulha seguindo a mesma rota que você entrou, relaxando seu dedo médio enquanto você faz isso.Observe qualquer vazamento em seu caderno de laboratório e considere omitir animais com vazamentos substanciais do seu resultado final. Nesta seção delinearemos os diferentes níveis de saúde que observamos em camundongos desafiados com sepse polimicrobiana e seu ponto final humano correspondente. Para quaisquer procedimentos envolvendo camundongos neonatais, transferimos o material de cama para uma nova gaiola.Isso transfere o cheiro da dama para suas luvas e reduz o estresse na dama de entrada repetida em sua gaiola. Fazemos um segundo ninho na nova gaiola para segurar os filhotes monitorados até o final do procedimento ou monitoramento quando toda a ninhada estiver pronta para ser devolvida à gaiola da dama. Coloque um mouse em suas costas e monitore para a capacidade de corrigir dentro de quatro segundos.Se puder, espere mais oito segundos para determinar o nível de mobilidade. Um mouse incontestável ou em recuperação é mais frequentemente capaz de corrigir e explorar seu ambiente dando vários passos seguidos. Reagrupar ratos que são capazes de se endisenta e dar alguns passos para explorar seu ambiente como letárgico de direitos.Esses ratos podem cair enquanto derem um passo e olhar trêmulos em seus pés. Um mouse que é incapaz de corrigir e tem movimento do quadril que excede 90 graus da horizontal que agrupamos como falha para o móvel direito. Este mouse eventualmente vai certo, mas não pode dentro de quatro segundos.Por causa de seus movimentos de quadril, ele é agrupado como falha no móvel direito. Filhotes que não conseguiram corrigir e têm movimento do quadril abaixo de 90 graus da horizontal são agrupados como falham na letárgica direita. Este é outro exemplo de um rato cujos quadris não excedem 90 graus da horizontal e é agrupado como falha à direita letárgica.Um filhote não-móvel que não tenha direito terá pernas que podem tremer ou vibrar, mas não têm movimento do quadril. Os membros podem se estender e se retrair, mas não terão movimento lateral. O filhote está visivelmente doente e atingiu o ponto final humano.Este é outro exemplo de um filhote não-móvel de direita. Seus quadris não tremem da esquerda para a direita, mas suas patas vibram. Ao manusear a gaiola da dama, os filhotes podem ser arrastados para fora do ninho se a moça de enfermagem correr.Nós substituímos estes e, em seguida, verificar para outros filhotes espalhados que estão longe de seus companheiros de ninho. Se esses filhotes dispersos não conseguirem a direita letárgica, eles estão em um ponto final humano. Aqui está uma curva de sobrevivência Kaplan-Meier do nosso modelo de sepse.Os pontos de tempo de monitoramento podem ser encontrados no SOP anexado. Em qualquer momento ao longo da curva de sobrevivência se um rato é encontrado como falha ao não-mobilizado, ele está no seu ponto final humano e eutanizado. Entre 12 e 21 horas após o desafio, os ratos parecerão doentes e cerca de metade dos ratos serão capazes de direita de um lado, enquanto a outra metade não consegue acertar em nenhum de seus lados.Este é o prazo em que os camundongos começarão a digress no escore de saúde e alcançarão o ponto final humano de não-mobilidade. São resultados representativos dos escores de saúde observados neste período. Os grupos de sobreviventes e não sobreviventes não podem ser diferenciados neste momento com base em seus escores de saúde.Nesta fase da doença, de 21 a 48 horas após o desafio, observamos a maior proporção de pontos finais humanos. Observamos também que a grande maioria dos camundongos que não conseguem acertar em ambos os lados não acabará se recuperando da doença, o que se torna, portanto, um novo critério para o ponto final humano, além da falta de critérios de não-mobilidade. Os escores observados durante esta fase da doença resultaram na separação de sobreviventes de não sobreviventes.A grande maioria dos camundongos que não conseguiram acertar em ambos os lados não se recuperou da doença. Esses dados sustentam que um novo critério para o ponto final humano a partir de 21 horas após o desafio deve ser eutanásia de quaisquer ratos que não consigam corrigir em ambos os lados. Ao longo de 48 horas após o desafio, muitos ratos começarão a exibir mais atividade e um reflexo melhor de direita.Embora a proporção de pontos finais humanos sejam menores neste período, os camundongos ainda podem divagar e ficar mais doentes, e ainda requerem monitoramento para o ponto final humano. Durante esse período, alguns desses camundongos que foram eventualmente agrupados como não-sobreviventes apresentaram aumento da atividade em um ponto, mas mais tarde fizeram pior e atingiram um ponto final humano. Isso requer o monitoramento contínuo de animais doentes com maior frequência se começarem a apresentar piores desfechos de saúde.Experimentadores independentes que não receberam treinamento presencial e que só observam este vídeo instrutivo foram testados em sua capacidade de atribuir a mesma pontuação que os investigadores usando vídeos de teste gravados. Este vídeo instrutivo resulta em classificação comportamental precisa. A capacidade de atribuir a pontuação correta para não conseguir os camundongos neonatais não móveis, que é uma medida de ponto final humano, foi determinada entre 60 camundongos neonatais, e uma média de 97% dos comportamentos foram precisamente distinguidos, com apenas 3% sendo identificados erroneamente.Em seguida, foi testada a capacidade de diferenciar camundongos neonatais que não conseguiram corrigir ou que foram capazes de acertar em quatro segundos. Esta é outra medida de ponto final humano e foi atribuída com precisão em 97% dos camundongos neonatais, enquanto 3% dos filhotes foram incorretamente atribuídos como direito. Aqui estão os resultados representativos para a variação percentual de peso dos ratos em comparação com o seu tempo de desafio.A mudança média de peso entre sobreviventes e não-sobreviventes começou a se separar em 24 horas após o desafio, mas há muita sobreposição entre os grupos. Houve alguns sobreviventes que perderam mais de 20% de peso, mas ainda se recuperaram da doença. A mudança de peso não foi tão eficiente na previsão do desfecho em comparação com as diferenças nos escores de saúde e é por isso que não é usada como critério para determinar se os camundongos estão em um ponto final humano.Para concluir, agora você deve ser capaz de preparar um estoque de chorume cecal congelado, calcular a dose ajustada de peso. E injetar e monitorar camundongos recém-nascidos para pontos finais humanos. Esperamos que este seja um recurso valioso para sua pesquisa de mouse.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Fonte: Seman, B. G., et al. Um modelo de imagem neonatal para sepse bacteriana gram-negativa. J. Vis. Exp. (2020)O vídeo demonstra um modelo neonatal de camundongo para estudar infecção sistêmica usando bactérias bioluminescentes encapsuladas. Filhotes neonatais são injetados com suspensões bacterianas de alta ou baixa dose e retornados à mãe para cuidados pós-natais. As bactérias encapsuladas escapam da detecção imune precoce, se espalham sistêmicamente e são visualizadas ao longo do tempo por...

Modelagem da Infecção em Camundongos Neonatais Usando Bactérias Bioluminescentes Encapsuladas

Aqui, é descrito um procedimento para o estabelecimento de uma infecção sistémica no rato neonatal com culturas de Escherichia coli K1. Este procedimento não-invasivo permite a colonização do tracto gastrointestinal, a translocação do agente patogénico para a circulação sistémica, e invasão do sistema nervoso central no plexo coróide.

Modelo não-invasiva da neuropatogênicos Escherichia coli Infecção no Rato Neonatal

Este artigo descreve um método para gerar uma lesão por compressão da medula espinhal (LM) reprodutível no camundongo neonatal. O modelo fornece uma plataforma vantajosa para estudar os mecanismos de plasticidade adaptativa subjacentes à recuperação funcional espontânea.

A Neonatal do rato Spinal Cord Injury Compression Modelo

Este estudo detalha o processo de quantidades precisas de gavaging de probióticos para camundongos neonatais. A montagem experimental foi otimizada para incluir, mas não está limitada ao probiótico dosagem, métodos de administração e quantificação de bactérias no intestino.

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Desenvolvemos um modelo de coioamnionite para simular a exposição fetal à inflamação materna (FEMI) sem complicações de organismos vivos para examinar os efeitos do FEMI no desenvolvimento do trato intestinal da prole. Isso permite o estudo de causas mecanicistas para o desenvolvimento de lesões intestinais após a coioamnionite.

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A infecção de camundongos neonatais com bioluminescente E. coli O1:K1:H7 resulta em uma infecção séptica com inflamação pulmonar significativa e patologia pulmonar. Aqui, descrevemos procedimentos para modelar e estudar mais a sepse neonatal utilizando imagens intravitais longitudinais em paralelo com a enumeração de cargas bacterianas sistêmicas, perfil inflamatório e histopatologia pulmonar.

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O parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) é um problema de saúde global urgente com opções de prevenção e tratamento abaixo do ideal. Apresentamos um modelo de camundongo de parto prematuro induzido por infecção bacteriana vaginal ascendente e descrevemos como analisar a morbidade e mortalidade neonatal resultante.

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Este protocolo descreve um modelo de camundongo neonatal de enterocolite necrosante (NEC) e subsequente isolamento de células imunes da lâmina própria do intestino delgado murino neonatal.

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