Name: Baseada em célula de ensaio para estudar mediada por anticorpos Tau afastamento por Microglia (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Aprenda um ensaio baseado em células para quantificar a captação mediada por anticorpos da proteína Tau por microglia BV-2. Este método auxilia na caracterização de mecanismos de ação de anticorpos anti-Tau para pesquisa em Alzheimer.

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Gostaríamos de agradecer sua valiosa assistência técnica Alberto Carpinteiro Soares.

1. BV-2 células cultura
Nota: Punho BV-2 células sob contenção de biossegurança nível 2. A linha de celular BV-2 produz um envelopado ecotropic recombinante retrovírus (capaz de infectar células murino apenas)12; esses vírus são conhecidos por suas em vitro transformando habilidade e na vivo potencial tumorigênico.
<ol><li>BV-2 células de cultura em alta glicose Dulbecco modificado eagle suplementado (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 penicilina U/mL, 100 µ g/mL Estreptomicina e 2 mM L-glutamina (referido como o meio de cultivo, de agora em diante) por semeadura de células em 4 x 104 células/mL.</li>
	<li>Manter as culturas em um ambiente umidificado de 5% CO2 a 37 ° C. Nota: as células crescem e vagamente anexado em suspensão.</li>
</ol>2. etiqueta recombinante Tau agregados com corante fluorescente sensíveis ao pH
Nota: Agregados de Tau foram preparados conforme descrito em Apetri et al . 13 , com a diferença que não T Thioflavin (ThT) foi adicionado para o buffer de reação. Agregadas as amostras foram coletadas em tubos de centrífuga de 1,5 mL. Sinal de fluorescência final foi verificada através da mistura de 118 µ l da amostra piscina com 12 µ l de uma solução de ThT 50 µM. Agregados foram separados por centrifugação a mistura de reação de agregação a 20.000 x g durante 1 h a 4 ° C. O sobrenadante foi analisado pela SEC-MALS para confirmar que todos o tau monomérico foi convertido em agregados. Pelotas (agregados de tau) foram snap congelado e armazenado em um freezer a-80 ° C.
<ol><li>Resuspenda agregados tau em 0.1 M tampão de bicarbonato de sódio (NaHCO3) em pH 8,5 a uma concentração de 1 mg/mL (~ 20 µM). Nota: Concentração de agregados de tau baseia-se na concentração inicial de monômeros, avaliadas pela absorção de monômeros de tau em 280 nm, utilizando um coeficiente de extinção de 0,31 mLmg-1cm-1.</li>
	<li>Proceda à sonicação os ressuspensão agregados usando um sonicador de sonda, mantendo-se no gelo para evitar superaquecimento.<ol>
<li>Use uma amplitude de 65% (com sonicador de potência 250 W).</li>
		<li>Executar 8 pulsos de 3 s com pausas de 15 s entre pulsos para evitar o sobreaquecimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare uma solução stock de 8,9 mM de corante sensíveis ao pH (doravante referência como a tintura de pH) em dimetilsulfóxido (DMSO), seguindo as instruções do fabricante. Nota: Sempre preparar uma solução fresca e usá-lo só no dia que é preparado.</li>
	<li>Adicione 10 moles de corante por mol de proteína para uma concentração final de tintura de 0,2 mM.</li>
	<li>Misture suavemente pipetando acima e para baixo.</li>
	<li>Incube a mistura de reação para 45 – 60 min à temperatura ambiente, protegida da luz.</li>
	<li>Entretanto, monte um gel reticulado dextrano dessalinização coluna seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Equilibrar a coluna com 25 mL de 0.1 M NaHCO3 tampão pH 8,5 contendo 3% DMSO. Descarte a fluir.</li>
	<li>Adicione o produto do agregado tau rotulagem reação à coluna em um volume total de 2,5 mL. Se a amostra for inferior a 2,5 mL, adicione tampão até um volume total de 2,5 mL é alcançado.</li>
	<li>Deixe a amostra Introduza o gel embalado completamente, descarte o escoamento.</li>
	<li>Eluir com 3,5 mL de 0.1 M NaHCO3 tampão pH 8,5 contendo 3% DMSO e recolher o eluato em 4 fracções equivalentes em tubos de 2 mL.</li>
	<li>Determine as concentrações de proteína das 4 frações por meio de ensaio de (BCA) ácido bicinchoninic.</li>
	<li>Armazene a proteína rotulada em um congelador-20 ° C.</li>
</ol>3. absorção ensaio com fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação de leitura
<ol><li>
Dia 1 – semente as células
	<ol>
<li>Lavagem BV-2 células no frasco, removendo o cultivo médio e adicionando 1x tampão fosfato salino (PBS). Nota: Volume de lavagem pode variar com base no tamanho do balão celular usado. Por exemplo, para um frasco de T175, lave com 10 mL de 1X PBS.</li>
		<li>Retire o balão de PBS e destacar células incubando com tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) o ácido 0,05% a 37 ° C e 5% de CO2 , até que as células se desapegar do frasco (aproximadamente 5 min). Nota: O Volume do trypsin-EDTA 0,05% depende do tamanho do balão celular usado. Por exemplo, para um frasco de T175, use 2 mL de tripsina-EDTA 0,05%.</li>
		<li>Ressuspender as células em cultivo médio pipetando subir e descer três a cinco vezes. Nota: Volume de meio de cultivo varia de acordo com o tamanho do balão celular usado e, portanto, o número total de células no frasco. Por exemplo, para um frasco de T175, use 8 mL de meio de cultivo.</li>
		<li>Contar as células e criar uma suspensão de células com uma concentração final de 1 x 105 células/mL em meio de cultura contendo 200 heparina μg/mL.</li>
		<li>Placa de 250 µ l de suspensão de células (2,5 x 104 células) por bem em um prato fundo plano de cultura de tecidos de 96 poços.</li>
		<li>Incube a placa durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 1 – preparar imunocomplexos
	<ol>
<li>Descongele o pH tintura-tau no gelo.</li>
		<li>Prepare-se 65 μl por condição de solução de pH 500 nM agregados de corante-tau em meio livre de soro (SFM) (glicose alta DMEM suplementado com 100 de U/mL penicilina, estreptomicina 100 de µ g/mL e 200 µ g/mL de heparina).</li>
		<li>Prepare diluições de anticorpo em 65 µ l de SFM e numa concentração dobro aquele final. Mix pH tintura-tau agregados e anticorpos em uma placa de 96 poços u-inferior. Volume final por condição agora é 130 µ l e a concentração de agregados de corante-tau de pH é de 250 nM. A placa de diluição do selo e incubar durante a noite a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 2 – captação de imunocomplexos
	<ol>
<li>Remova o meio de cultivo do BV-2 células. Lave as células uma vez com 100 µ l temperatura 1X PBS.</li>
		<li>Transferência de 125 µ l de imunocomplexos às células usando uma pipeta multicanal. Incube as células com os imunocomplexos por 2 h a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
		<li>Remover o meio de incubação das células e descartá-lo. Lave as células uma vez com 100 µ l temperatura 1X PBS.</li>
		<li>Remover 1X PBS e tratar as células com 50 µ l do trypsin-EDTA 0,25% por 20 min a 37 ° C e 5% CO2.
</li>
		<li>Adicionar 200 µ l de meio de cultivo e ressuspender bem pipetando acima e para baixo para destacar as células. Transferência de células para um fundo U 96 poços placa. Placa de centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Colocar a placa no gelo, remover o cultivo de células médias e lavar duas vezes por resuspending as pelotas de célula em 150 µ l gelo frio 1X PBS. Placa de centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Coloque as células no gelo, remover adicionado 1X PBS e lave-os por resuspending células pelotas em 150 µ l FACS buffer a frio (1X PBS, 0,5% albumina de soro bovino (BSA), 2 mM EDTA). Placa de centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>Coloque as células no gelo, retire o tampão de FACS adicionado e ressuspender as células em buffer a µ l 200 FACS frio.</li>
		<li>Analisar as amostras imediatamente pela FACS adquirindo 2 x 104 eventos no portão de células vivas (ver passo 4.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. FACS análise
Nota: Consulte a Figura 1 para a estratégia associada.
<ol><li>Usando a área de dispersão para a frente (FSC-A) versus lado área (SSC-A) densidade de dispersão, portão em células vivas, excluindo eventos com níveis inferiores de dispersão para a frente (i.e., detritos e células mortas).</li>
	<li>No seio da população de células vivas, usar FSC-A contra a altura de dispersão para a frente (FSC-H) para excluir parelhas de célula e agregados. Este é o portão de singlet.</li>
	<li>Usando os eventos no portão singlet, gere um histograma de único parâmetro de tintura de pH.</li>
	<li>Determine a intensidade média de fluorescência. Determine a porcentagem de células positivas de pH tintura-tau, excluindo células negativas como determinado usando o único controle de BV-2.</li>
</ol>5. imunocomplexos captação com microscopia de leitura
<ol><li>
Dia 1 – semente as células
	<ol>
<li>Prepare células BV-2, conforme descrito nas etapas 3.1.1, 3.1.2 e 3.1.3.</li>
		<li>Contar as células e ressuspendê-los no cultivo médio para uma concentração final de 104 células/mL.</li>
		<li>150 µ l de suspensão de células da placa (1,5 x 103) por bem em uma poli-D-lisina revestido chapa preta 96 poços com fundo plano claro.</li>
		<li>Incube a placa a 37 ° C e 5% CO2 por 48 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 3 – preparar imunocomplexos Nota: Sonication leve de agregados de tau rotulados antes da incubação com anticorpo, foi realizada para melhorar os resultados da microscopia.<ol>
<li>Descongelar o pH tintura-tau no gelo e proceda à sonicação usando um sonicador de sonda, mantendo-se no gelo. Use uma amplitude de 15% (poder sonicador de 250 W). Executar 30 pulsos de 2 s e espere 20 s entre pulsos.</li>
		<li>Prepare-se 65 μl por condições da solução 500 nM de agregados de corante-tau pH na SFM.</li>
		<li>Dilua a anticorpos em 65 µ l de SFM a uma concentração dobro aquele final. Mix pH tintura-tau agregados e anticorpos em uma placa de 96 poços u-inferior. Volume final por condição agora é 130 µ l e a concentração de agregados de corante-tau de pH é de 250 nM. A placa de diluição do selo e incubar durante a noite a 37 ° C.</li>
		<li>Remova o médio da célula placa e substituir com 150 µ l de meio de cultivo complementado com 200 heparina µ g/mL. Incube a placa durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dia 4 – captação de imunocomplexos
	<ol>
<li>Remova as células BV-2 cultivo médio. Transferência de 125 µ l de imunocomplexos às células usando uma pipeta multicanal.</li>
		<li>Incube as células com os imunocomplexos por 1 h e 45 min a 37 ° C com 5% de CO2. Mancha com tintura específica de DNA do núcleo de células e organelas ácidas com uma sonda que seletivamente manchas compartimentos celulares de baixo pH. Incube as células 15 min a 37 ° C com 5% de CO2. Nota: Dilua as tintas na SFM.</li>
		<li>Execute a viver-pilha de imagem usando um alto teor confocal sistema de triagem. Definir a temperatura de 37 ° C e 5% de CO2. Para imagens de alta qualidade, use um objectivo de imersão de água X 63 e adquirir aviões de 0,5 µm (20 por Z-pilha) por campo de imagem.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Micróglia, células imunes do cérebro residente, foram recentemente identificados como importantes players em abordagens terapêuticas mediada por anticorpos para Tauopatias10,11. Apuramento de tau mediada por anticorpos por microglia, juntamente com o bloqueio da captação neuronal9, inibição ou desestabilização da fibrila formação13,14 e apuramento das fibrilas intraneuronal através de depósito lisossômico via15, tudo pode contribuir para a eficácia do anticorpo anti-tau observada no modelo do rato do Taupatia5,6,7,8,9.
Descrevemos aqui um ensaio baseado em pilha para avaliar quantitativamente a absorção de tau por microglia com o objectivo de criar uma ferramenta experimental para melhor caracterizar os mecanismos de ação dos anticorpos anti-tau.
Neste ensaio, adaptado de Funk et al 11, utiliza células BV-2, que são as células microglial murino imortalizado. Enquanto eles totalmente não podem ser comparados às pilhas microglial primária, eles apresentam muitas das características da microglia primário, incluindo a capacidade de robustamente fagocitam tanto Aβ e tau fibrilas11,16,17 ,18,19. Além disso, eles mostraram um comportamento reprodutível em vitro que as tornava altamente adequado para desenvolvimento de ensaio e estudos quantitativos, que requerem mínima variabilidade experimental. Além disso, linhas celulares imortalizado permitem maior rendimento de ensaio e eliminam a necessidade de sacrifício de animais em comparação com o uso de primário microglia.
Os agregados de tau que usamos neste ensaio foram obtidos utilizando o procedimento agregação altamente reprodutível em vitro que descrevemos recentemente13e mostrar a morfologia semelhante ao emparelhado filamentos helicoidais (resfrie) isolados do cérebro de AD pacientes. Enquanto nós não observaram qualquer resultado inesperado que pode ter sido causado por tau agregados da aderência às superfícies de plástico ou vidro, o uso de agregados de tau estável e bem caracterizadas desempenhou um papel crucial na reprodutibilidade neste ensaio.
Outro aspecto que contribuiu significativamente para ensaio de reprodutibilidade foi densidade celular. Os números de células por bem descrito no protocolo representam a densidade celular ideal nas condições descritas.
Diferentemente do que o Funk et al 11 descritos, que rotulado agregados tau com um corante sensível pH que aumenta significativamente sua fluorescência após internalização em organelas ácidas, assim permitindo a quantificação intracelular. Isto, juntamente com a digestão do trypsin de superfície limite imunocomplexos e/ou tau, garantias aquele sinal de fluorescência medida por citometria de fluxo é o resultado da absorção de tau, ao invés de vinculação à superfície celular. Além disso, o uso de um facilita de corante sensível pH deteção dos agregados de tau interiorizado em experimentos de microscopia sem a necessidade de digerir a superfície limite agregados de imunocomplexos/tau que teria então requer célula re-chapeamento e recuperação.
Nós também ainda mais otimizado a leitura de microscopia de nosso ensaio, em comparação com o que já havia sido descrito11, usando um corante altamente seletivo para organelas ácidas em nossos experimentos de microscopia que nos permitiram não só para confirmar anticorpo mediada captação de Tau, mas também a localização dos agregados de tau no compartimento endolysosomal.
O ensaio que desenvolvemos, tem especificidade ideal que resulta em uma boa janela experimental, permitindo uma separação forte entre amostras positivas e negativas. Curiosamente, o ensaio indiretamente detecta diferenças em afinidade de anticorpo, representando assim uma poderosa ferramenta para estudar as funções efetoras do anticorpo anti-tau.

A doença de Alzheimer (AD) é uma condição neurodegenerativa progressiva caracterizada pela mudança conformacional e auto-montagem de proteína tau e peptídeo β amiloide em agregados patológicos. O peptídeo β amiloide solúvel normal é convertido em β amiloide oligoméricas e fibrillar, enquanto anormalmente fosforilada tau acumula como oligômeros e tangles neurofibrillary1,2. Estes agregados de proteína causam morte neuronal levando a perda de memória e declínio cognitivo progressivo subsequente. Outros fatores, incluindo não-produtivos neuroinflammation e uma redução da capacidade para limpar misfolded proteínas, podem exacerbar e acelerar a doença. Atualmente, as estratégias de intervenção contra AD fornecem alívio sintomático em grande parte, mas não há doença cura ou prevenção.
Aumentando a evidência sugere um papel-chave dos agregados de hyperphosphorylated tau na patologia do anúncio. Em seu estado não-patológica, tau é uma proteína nativamente desdobrada que vincula a microtúbulos e promove seu assembly para o citoesqueleto neuronal. Quando tau torna-se hyperphosphorylated, que separa o citoesqueleto e aglomerados em agregados de tau no neurônio, que são acreditados para causar a maioria da patologia associada com AD3. Agregados tau começa a acumular primeiro intracelular, mas como a doença progride, supõe-se para ser liberado de neurônios afetados para o espaço extracelular, do qual ele pode ser tomado até pelos neurônios saudáveis adjacentes ou synaptically conectados em um " príon-como forma". Uma vez internalizada, a agregação de tau induz mais tau agregação através de mudança conformacional modelo4.
De acordo com esta hipótese, terapias capazes de interromper a semeadura de tau podem retardar ou reverter o curso da doença neurodegenerativa mediada por tau. Para apoiar isso, ratos suscetíveis a Taupatia por mutação genética e passivamente injetado com anticorpos anti-tau mostram reduzida tau patologia e melhoria da função cognitiva5,6,7,8 ,9. No entanto, os mecanismos pelos quais os anticorpos terapêuticos reduzem patologia permanecem indescritíveis.
Um dos mecanismos propostos é mediada por anticorpos de captação e afastamento de patológicos formas agregadas de tau pela micróglia, células do sistema imunológico residente do cérebro. Publicações recentes sugerem que microglia pode eficientemente internalizar e degradar espécies patológicas tau e esta capacidade é reforçada por anticorpos anti-tau através um Fc-dependente mecanismo envolvendo receptores Fc expressados na superfície de microglia e receptor mediada por fagocitose10,11. Estes dados identificam microglia como potencialmente importantes efetores de anticorpos terapêuticos.
Descrevemos aqui um ensaio baseado em pilha para avaliar quantitativamente a absorção de tau por microglia. Dados gerados com este ensaio podem ajudar a elucidar os mecanismos de ação dos anticorpos anti-tau, representando assim uma ferramenta útil para avançar os anticorpos anti-tau para novas etapas de seu desenvolvimento como potencial tratamento AD.

<table><tbody><tr><td>Coleção de linha celular interlab ICLC</td> de células <td>BV-2</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x)</td> <td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,05%</td> <td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 4,5 g / dL glicose</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Gibco</td><td>10091-148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>EasYFlask</td><td>Nunc</td><td>156499 / 159910</td><td></td></tr><tr><td>pHrodo Green STP éster</td><td>Life Technologies</td><td>P35369&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de Sódio pH 8.5 100 mM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ml</td><td></td></tr><tr><td>PD10 colunas</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&nbsp; placas de cultura multipoços</td><td>Greiner</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas de Ensaio de 96 Poços</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H3393-50KU</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,25%</td> <td>Sigma</td><td>T4049-100ml</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH8</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Solução (20 mM)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Vermelho Profundo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L12492</td><td></td></tr><tr><td>Ópera Phenix</td><td>Perkin Helmer</td><td>HH14000000</td><td></td></tr></tbody></table>

baseada em célula de ensaio para estudar mediada por anticorpos tau afastamento por microglia

Cell-based Assay to Study Antibody-mediated Tau Clearance by Microglia

A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa progressiva em que agregados tau e proteínas amiloides se acumulam no cérebro causando disfunção neuronal que eventualmente leva ao declínio cognitivo. Agregados de Hyperphosphorylated tau no neurônio são acreditados para causar a maioria da patologia associada com AD. Estes agregados são supor para ser lançado para o compartimento extracelular e retomados pelos neurônios saudáveis adjacentes onde eles mais induzem agregação de tau. Este "príon-como" espalhando pode ser interrompido por anticorpos capazes de vinculação e "neutralização" agregados extracelulares tau como mostrado em modelos pré-clínicos rato de AD. Um dos mecanismos propostos pelos quais anticorpos terapêuticos reduzem patologia é mediada por anticorpos de captação e apuramento das formas agregadas patológicas de tau por microglia. Aqui, descrevemos um ensaio quantitativo baseado em pilha para avaliar a absorção de tau por microglia. Este ensaio utiliza a linha de celular do rato microglial BV-2, permite alta especificidade, baixa variabilidade e taxa de transferência média. Dados gerados com este ensaio podem contribuir para uma melhor caracterização das funções efetoras de anticorpo anti-tau.

Tau recombinante agregado covalentemente foi rotulado com um corante verde sensíveis ao pH. Esta tintura aumenta drasticamente sua fluorescência após sua internalização em organelas ácidas, desse modo permitindo a quantificação intracelular. Tau rotulado agregados foram incubados com anticorpos monoclonais de anti-tau. Em particular, usamos uma versão Quimérico (região de rato IgG1 Fc) de CBTAU-28.1. Este anticorpo humano vincula-se à região de inserção do N-terminal de tau e é capaz de ligar em vitro gerado tau fibrilas.13. Neste ensaio, testamos também uma versão melhorada de afinidade do CBTAU-28.1 – dmCBTAU-28.1. Fragmentos fabulosos de CBTAU-28.1, o mutante parental e alta afinidade de formato e um rato IgG1 isotipo controle foram usados como controles.
BV-2 células foram incubadas com os pré-formado imunocomplexos ou agregados sozinha por duas horas na presença de heparina para bloquear a absorção de anticorpo independente tau tau. Após a incubação, as células foram trypsinized para remover o tau limitado à membrana extracelular e foram analisadas para a absorção de tau por citometria de fluxo. Como recentemente descrevemos13, observamos que captação de variantes promovidas CBTAU-28.1 da tau em BV-2 células de forma dose-dependente. A captação foi Fc mediada desde fragmentos Fab CBTAU-28.1 não aumentar a absorção de tau basal (Figura 2). Além disso, o anticorpo dmCBTAU-28.1 de alta afinidade mediada captação tau em BV-2 células em maior medida do que o selvagem-tipo de anticorpo (Figura 2).
Absorção mediada por anticorpos tau e localização dos agregados de tau no compartimento do endolysosomal foi confirmada pela microscopia confocal (Figura 3), onde o compartimento celular ácido foi manchado usando uma sonda seletiva para organelas de baixo pH. Intracelular partitura de corante verde pH rotulado tau agregados foram observados no interior das células que foram incubadas com CBTAU-28.1. Além disso, agregados intracelular tau colocalized muitas vezes com o baixo pH compartimento seletiva corante vermelho assim, sugerindo a presença de agregados de tau nas organelas ácidas. Fragmentos Fab CBTAU-28.1 não aumentar a absorção de tau novamente indicando um mecanismo de internalização mediada por receptores Fc (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig1.jpg"> Figura 1: estratégia utilizada na análise de citometria de fluxo para detectar a internalização de tau por BV-2 células de Gating. Dados de controle único de BV-2 (A-C), do isotipo controle (D-F) e dmCBTAU-28.1 da amostra (G-eu) são mostrados. População celular BV-2 foi fechada em um terreno de SSC-A densidade do FSC-A vs excluindo resíduos e células mortas (A, D, G). BV-2 células foram então mais fechadas em um terreno de densidade vs FSC-A FSC-H para excluir parelhas de célula e agregados (B, E, H). Única célula portal foi usado para gerar um histograma de único parâmetro de tintura (FITC nestes resultados representativos) pH (C, F, eu) e determinar a intensidade de fluorescência de média geométrica. Alternativamente, a percentagem de células positivas de corante-tau de pH foi calculada excluindo células negativas conforme determinado usando controle único BV-2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig2.jpg"> Figura 2: CBTAU-28.1 Medeia a absorção dos agregados de tau em pilhas microglial BV-2. Tau recombinante agregado covalentemente foi rotulado com tintura de fluorescência verde sensíveis ao pH e incubada com uma mouse versão quimérico do anticorpo anti-tau humano CBTAU-28.1, seu formato maior afinidade, dmCBTAU-28.1, o correspondente Fab fragmentos, um rato IgG1 isotipo controle anticorpo ou nenhum anticorpo (agregados de tau sozinhos). Imunocomplexos posteriormente foram incubados com células BV-2 por duas horas na presença de heparina para bloquear a absorção de tau independente de anticorpo. Absorção de imunocomplexos foi avaliada por citometria de fluxo e expressa como a média geométrica (GM) de intensidade de fluorescência (A) ou a percentagem de positivas do tau (tau +), células (B). Barras de erro em (A) indicam o desvio padrão dos dois experimentos independentes, enquanto (B) mostra um único experimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58576/58576fig3.jpg"> Figura 3: Tau agregados são internalizados pelo BV-2 células e localizar o celulares organelas ácidas. Pré-formadas tau-anticorpo imunocomplexos foram incubados com células BV-2 por duas horas na presença de heparina para bloquear a absorção de anticorpo independente. Após a incubação, os núcleos foram corados com um corante azul específico de DNA e o compartimento celular ácido com um corante vermelho seletiva do compartimento de baixo pH. Imagem latente da viver-pilha revelou partitura intracelular de agregados de tau rotulado (verdes) no interior das células que foram incubados com 28,1-CBTAU e dmCBTAU-28.1, mas não com do isotipo controle. Além disso, agregados intracelular tau colocalized muitas vezes com o vermelho corante (amarelos), portanto, sugerindo a presença de agregados de tau no compartimento celular do ácido. Fragmentos Fab CBTAU-28.1 não aumentar a absorção de tau, indicando um mecanismo de internalização mediada por receptores Fc. Imagens representam projeções de intensidade máxima de um 20 aviões Z-pilha (planos de 0,5 µm) adquiridas com um objectivo de imersão de água X 63. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58576/58576fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui nós descrevemos um baseada em célula de ensaio para avaliar quantitativamente a absorção de tau por microglia com o objectivo de criar uma ferramenta experimental para melhor caracterizar os mecanismos de ação dos anticorpos anti-tau.

Baseada em célula de ensaio para estudar mediada por anticorpos Tau afastamento por Microglia

Alzheimer&#39;s disease (AD) is a progressive neurodegenerative condition in which aggregated tau and amyloid proteins accumulate in the brain causing ...

Um dos mecanismos propostos pelos quais os anticorpos terapêuticos anti-Tau reduzem a patologia na doença de Alzheimer é a absorção no despejo do antigo Tau agregado patológico pela microglia. Aqui, apresentamos o ensaio da base celular para avaliar a absorção de Tau por microglia. Este ensaio representa uma ferramenta investigativa útil para caracterizar melhor o mecanismo de ação dos anticorpos anti-Tau.No primeiro dia do experimento, prepare as células BV-2 lavando-as primeiro com 1x PBS no frasco em que foram cultivadas. Em seguida, incuba-os com 05% de trippsina EDTA a 37 graus Celsius e 5%C02 até que eles se desprendem do frasco. Suspenda as células em meio de cultura, subindo e descendo três a cinco vezes.Conte células e prepare uma suspensão celular com uma concentração final de 100.000 células por mililitro em meio de cultura contendo 200 microgramas por mililitro heparina. Adicione 250 microliters desta suspensão celular por poço em uma placa de fundo plana de cultura de tecido de 96 poços. Incubar a placa a 37 graus Celsius com 5%C02, durante a noite.Depois de descongelar agregados de pH dye-Tau previamente preparados no gelo, dilui-os em 65 microliters por condição de meio livre de soro, para fazer uma solução de 500 nanomolar. Anticorpos diluídos em 65 microliters de meio livre de soro para alcançar o dobro da concentração desejada. Misture agregados e anticorpos pH dye-Tau em uma placa de fundo U de 96 bem.Sele esta placa de diluição e incuba durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte remova o meio da placa 96 com células BV-2. Lave as células em cada poço com 100 microliters de temperatura ambiente 1x PBS.Remova o PBS da placa da célula BV-2. Use uma pipeta multicanal para transferir 125 microliters de complexos amino da placa de diluição para cada poço de uma placa celular BV-2 de 96 poços, e incubar por duas horas a 37 graus Celsius com 5%de CO2. Após a incubação, remova os complexos de amino das células e lave as células em cada poço com 100 microliters de temperatura ambiente 1x PBS.Depois de remover o PBS 1x adicione 50 microlitadores de 25% de trippsina EDTA e incubar por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5%de CO2. Depois disso, adicione 200 microliters de meio de cultivo e suspenda o poço por tubulação para cima e para baixo para desacoplar as células. Transfira as células para uma placa de fundo U de 96 poços e centrífugas a 400 x g por 5 minutos a 4 graus Celsius.Coloque a placa no gelo e retire o meio. Adicione 150 microliters de gelo frio 1x PBS e centrífuga novamente a 400 g por 5 minutos a 4 graus Celsius. Coloque a placa no gelo e lave novamente removendo previamente adicionado 1x PBS e adicionando 150 microliters de PBS gelado por poço.Centrífuga novamente sob as mesmas condições. Coloque a placa no gelo e lave as células removendo o PBS adicionado anteriormente e adicionando 150 microliters TAMPÃO FACS por poço. Centrífuga novamente a 400 g por 5 minutos a 4 graus Celsius.Coloque a placa no gelo e remova o buffer FACS adicionado anteriormente e suspenda as células em 200 microliters TAMPão FACS por poço. Imediatamente proceder à análise pela FACS para adquirir 20.000 eventos no portão da cela ao vivo. Para análise FACS use a área de dispersão dianteira ou área de dispersão lateral ou área de dispersão lateral ou inclinação de densidade SSCA para portão em células vivas, excluindo eventos com níveis de dispersão para a frente mais baixos, como detritos e células mortas.Em seguida, dentro da população de células vivas use FSCA versus altura de dispersão para a frente ou FSCH para criar um portão singlet e excluir duplos e agregados de células. Em seguida, use os eventos no portão singlet para gerar um histograma de um parâmetro único de corante pH. Use o histograma gerado para primeiro determinar a intensidade média da fluorescência.Depois disso, determinamos a porcentagem de células positivas de pH dye-Tau, excluindo células negativas como determinado usando o único controle do BV-2. Os anticorpos CBTau-28.1 promovem uma absorção de Tau em células BV-2 de forma dependente, como mostrado pela citometria de fluxo. O duplo mutante cbtau-28.1 anticorpos mediados tau absorção nas células BV-2 em maior grau do que o anticorpo tipo selvagem.Os fragmentos de FAB CBTau-28.1 não aumentaram a absorção basal de Tau indicando um mecanismo de internalização mediada pelo receptor FC. A microscopia confocal confirmou o aumento mediado de anticorpos da absorção de Tau. Corante de pH verde rotulado tau agregados muitas vezes co-localizados com cortiça vermelha lysotracker manchada organelas ácidas, sugerindo assim a presença de agregados tau em um compartimento endolísomal.CBTau-28.1 Os fragmentos fab não aumentaram novamente a absorção de Tau indicando que a captação foi de fato mediada pelo FC. O ensaio que acabamos de descrever nos permite quantificar especificamente a absorção de anticorpos mediados por microglia. Os dados gerados com este ensaio podem ajudar a elucidar o mecanismo de ação dos anticorpos anti-Tau, representando assim uma ferramenta útil para avançar os anticorpos anti-Tau para avançar em seu desenvolvimento como potencial tratamento da DA.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Microglia residem macrófagos que fornecem a primeira linha de defesa e vigilância imune do sistema nervoso central. MicroRNAs são moléculas reguladoras, que desempenham um papel importante em muitos processos fisiológicos, incluindo a activação e diferenciação dos macrófagos. Neste artigo, descrevemos o método para a medição de microRNAs em microglia.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

Este vídeo mostra um ensaio baseado em células quantificando a captação de Tau pela microglia murina usando agregados de Tau marcados com fluorescência sensíveis ao pH, analisados por meio de classificação de células ativadas por fluorescência para uma avaliação quantitativa.

Um ensaio baseado em células para avaliar a captação da proteína tau pela microglia

Uma chave para o sucesso na investigação de biologia da microglia é a preservação do immunofunction microglial ex vivo durante o isolamento a partir de tecido do SNC. Isolando microglia através de resultados de agitação rotativos em culturas de células altamente puras e imuno avaliado pela imagem fluorescente, imunocitoquímica e ELISA após a ativação da microglia com o lipopolissacarídeo estímulos pró-inflamatória (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

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Correlativa Luz e Microscopia Eletrônica para estudar interações Microglial com placas de beta-amilóide

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Imunofluorescência Manchausando IBA1 e TMEM119 para densidade microglial, morfologia e análise periférica de infiltração de células mieloides no cérebro do rato

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Quantificação do engolfamento microglial de material sináptico usando citometria de fluxo

Aprenda um ensaio baseado em células para quantificar a captação mediada por anticorpos da proteína Tau por microglia BV-2. Este método auxilia na caracterização de mecanismos de ação de anticorpos anti-Tau para pesquisa em Alzheimer.

Baseada em célula de ensaio para estudar mediada por anticorpos Tau afastamento por Microglia

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