Name: Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a purificar cloroplastos intactos de Arabidopsis e separar seus subcompartimentos: envelope, estroma e tilacoides. Este método combina centrifugação diferencial e gradientes de Percoll e sacarose para estudos de localização proteica.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa de doutoramento conjunta ao IB do INRA planta biologia e divisão de criação e do Labex GRAL (ANR-10-LABX-49-01). Também gostaríamos de reconhecer o projeto ANR ANR-15-IDEX-02, Dr. Olivier Vallon (IBPC Paris) para detecção de anticorpos contra LHCP e Dr. Renaud Dumas (LPCV, Grenoble) para detecção de anticorpos contra KARI.

1. preparação de Buffers, soluções estoque e gradientes
<ol><li>Preparar as seguintes soluções de ações que podem ser armazenadas a 6 meses a 4 ° C.<ol>
<li>Prepare 1 L de buffers de Tricine (1 M, pH 8.4) e Tricine (1 M, pH 7,6). Ajuste o pH pela adição de KOH Pelotas.</li>
		<li>Prepare 1 L de ácido etilenodiaminotetracético (pH de EDTA, 0,5 M, 8) e 3-(N-morpholino) tampão de ácido sulfônico (MOPS) propano (1 M, pH 7,8). Ajuste o pH adicionando NaOH Pelotas.</li>
		<li>Prepare 50 mL de MgCl2 (1 M).</li>
		<li>Preparar 50 mL de protease inibidores soluções: fluoreto de phenylmethylsulfonyl (PMSF criada em isopropanol, 100 mM), hidrato de cloridrato de benzamidina (100mm) e ε-amino ácido caproico (50 mM). Nota: Enquanto PMSF e amino ácido caproico são estáveis em solução por meses a 4 ° C, Benzamidina solução deve ser armazenada a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar as seguintes soluções no dia anterior o experimento e armazenar todas as soluções a 4 ° C.<ol>
<li>Preparar 4 L de moagem média pH 8,4 contendo Tricine-KOH (20 mM, pH 8,4), sorbitol (0,4 M), EDTA (10 mM, pH 8) e NaHCO3 (10 mM). Ajuste o pH adicionando NaOH Pelotas. Adicionar albumina de soro bovino (BSA) em 0,1% (p/v) imediatamente antes da utilização e misture bem.</li>
		<li>Preparar 500 mL de lavar o pH do meio (2x) 7,6 contendo Tricine-KOH (20 mM, pH 7,6), sorbitol (0,8 M), MgCl2 (5 mM) e EDTA (2,5 mM). Ajuste o pH adicionando NaOH Pelotas. Dilua a solução deste tipo após a preparação da solução de gradiente de Percoll para obter o meio de lavagem (1x).</li>
		<li>Preparar 200 mL de solução de gradiente de Percoll para purificação de cloroplasto misturando Percoll com lavagem meio (2x) em um volume igual de obter uma solução final em 50% (v/v) Percoll / 0,4 M sorbitol.</li>
		<li>Prepare-se 50 mL de soluções de sacarose para fracionamento de cloroplasto através da mistura de diferentes concentrações de sacarose (0,3 M, 0,6 M e M 0,93), MgCl2 (4 mM) e MOPS (10 mM, pH 7,8).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a seguir gradientes e buffers antes de iniciar o experimento.<ol>
<li>Prepare-se seis tubos de Percoll (cada um contendo 30 mL de um 50% Percoll / 0,4 M sorbitol) por centrifugação a 38.700 x g, durante 55 min a 4 ° C. Tira o freio para evitar a mistura dos gradientes. Após a centrifugação, armazene os tubos contendo os gradientes pré-formados em uma sala fria até o uso.</li>
		<li>Prepare-se quatro tubos de gradientes de sacarose, com cada gradiente formado por três camadas de sacarose seguintes: 3 mL de 0,93 M, 2,5 mL de 0,6 M e 2 mL de 0,3 M de sacarose. Cuidadosamente sobreposição de cada camada, usando uma bomba peristáltica, começando com 0,93 M na parte inferior e acabamento com 0,3 M no topo.</li>
		<li>Prepare 50 mL do meio hipotónico para lise de cloroplastos contendo MOPS (10 mM, pH 7,8), MgCl2 (4 mM), PMSF (1 mM, criado em isopropanol), hidrato de cloridrato de benzamidina (1 mM) e ε-amino ácido caproico (0,5 mM). Armazene o buffer no gelo até o uso.</li>
		<li>Prepare 50 mL de membrana lavando o buffer que contém o MOPS (10 mM, pH 7,8), PMSF (1 mM), hidrato de cloridrato de benzamidina (1 mM) e ε-amino ácido caproico (0,5 mM). Armazene o buffer no gelo até o uso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. crescimento e colheita das folhas de Arabidopsis
<ol><li>Para o crescimento de plantas de Arabidopsis , prepare 4 bandejas de plástico grandes (para uma superfície total de 0,5 a 1 m2) de Arabidopsis plantas por sementeira 30 mg de sementes em cada panela. Cultivar plantas de Arabidopsis por 5 semanas no ciclo de luz de 12-h a 23 ° C (dia) / 18 ° C (noite) com uma intensidade de luz de 150 μM m-2 s-1.</li>
	<li>Incube as plantas em um quarto escuro e frio (4 ° C) durante a noite antes do experimento (para reduzir a quantidade de grânulos de amido nos cloroplastos).</li>
	<li>Pre-pesar num copo de 1 L e coloque-o no gelo antes de começar a colheita de material da folha.</li>
	<li>Colha folhas de Arabidopsis , evitando solo (adubo). Re-pesar o béquer e registar o peso do tecido. Nota: 400 a 500 g de material da folha são esperados de quatro panelas.</li>
	<li>Homogeneizar as folhas em uma sala fria com 2 L de tampão de moagem (adicionar BSA antes do uso) três vezes / 2 s de cada vez, em um liquidificador em alta velocidade.</li>
	<li>Filtre o homogeneizado em uma sala fria, usando uma camada de nylon blutex e 4 camadas de musselina. Esprema suavemente as folhas homogenate dentro a blutex de musselina (nylon) para extrair todo o líquido.</li>
	<li>Recupere o tecido restante no copo liquidificador para uma segunda extração. Repita as etapas de 2.5 e 2.6 usando 2 L de moagem médio e novo 4-5 camadas de musselina (em uma sala fria).</li>
</ol>3. purificação dos cloroplastos brutos usando centrifugação diferencial
<ol><li>Igualmente, distribuir o extrato bruto de celular em seis garrafas de 500 mL e coloque as garrafas no gelo antes de centrifugação. Centrífuga para 2 min, assim como a velocidade máxima (2.070 x g) for atingida (máxima aceleração e freio, no 4 ° C).</li>
	<li>Delicadamente, desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Aspire o sobrenadante restante usando uma bomba de água e manter os pellets contendo cloroplastos brutos concentrados no gelo.</li>
	<li>Resuspenda suavemente pelotas adicionando um volume mínimo de meio de lavagem (1x) (volume final de suspensões do cloroplasto combinada = 36 mL) usando um pincel ou uma espátula de plástico curvada. Use uma pipeta de 10 mL, adicionar 3 mL de meio em cada frasco de lavagem. Nota: Não use pipeta com pontas muito finas para evitar a ruptura dos cloroplastos. Alternativamente, corte a ponta azul de uma pipeta com uma lâmina de barbear para gerar um furo maior.</li>
	<li>Colete os cloroplastos ressuspensão em um tubo usando uma pipeta de 10 mL. Misture suavemente por inversão do tubo para obter uma suspensão homogênea antes do carregamento de Percoll.</li>
</ol>4. purificação dos cloroplastos intactos em gradiente de Percoll contínua
<ol><li>Lentamente carrega 6 mL de suspensão de cloroplasto em cima de cada um dos seis Percoll gradientes usando uma pipeta de 10 mL para evitar a ruptura dos cloroplastos.</li>
	<li>Centrifugue os gradientes por 10 min a 13.300 x g, 4 ° C, utilizando um rotor balançando-balde. Nota: A aceleração deve ser lenta, e deve ser desligado o freio (freio fora ou desaceleração lenta) para evitar a mistura da de Percoll.</li>
	<li>Aspire a fase superior que contém quebrados cloroplastos e mitocôndrias intactas, usando uma bomba de água e então recuperar intactos cloroplastos presentes na parte inferior com uma pipeta de 10 mL de fase (a banda larga de verde-escuro). Tenha cuidado para não aspirar núcleos e fragmentos de células (encontrado na parte inferior do tubo) com os cloroplastos intactos (Figura 2A).</li>
	<li>Dilua 3-4-fold a suspensão de cloroplastos intactos com tampão de lavagem (1x). Centrífuga para 2 min, logo que a velocidade máxima (2.070 x g, 4 ° C) é atingida (máxima aceleração e freio na).</li>
	<li>Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante.</li>
	<li>Completamente, aspirar o sobrenadante restante com uma bomba de água e manter o sedimento de concentrado cloroplastos intactos no gelo.</li>
	<li>Antes do lysis do cloroplasto, manter uma alíquota da fração intacta do cloroplasto em cerca de 1 mL de meio (1x) para análises mais adicionais usando a eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE) e mancha ocidental de lavagem. Manter uma pequena alíquota desses cloroplastos intactos para determinação da concentração da proteína. Armazene a fração de cloroplasto intacta em nitrogênio líquido para novas experiências.</li>
</ol>5. lise dos cloroplastos intactos usando um Buffer hipotônica e purificação de sub compartimentos cloroplasto em gradientes de sacarose descontínuos
<ol><li>Lise os cloroplastos intactos purificados por resuspending a pelota em meio hipotônica que contém inibidores de protease (o volume final não deve exceder 12 mL). Nota: Desta etapa, o uso da pipeta com dicas bem (dicas azuis) é possível desde que a integridade dos cloroplastos é não mais essencial (pipetagem cloroplastos acima e para baixo enquanto pelota não é inteiramente resuspended). Arabidopsis cloroplastos são muito frágeis (quando comparado com cloroplastos de ervilha, por exemplo) e sua lise é quase imediata após incubação em meio hipotônica.</li>
	<li>Carrega lentamente 3 mL de cloroplastos lisados no topo de cada gradientes de sacarose pré-formadas utilizando uma bomba peristáltica.</li>
	<li>Se os gradientes para 1 h a (70.000 x g, 4 ° C). Pares de equilíbrio de tubos usando hipotônica buffer médio antes da centrifugação.</li>
	<li>Cuidadosamente, recuperar as proteínas solúveis do estroma pipetando a fase superior do gradiente (3 mL de cada gradiente) (Figura 2B). Tome uma alíquota para determinação da concentração de proteína7. Armazene o estroma em nitrogênio líquido para novas experiências.</li>
	<li>Aspire a fase superior restante de cada gradiente até a faixa amarela, usando uma bomba de água.</li>
	<li>Recupere a faixa amarela (o envelope) com uma pipeta (aproximadamente 1 mL de cada gradiente). Agrupe todos os envelopes em um tubo.</li>
	<li>A fase restante de cada gradiente até remova o sedimento de tilacoides usando uma bomba de água.</li>
</ol>6. lavagem e concentração dos tilacoides e sistemas de membrana do Envelope
<ol><li>Resuspenda as pelotas de tilacoides (Pelotas verdes) em um volume mínimo (2 mL) da membrana lavando buffer (1x) (com inibidores de protease).</li>
	<li>Diluir os envelope e tilacoides suspensões 3-4-fold no meio de lavagem de membrana (ajuste o volume para 10ml) e se por 1h a (110.000 x g, 4 ° C). Pares de tubos usando membrana lavando a reserva antes da centrifugação de equilíbrio.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente com os sobrenadantes usando uma bomba de água.</li>
	<li>Adicione cerca de 100 µ l de buffer (com inibidores de protease) para a pelota de envelope de lavagem de membrana. Tome uma alíquota para determinação da concentração de proteína7. Armazene a preparação de membrana do envelope purificada em nitrogênio líquido.</li>
	<li>Resuspenda o pellet contém em 3 mL de membrana lavando buffer (com inibidores de protease). Tome uma alíquota para determinação da concentração de proteína7. Armazenar a fração de membrana tilacoides em nitrogênio líquido.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O presente artigo visa detalhar o passo a passo protocolo usado para purificar cloroplastos (e seus compartimentos sub) de Arabidopsis thaliana. Desde a disponibilidade de sua sequência completa do genoma, há quase duas décadas e de grandes coleções de mutantes de inserção disponibilizados para a Comunidade, Arabidopsis é agora amplamente aceito como uma planta de modelo. No entanto, enquanto esta planta foi perfeitamente adaptada para abordagens genéticas, os cientistas planta precisavam adaptar ferramentas bioquímicas e fisiológicas que este modelo emergente. Protocolos que permite para purificar fotossinteticamente ativos cloroplastos das folhas de modelos bioquímicos bem estabelecidas como espinafre12 ou ervilha13 assim, tinham que ser adaptado. O primeiro método descrevendo a purificação de Arabidopsis cloroplastos foi publicado em 199814, pouco antes do lançamento da sequência do genoma de Arabidopsis . Vários anos mais tarde, simples métodos para isolar Arabidopsis cloroplastos compatíveis com estudos com o objetivo de analisar em vitro importação de proteínas em organelas purificadas foram feitos disponível15,16. No entanto, esses métodos não podem para combinar o alto nível de pureza e preservação da atividade fotossintética de cloroplastos purificadas. Mais recentemente17, um método rápido foi estabelecido, que se baseia na utilização de Percoll e permite manter quase 90% da taxa de fotossíntese medida nas folhas inicial de Arabidopsis.
O protocolo descrito aqui permite purificar Arabidopsis cloroplastos em um excelente nível de pureza. Com efeito, deteção imunológica de contaminantes de outros compartimentos celulares demonstrou que as organelas purificadas são desprovidas de mitocondrial e marcadores de membrana plasmática9,10. Este protocolo foi também eficiente para purificar cloroplastos de várias Arabidopsis ecotipos18, como Columbia (Col) ou Wassilewskija (WS), ou seja, os ecotipos que foram utilizados para genoma ou expressa sequência etiquetas (ESTs) sequenciamento projetos, mas também para gerar mutantes de inserção de T-DNA em Arabidopsis. Em outras palavras, quando estudos de proteômica tem que ser realizada, o presente protocolo é compatível com esses dois ecótipos de referência de Arabidopsis. Finalmente, o rendimento dos cloroplastos utilizando o presente protocolo é semelhante ao obtido quando a partir de folhas de espinafre ou ervilha (ou seja, 3%, medido a partir do conteúdo de clorofila no cloroplasto Percoll-purificado quando comparado com o total quantidade de clorofila presente na partida deixa). Em termos de proteínas, o rendimento está perto de 50 mg de proteínas cloroplasto, quando organelas são purificadas de 500 g de folhas de Arabidopsis 5 semanas de idade.
Para alcançar tal um bom rendimento (e integridade do cloroplasto), uma porém deve prestar especial atenção à várias etapas ao usar o presente protocolo. O cloroplasto em Arabidopsis é uma estrutura extremamente frágil (isto não é o caso dos cloroplastos de ervilha, por exemplo). Atenção específica, portanto, é necessário para evitar a ruptura em grande escala das organelas durante a purificação. O número e tamanho dos grânulos de amido presentes nos cloroplastos são críticos para a preparação dos cloroplastos intactos. Na verdade, cloroplastos contendo grãos de amido grandes geralmente será quebrados durante etapas de centrifugações diferencial inicial, com o objetivo de concentrar o cloroplasto bruto fracções12. Portanto, as plantas devem ser mantidas durante a noite em um quarto escuro e frio (4 ° C) antes do experimento, para reduzir a quantidade de amido.
Novos usuários do presente protocolo podem ser tentados a começar de maiores quantidades de material da folha (enormes rosetas de velho Arabidopsis plantas com folhas maiores) tentando melhorar a recuperação dos cloroplastos purificadas. No entanto, em nossas mãos, a partir de folhas jovens (5 semanas de idade) é o melhor compromisso para combinar o rendimento, pureza e integridade das organelas purificadas. Na verdade, folhas velhas também altamente ricos em compostos fenólicos que foram mostrados para ter um impacto negativo no cloroplasto integridade19.
Finalmente, a etapa de extração inicial (moagem do tecido) é outro passo fundamental. O processo de misturando deve ser limitado a alguns segundos. Como dito acima, novos usuários poderiam ser tentados usar mais tempo de mistura, esperando assim fortemente melhorar o rendimento de organelas purificadas. No entanto, se mistura mais eficazmente libera mais material das folhas, parece que a proporção de cloroplastos quebrados aumenta rapidamente no extrato bruto de célula. Devido a esta relação elevada da quebrada de cloroplastos intactos no meio, mais etapas de purificação (separação de Percoll) são fortemente afetadas e o rendimento da purificação é inesperadamente inferior.
Disponibilidade de protocolos específicos para purificar organelas permitiram uma série de alto rendimento baseada em proteômica experiências conduzidas em amostras de cloroplasto. Estes dados foram disponibilizados em várias bases de dados públicas6, proporcionando uma exata localização subcellular (e subplastidial) para muitas proteínas cloroplasto para biólogos no campo. Isso era especialmente verdadeiro para as proteínas do envelope, cuja identidade e localização principalmente permaneceu desconhecida antes destas análises, como membranas de envelope representam um componente menor cloroplasto (1-2% das proteínas cloroplasto) enquanto estiver jogando um papel chave no cloroplasto metabolismo e biogênese5,20. Usando o protocolo descrito aqui, recentemente foram analisados a composição dos três compartimentos principais cloroplasto de Arabidopsis (i.e., o estroma, o contém e o sistema de membrana do envelope)9. Baseado em uma abordagem proteômica semi-quantitativa (contando espectral), fomos capazes de avaliar o particionamento de centenas de proteínas nestes três compartimentos de cloroplasto.
Enquanto o presente protocolo permite purificar os três principais compartimentos do cloroplasto de Arabidopsis, é também possível distinguir compartimentos sub adicionais no cloroplasto. Com efeito, o sistema de membrana do envelope é feito do interior e as membranas do envelope exterior (Figura 1). No entanto, o melhor de nosso conhecimento, um método para purificar as membranas interna e externa do envelope de Arabidopsis cloroplastos permanece a ser estabelecida. As membranas interna e externa do envelope podem ser purificadas de cloroplastos de22 21 ou ervilha espinafre. A principal limitação de Arabidopsis resulta principalmente dos montantes das limitantes de material começar. A partir de 500 g de folhas de Arabidopsis (que já requer 1 m2 de superfície em uma câmara de crescimento) permite purificar apenas 100 µ g de proteínas do envelope. Por outro lado, é fácil começar com 5-10 kg de espinafre sai do mercado, para purificar a grande quantidade de cloroplastos8 e para finalizar com um rendimento de 3 a 10 mg de proteínas do envelope deste material.
O mesmo é verdadeiro para compartimentos sub tilacoides. Na verdade, contém é feitos de luz vesículas de membrana (lamelas) e estruturas densas (grana) (Figura 1). Protocolos específicos estão disponíveis para distinguir esses dois compartimentos em Arabidopsis23,24. Novamente, com base numa análise proteômica quantitativa, nós recentemente inventariado as proteínas presentes nestes dois compartimentos sub24. Essas abordagens, juntamente com uma investigação aprofundada da literatura, permitiu validar, ou propor hipóteses para, o local de subplastidial de centenas de proteínas de tilacoides. No entanto, é importante notar que microdomains membrana adicionais estão presentes nas margens curvas de contém. Estes compartimentos sub lipoproteína, ou plastoglobules, são permanentemente acoplados nas membranas tilacoides e contêm um conjunto específico de proteínas25. Usando o presente protocolo, não é assim possível distinguir estas proteínas específicas de outros componentes de tilacoides.
Alguns componentes genuínos de envelope, estroma ou tilacoides (conhecidos) são ainda falta nas listas das proteínas detectadas. Juntamente com alvo Análises bioquímicas e imunológicas, a melhoria contínua do MS sensibilidade será de grande ajuda para revisitar o conteúdo do cloroplasto em direção um repertório completo da composição de seus vários compartimentos sub.

Cloroplastos são principais componentes das células vegetais. Eles derivam de um ancestral de cianobactérias que tem sofrido uma endossimbiose e eventualmente evoluiu como uma organela durante a evolução de1,2. Tais organelas contêm três compartimentos principais (Figura 1). O sistema de envelope é feito de um interior e um exterior membranas que cercam a organela. Este sistema de membrana dupla contém várias enzimas envolvidas no metabolismo de lipídios e pigmentos e na maior parte é dedicado ao controle da comunicação entre os plastídeos e citoplasma. Ele contém vários sistemas de transporte que permitem a importação de proteínas nucleares codificado e a troca de íons e metabólitos entre o citosol e o cloroplasto, portanto, regular as funções metabólicas essenciais da planta célula3,4 . O estroma, a fase solúvel do cloroplasto, contém enzimas do ciclo de Calvin (assimilação de CO2 ), a síntese de vários metabólitos, incluindo aminoácidos e vitaminas e os mecanismos de transcrição e tradução do plastídeo. A membrana tilacoides é uma rede de membrana interna amplamente organizada onde ocorre a fase luminosa da fotossíntese. Desse modo, os cloroplastos são o lugar onde vias metabólicas essenciais ocorrem5.
A fim de decifrar os novos mecanismos reguladores que controlam a dinâmica do cloroplasto e fisiologia, definindo a localização sub-plastidial das proteínas cloroplasto, portanto, é fundamental para apoiar estudos direcionados, com o objetivo de entender melhor as funções de proteínas em organismos de modelo6. Para obter acesso para a localização de subplastidial genuíno destas proteínas, assim, é essencial para iniciar a partir de frações de subplastidial altamente puro (membranas de envelope, estroma e contém). Neste contexto, o objectivo do presente protocolo é para purificar os cloroplastos intactos de Arabidopsis folhas usando diferenciais centrifugações e contínua de Percoll e fractionate-los usando gradientes descontínuos de sacarose, em três compartimentos de sub (ou seja, envelope, estroma e contém). O método descrito aqui também fornece instruções para avaliar a pureza das frações de sub-organellar purificadas usando marcadores associados a vários compartimentos sub do cloroplasto. Este protocolo é valioso para a localização de subplastidial de proteínas usando immunoblotting e para posterior análise de frações purificadas utilizando espectrometria de massa (MS)-com base em estudos de proteômica.

<table><tbody><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Roth</td><td>6977.2</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)</td> <td>Promega</td><td>H5032</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO 3 </td> <td>Roth</td><td>8551.1</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td> <td>Roth</td><td>8076.5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>2189.1</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>Sigma</td><td>B6506</td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-aminoácido capróico</td><td>Fluka</td><td>21530</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morfolino) ácido propano sulfônico (MOPS)</td><td>Roth</td><td>6979.3</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Roth</td><td>9286.2</td><td></td></tr><tr><td>Estoque de acrilamida: 30% (p / v) de acrilamida, 0,8% (p / v) de bisacrilamida</td><td>Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio (SDS)</td> <td>Roth</td><td>1057.1</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilenodiamina (TEMED)</td> <td>Sigma</td><td>T-8133</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amônio (APS)</td> <td>Roth</td><td>9592.1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>USB</td><td>US12370</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>Meio de coloração em gel</td><td>Clini-sciences</td><td>GEN-QC-STAIN</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>CARLO ERBA</td><td>528151</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó sem gordura</td><td>R&eacute; gilait</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>H / 1150 / PB15</td><td></td></tr><tr><td>KOH pellets</td><td>Sigma</td><td>1.05012</td><td></td></tr><tr><td>NaOH pellets</td><td>CARLO ERBA</td><td>480507</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo</td><td></td> anti-HMA1 <td>Seigneurin-Berny et al, 2006</td><td>Usado em uma diluição de 1: 1000</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-KARI</td><td></td><td>Ferro et al, 2010</td><td>Usado em uma diluição de 1:1000</td></tr><tr>Anticorpo <td></td><td>anti-LHCP</td><td>Vallon et al, 1991</td><td>Usado em uma diluição de 1:25.000</td></tr><tr><td>Ácido P-cumárico</td><td>Sigma</td><td>C-9008</td><td></td></tr><tr><td>Luminol (3-aminofhidrazina)</td><td>Fluka</td><td>9253</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO).</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Caixas de plástico grandes (30 cm e 45 cm) Sementes</td><td></td><td></td> de Puteaux 162135<td></td></tr><tr><td>A. thaliana</td><td>Cerca de 30 mg de sementes para uma caixa inteira</td>Composto "Floragard"Puteaux 16311770 Salas de crescimento <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Ciclo de luz de 12 horas, definido em 23&deg; C (dia) / 18 graus; C (noite) com intensidade de luz de 150 &mu; mol/m2/s.</td></tr><tr><td>Musselina ou gaze</td><td>Raffin</td><td>70116</td><td>80-cm-large</td></tr><tr><td>Nylon blutex 50 &mu; m abertura</td><td>Tripette et Renaud, Sailly Saillisel</td><td></td><td>50 &mu; m abertura</td></tr><tr><td>Liquidificador motorizado, três velocidades, capacidade de 1 galão (4 L)</td><td>Waring Blender</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotores de ângulo fixo JLA-10.500 (garrafas plásticas de 6 e 500 mL)</td> <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor Beckman JA-20</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JA-20 (tubos de polipropileno de 6 e vezes; 50 mL)</td> <td>Instrumentos</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SorvallRotor de caçamba oscilante JS-13.1 (tubos de policarbonato de 6 e 50 mL)</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti (tubos ultraclear de 6 e 13,2 mL)</td>Tubos de rotor <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti (tubos ultraclear de 13,2 mL)</td><td>Ultracentrífuga Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Beckman L7)</td><td>Centrífuga Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Beckman JSE-06D18)</td><td>Microcentrífuga Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf 5415D ou equivalente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de água conectada a uma pipeta Pasteur por meio de um tubo de plástico.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranas de nitrocelulose</td><td>BA85, Schleicher e Schuell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>3MM, Whatman, Maidstone</td><td></td><td></td></tr> Bomba <tr><td>peristáltica</td><td></td> de nitrogênio líquido Aparelho de eletroforese em gel Gilson <td></td><td></td></tr> com <tr><td></td> os vários acessórios necessários para a separação de proteínas por eletroforese (pentes, placas e <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> aparelho de fundição).</td><td>Bio-Rad Protean 3 ou equivalente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de transferência de proteínas para membranas de nitrocelulose</td><td>Bio-Rad Protean 3 ou equivalente</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparação de cloroplasto sub compartimentos de arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo immunoblotting ou proteomics

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Cloroplastos são principais componentes das células vegetais. Tais plastídeos cumprem muitas funções cruciais, tais como a assimilação de carbono, enxofre e nitrogênio, bem como a síntese de metabólitos essenciais. Estas organelas consistem dos seguintes três compartimentos sub chaves. O envelope, caracterizado por duas membranas, rodeia a organela e controla a comunicação do plastídeo com outros compartimentos da célula. O estroma é a fase solúvel do cloroplasto e o site principal, onde o dióxido de carbono é convertido em hidratos de carbono. A membrana tilacoides é a rede de membrana interna consistindo de grana (ZCE compactado plana) e lamelas (estruturas menos densas), onde a fotossíntese oxygenic toma lugar. O presente protocolo descreve passo a passo os procedimentos necessários para a purificação, usando centrifugações diferenciais e Percoll, dos cloroplastos intactos de Arabidopsise seu fracionamento, usando gradientes de sacarose, em três compartimentos de sub (ou seja, envelope, estroma e contém). Este protocolo também fornece instruções sobre como avaliar a pureza destas frações usando marcadores associados a vários compartimentos sub do cloroplasto. O método descrito aqui é valioso para a localização de subplastidial de proteínas usando immunoblotting, mas também para subcellular e subplastidial proteomics e outros estudos.

Sucessivas etapas do processo, resultando em cloroplasto purificado e seus compartimentos sub for retomadas na Figura 2. O gradiente de Percoll (Figura 2A) permite distinguir cloroplastos intactos de quebrado cloroplasto e mitocôndria (topo do gradiente) ou núcleos e detritos celulares (parte inferior do gradiente). Após a ruptura das organelas Percoll-purificado graças a um choque de osmótica, as frações resultantes são separadas em um gradiente de sacarose (Figura 2B). O estroma (parte solúvel do cloroplasto) está flutuando na superfície do gradiente de sacarose. As vesículas de membrana do envelope de luz são recuperadas como uma banda amarela discreta na interface 0.6/0,93 M de sacarose. As mais pesadas vesículas de membranas tilacoides estão concentradas na parte inferior do tubo. Após a recuperação, a lavagem e a concentração das frações duas membranas, as proteínas são quantificadas e a composição de todos os quatro fracções é analisada em um SDS-PAGE (Figura 2). As pistas são carregadas em uma base de proteína igual (20 µ g de cada fração purificada). Sabendo-se que os cloroplastos contêm apenas 1% das proteínas do envelope e 50% de proteínas do estroma ou do contém, isto tende a superestimar a contaminação cruzada de preparações purificadas de envelope com outros compartimentos sub cloroplasto. No entanto, este método permite para detectar quantidades minuciosas de proteínas Cruz-contaminando a fração de envelope. Marcadores de cada compartimento (i.e., abundantes proteínas) são muito úteis para avaliar a contaminação cruzada das frações. Com efeito, as frações de membrana tilacoides e envelope deverão conter quantidades muito baixas de grande subunidade de RuBisCO (RBCL), a proteína mais abundante do estroma (50 kDa). Cloroplastos quebrados facilmente distingue cloroplasto intacto devido à perda desta proteína do estroma8. A luz da colheita proteínas complexas (LHCP) são componentes de tilacoides abundante de 25-kDa que devem mal contaminar (menos de 3%) envelope membranas9. Finalmente, o translocator triose-fosfato-fosfato (TPT) é uma proteína de 30-kDa que só é visível na fração purificada envelope devido à sua forte enriquecimento (ou seja, 50 a 100 x) na fração de envelope, quando comparado ao cloroplasto todo extrai. Usando o método descrito aqui, cloroplasto sub compartimentos são geralmente mal Cruz contaminada como confirmado usando análises de western-blot (Figura 2D) contando com anticorpos dirigidos contra marcadores conhecidos de todos os três compartimentos sub: o reductoisomerase de ketol-ácido solúvel (KARI) de estroma, o envelope de cloroplasto cobre ATPase (HMA1) e a luz da colheita proteínas complexas (LHCP) partir das membranas dos tilacoides. Contaminação cruzada dos três compartimentos sub pode ser quantificada usando ambos immunoblotting e massa espectrometria análises9. Enquanto o estroma geralmente não está contaminado por fracções de envelope ou tilacoides, as frações purificadas envelope contém 3% de proteínas de tilacoides e até 10% de proteínas do estroma. Proteínas do estroma mal contaminam as membranas tilacoides (menos de 1%), mas contém contêm até 3% de proteínas de membrana do envelope. Mais do que ter um papel crucial em identificar a localização de subplastidial genuíno de proteínas cloroplasto, o presente método, portanto, também limita a conclusões errôneas sobre a localização de subplastidial das proteínas resultantes da cruzam contaminações.
<img alt="Diagrama de estrutura do cloroplasto; membranas do envelope, membranas tilacóides, grana, detalhes do estroma." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: esquema representativa dos compartimentos sub cloroplasto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Experimento de isolamento de cloroplastos; Resultados de SDS-PAGE e Western blot analisando frações de cloroplastos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58581/58581fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: purificação dos cloroplastos intactos e suas três principais compartimentos sub usando gradientes de Percoll e sacarose. R. gradiente de Percoll permitindo a separação dos cloroplastos intactos e quebrados. B. gradiente de sacarose, permitindo a separação das frações de estroma, envelope e tilacoides. C. representante de SDS-PAGE das proteínas dos cloroplastos intactos e seus três compartimentos sub principais permitindo Visualizar marcadores abundantes de cada compartimento secundário. Cada pista contém 10 µ g de proteínas. Marcadores de peso molecular: RBCL, grande subunidade da RuBisCO (marcador para o estroma); TPT, translocator fosfato/triose-fosfato (marcador para o envelope); LHCP, luz colheita proteínas complexas (marcador para os tilacoides). D. experimentos de Western-blot, permitindo detectar marcadores específicos (usando anticorpos específicos) de cada compartimento secundário: o cloroplasto envelope cobre ATPase HMA110, a luz colheita proteínas complexas LHCP partir os tilacoides membranas de11e o reductoisomerase de ketol-ácido KARI o estroma9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58581/58581fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, descrevemos um método para purificar cloroplastos intactos de Arabidopsis folhas e seus três principais compartimentos sub (envelope, estroma e contém), usando uma combinação de centrifugações diferenciais, contínuo de Percoll, e gradientes de sacarose descontínuo. O método é valioso para subplastidial e Localização subcellular das proteínas por immunoblotting e proteômica.

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

A principal vantagem dessa técnica é que ela permite distinguir proteínas de atividades semelhantes que têm diferentes funções, dependendo da localização em membranas envelope, estroma ou thylakoid. Geralmente, indivíduos novos neste método lutarão, porque usarão plantas muito velhas, misturem a folha por muito tempo, ou não terão cuidado o suficiente ao suspender as pelotas de cloroplasto intacto, mas frágil. A demonstração visual deste método é fundamental, pois o carregamento ou a recuperação de fração de percoll ou em passos gradientes de sacarose são difíceis de aprender.Devido ao risco de mistura dos gradientes e, portanto, de contaminar cruzadamente as várias sub frações de cloroplasto. Demonstrar o procedimento será de Imen Bouchnak, um estudante de doutorado do nosso laboratório e Lucas Moyet, um engenheiro interno. Para começar, plante arabidopsis por cinco semanas com um ciclo de luz de 12 horas a 23 graus Celsius durante o dia e 18 graus Celsius durante a noite, com uma intensidade leve de 150 micromoler por metro quadrado por segundo.No dia seguinte, pré-pesar um béquer de cinco litros e, em seguida, colocá-lo no gelo. Colher as folhas arabidopsis, certificando-se de evitar colher qualquer solo. Repesar o béquer e registrar o peso do tecido.Transfira as folhas colhidas para uma sala fria. Coloque as folhas em um liquidificador contendo dois litros de tampão de moagem e homogeneize-as misturando-as em alta velocidade três vezes durante uma duração de dois segundos cada vez. Coloque quatro camadas de musselina e uma camada de tex azul de nylon em um coador e isso para filtrar o homogeneizar.Aperte suavemente as folhas misturadas dentro da musselina e tex azul para extrair todo o líquido. Recupere o tecido restante no copo do liquidificador e repita o processo de homogeneização usando um tampão de moagem fresco. Use de quatro a cinco camadas de nova musselina para filtrar este novo homogeneizar em um novo béquer como descrito anteriormente.Distribua o extrato de célula bruta igualmente em seis garrafas de 500 mililitros. Coloque as garrafas no gelo. Centrifugar as garrafas geladas a 2070 G e quatro graus Celsius por dois minutos.Depois disso, descarte suavemente o supernaspe. Use uma bomba de água para aspirar qualquer supernascedor restante e mantenha as pelotas, que contêm cloroplasto bruto concentrado, no gelo. Usando uma pipeta de 10 mililitros, adicione três mililitros de meio de lavagem a cada garrafa, certificando-se de não usar pontas finas de pipeta para evitar quebrar os cloroplastos.Em seguida, use uma escova de tinta ou espátula de plástico curva para suspender suavemente as pelotas. Usando uma pipeta de 10 mililitros, colete os cloroplastos re-suspensos em um único tubo. Inverter suavemente o tubo para obter uma suspensão homogênea de cloroplasto.Para começar, use uma pipeta de 10 mililitros para carregar lentamente seis mililitros da suspensão do cloroplasto em cima de cada um dos seis gradientes percoll preparados. Usando um rotor de balde balançando, centrifugar os gradientes a 13,300 G e quatro graus Celsius por 10 minutos. Use uma bomba de água para aspirar a fase superior, que contém cloroplastos quebrados e mitocôndrias intactas.Em seguida, use uma pipeta de 10 mililitros para recuperar cloroplastos intactos presentes na fase inferior, tomando cuidado para não aspirar os núcleos e detritos celulares encontrados na parte inferior do tubo, juntamente com os cloroplastos intactos. Diluir a suspensão de cloroplasto intacto de três a quatro vezes com meio de lavagem. Mantenha aproximadamente 10 mililitros de uma alíquota de fração de cloroplasto intacto para análise suplementar por SDS-Page e mancha ocidental.Centrífuga a 2070 G e 4 graus Celsius por dois minutos. Depois disso, descarte suavemente o supernaspe. Use uma bomba de água para aspirar qualquer supernascedor restante e mantenha a pelota, que contém cloroplastos brutos concentrados, no gelo.Para lise os cloroplastos intactos purificados, suspenda a pelota em meio hipotônico que contém inibidores de protease. Transfira os cloroplastos re-suspensos para um tubo falcão de 10 mililitros. Prepare o gradiente de sacarose conforme descrito no protocolo de texto.Usando uma bomba peristáltica, carregue lentamente três mililitros dos cloroplastos líseos em cima de cada um dos gradientes de sacarose pré-formados. Use tampão médio hipotônico para equilibrar pares de tubos e, em seguida, ultracentrífugue o gradiente a 70.000 G e quatro graus Celsius por uma hora. Tome uma alíquota das proteínas estromas solúveis para serem usadas na determinação da concentração proteica.Em seguida, use uma bomba de água para aspirar a fase superior restante do gradiente até a faixa amarela. Usando uma pipeta, recupere a faixa amarela, que é o envelope. Puxe os envelopes em um tubo.Em seguida, remova a fase restante do gradiente até a pelota de tirokoide. Suspenda-as as cápsulas de tiroakoide no tampão de lavagem de membrana com inibidores de protease. Diluir a suspensão de tirocoida e envolvê-la de três a quatro vezes com meio de lavagem, ajustando o volume final para 10 mililitros.Equilibre pares de tubos com tampão de lavagem de membrana e ultra-centrífugas a 110.000 G e quatro graus Celsius por uma hora. Depois disso, use uma bomba d'água para aspirar cuidadosamente o supernaspe. Adicione aproximadamente 100 microliters de tampão de lavagem de membrana à pelota do envelope.Em seguida, aspire o supernatante do tubo de tirokoide. Suspenda as cápsulas de tirokoide em três mililitros de tampão de lavagem de membrana. Armazene os três subpartidamentos purificados em nitrogênio líquido para uso em outros experimentos.Depois que as frações de membrana são recuperadas, lavadas e concentradas, a SDS-Page é usada para quantificar as proteínas e analisar a composição de todas as quatro frações. A proteína mais abundante do estroma é a RBCL, e resultados representativos mostram o resultado esperado, que muito pouco da grande subunidade desta proteína está contida nas frações de timilakoide e membrana envelope. As proteínas complexas de colheita leve são abundantes componentes de tirocoide que mal devem contaminar as membranas do envelope.Por fim, o translocador de fosfato triose fosfato só é visível na fração do envelope purificado, devido ao seu forte enriquecimento na fração do envelope quando comparado com os extratos inteiros de cloroplasto. A contaminação cruzada dos três subcompartidamentos, a reductoisomerase solúvel de cetol-ácido do estroma, o envelope de cloroplasto atpase de cobre e as proteínas complexas de colheita de luz das membranas thylakoidas podem ser quantificadas usando tanto a análise de imunobloquetação quanto a espectrometria de massa. Embora o estroma não seja geralmente contaminado por frações de envelope ou thylakoide, as frações purificadas do envelope contêm 3% de proteínas de timkoóide e até 10% de proteínas do estroma.Os tilakoides são mal contaminados por proteínas do estroma, mas contêm até 3% das proteínas de membrana envelope. Os cloroplastos desempenham muitas funções cruciais, como assimilação de carbono, enxofre e nitrogênio, bem como a síntese de metabólitos essenciais. A fim de decifrar novos mecanismos regulatórios que controlam a fisiologia do cloroplasto, definir a localização da surplastia das proteínas cloroplastas é fundamental para estudos super-direcionados.Cloroplastos contêm vários subcompartidários. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do cloroplasto, como onde a proteína de cloroplasto específico está localizada dentro da organela. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de conduzir todas as etapas de isolamento de cloroplasto a quatro graus para remitar a protea em frações purificadas.Após este procedimento, outros métodos como abordagens proteômicas lascare podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como a composição e dinâmica do proteome dos valores subpartidesplóides. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da fisiologia vegetal explorarem muitos aspectos diferentes da biogênese e função do cloroplasto utilizando a análise direcionada das proteínas candidatas identificadas dentro dos subcompartidamentos plastídeos. Não se esqueça que trabalhar com liquidificador de volume, nitrogênio líquido, em compostos específicos como inibidores de protease, requer cuidados especiais.Precauções como o uso de luvas, jaleco e óculos de segurança devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

preparation-chloroplast-sub-compartments-from-arabidopsis-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A base molecular do espaço-respostas específicas fitocromo está sendo investigado o uso de plantas transgênicas que apresentam tecidos e órgãos específicos deficiências fitocromo. O isolamento de células específicas exibindo esgotamento cromóforo fitocromo induzida por fluorescência-Activated Celular classificação seguido por análises de microarray está sendo utilizada para identificar genes envolvidos em respostas espaciais específicos fitocromo.

Investigando Tecido e órgãos específicos Responses Fitocromo usando FACS assistida Célula tipo Profiling expressão específica no Arabidopsis thaliana</em

Análise de célula específico<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

Aqui, descrevemos um método robusto para o fraccionamento das membranas plasmáticas de plantas solúveis em membranas resistentes a detergente e do detergente baseado numa mistura de não marcado e in vivo totalmente 15 n marcadas culturas de células de Arabidopsis thaliana. O procedimento é aplicado para estudos de proteômica comparativas para compreender os processos de sinalização.

Metabólica Labeling e Membrana Fracionamento para Comparative Analysis proteômica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Culturas suspensão de células

A formação de complexos de proteína in vivo, podem ser visualizados por fluorescência bimolecular complementação. Parceiros de interacção são fundidas com as peças complementares de marcas fluorescentes e transitoriamente expressa em folhas de tabaco, resultando num sinal fluorescente reconstituído na estreita proximidade das duas proteínas.

Interações proteína-proteína visualizado por Bimolecular Fluorescência de Complementação em tabaco Protoplastos e folhas

Aqui nós descrevemos um novo método para estudar importação proteína em cloroplastos isolados sob estresse. O método é simples e rápida, e pode ser aplicado para estudar as consequências das diferentes condições de estresse para a importação de proteína do cloroplasto, e os mecanismos de regulação correspondentes.

Análise de importação proteína em cloroplastos isolados de plantas estressadas

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

Temos desenvolvido um novo método para expressar co várias proteínas da fusão fluorescente quimérico em plantas para superar as dificuldades dos métodos convencionais. Ele tira vantagem do uso de um plasmídeo de expressão única que contém várias proteínas funcionalmente independentes expressando cassettes para alcançar expressão co de proteína.

Co de expressão de várias proteínas da fusão fluorescente quimérico de forma eficiente em plantas

Apresentamos os protocolos neste documento para isolamento de alto rendimento de fisiologicamente ativo contém e ensaios de transporte da proteína para a translocação de arginina gêmeo cloroplasto (cpTat), secretora (cpSec1) e percursos de partícula (cpSRP) de reconhecimento de sinal.

Isolamento de fisiologicamente ativo contém e a sua utilização em ensaios de transporte de energia-dependente da proteína

Aqui descrevemos um protocolo para expressar proteínas em protoplastas usando o método de transformação mediada por PEG. O método fornece fácil expressão de proteínas de interesse e investigação eficiente de localização da proteína e o processo de importação para as várias condições experimentais in vivo.

Estudando a importação de proteínas em cloroplastos usando protoplastas

Este protocolo descreve a seleção de marcadores plasmodésmicos ideais para análises baseadas em microscopia confocal de direcionamento de proteínas para plasmodesmos durante interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal.

Análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em Nicotiana benthamiana

Este protocolo descreve a preparação de amostras intactas da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis thaliana . O método requer apenas equipamentos de laboratório comuns, como agulha de injeção e pinça de precisão, e permite imagens fluorescentes de células vivas de alta resolução de células do endosperma em sementes em desenvolvimento e maduras.

Preparação de tecido intacto para análise microscópica da camada de células do endosperma em sementes de Arabidopsis em desenvolvimento e maduras

Aprenda a purificar cloroplastos intactos de Arabidopsis e separar seus subcompartimentos: envelope, estroma e tilacoides. Este método combina centrifugação diferencial e gradientes de Percoll e sacarose para estudos de localização proteica.

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação de cloroplasto sub compartimentos de Arabidopsis para a análise da localização da proteína pelo Immunoblotting ou Proteomics

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