Um método de Micro-CT-baseado para caracterizar as lesões e localização de eletrodos nos cérebros de animais pequenos
8 de novembro de 2018
Este artigo descreve um método simples para preparar pequenos cérebros de animais para a imagem latente de micro-CT, nas quais as lesões podem ser quantificadas e eletrodos localizados com elevada precisão no contexto do cérebro inteiro.
Este método pode ajudar a responder perguntas-chave no campo da neurociência, fornecendo um método mais simples, menos propenso a erros e mais quantitativo para verificar lesões e localizar locais de eletrodos. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a verificação de lesões e sítios eletrodos em todo o cérebro sem a necessidade de secção. O produto final é um volume 3D digital do cérebro e múltiplos cérebros podem ser processados em paralelo.
Embora este método seja demonstrado no rato, ele também pode ser aplicado a outros organismos, como ratos e tentilhões de zebra. Geralmente, indivíduos novos nesse método lutarão porque algumas etapas requerem cuidados particulares para garantir melhores resultados. Para começar, coloque um cérebro extraído em solução de profusão em um tubo cônico de 50 mililitros.
Armazene a amostra por dois a três dias com tremor suave a quatro graus Celsius. Certifique-se de que o ósmio está diluído em água e não em um tampão. Isso porque a água agirá como um detergente suave, permitindo que o ósmio penetrásse profundamente no tecido.
Prepare 50 mililitrois de 2%de tetroxida de 2%de ósseo em água duplamente destilada. Em seguida, coloque o cérebro em um novo tubo cônico de 50 mililitro e adicione a solução de tetroxida de ósmio. Feche o tubo e sele-o com filme de parafina para evitar vazamentos.
Armazene o tubo selado a quatro graus Celsius com agitação suave por duas semanas. Certifique-se de que o tubo está posicionado horizontalmente. O cérebro é muito espesso e uma longa maneira de viajar por difusão.
Colocar o tubo horizontalmente permitirá que o ósmio se aprofunde mais no tecido. Após a amostra incubar por duas semanas, lave-a com água duplamente destilada cinco vezes para remover todo o tetroxida de ósmio não vinculado da amostra. Em seguida, lave a amostra com água duplamente destilada por 30 minutos a quatro graus Celsius.
Substitua a água duplamente destilada por quatro diluições de etanol para desidratar a amostra. Para iniciar o processo de infiltração da resina, mova a amostra através de três diluições de acetona e três diluições de resina acetona e, em seguida, mergulhe a amostra em 100% de resina à temperatura ambiente para continuar o processo de infiltração. Depois disso, transfira a amostra para um molde descartável.
Infundir a amostra com resina fresca de 100% por quatro horas à temperatura ambiente. Desgas a amostra em um forno a vácuo por 15 minutos a 45 graus Celsius. Em seguida, cure a amostra em um forno por 48 horas a 60 graus Celsius.
Finalmente, quando a amostra terminar de curar, retire o molde descartável e escaneie-o com a máquina Micro-CT. Na seção tradicional, a orientação do cérebro deve ser predeterminada. Usando este método Micro-CT, o volume digital do cérebro amostral pode ser manipulado em três dimensões e praticamente cortado em qualquer direção.
A microscopia eletrônica de varredura do cérebro de rato preparado confirma que o tecido não foi significativamente danificado para fins de micro-tomografia. Um cérebro de passarinho-zebra também foi preparado e escaneado de acordo com este protocolo para testar a utilidade deste método em outros cérebros de animais pequenos. Esta técnica pode ser usada para encontrar lesões superficiais no cérebro, bem como lesões profundas no cérebro.
Esta técnica também pode ser aplicada à localização de tetrodes únicos in situ, lesões eletrolíticas, rastros de eletrodos, matrizes de tetrode in situ e sondas de silício in situ. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de permitir que o cérebro incubasse por tempo suficiente e com agitação suficiente. Após este procedimento, outros métodos como optogenética e imagem de dois fótons podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre o papel que diferentes áreas cerebrais desempenham em diferentes comportamentos.
Essa técnica poderia permitir que pesquisadores do campo da neurociência explorassem melhor as relações estrutura-função entre o cérebro e o comportamento em ratos, ratos, pássaros-canção e outros animais pequenos. Não se esqueça que trabalhar com osmium pode ser extremamente perigoso e precauções, como usar luvas e trabalhar em um capô de vácuo deve ser sempre tomada durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para preparar cérebros de pequenos animais, especificamente cérebros de ratos, para imagens de micro-CT. A técnica visa quantificar lesões e localizar com precisão eletrodos sem a necessidade de seção, produzindo um volume digital 3D abrangente do cérebro.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de Imagem
- Análise de Lesões
Fundo
- As imagens de micro-CT permitem a análise não destrutiva das estruturas cerebrais.
- Métodos tradicionais de seção podem ser propensos a erros e limitam a flexibilidade de orientação.
- Este método melhora a capacidade de analisar lesões e colocação de eletrodos.
- Aplicáve a diferentes pequenos animais como camundongos e tentilhões zebra.
Propósito do Estudo
- Desenvolver um método de preparação simplificado e menos propenso a erros para imagens de micro-CT.
- Fornecer localização precisa de lesões e eletrodos.
- Facilitar a manipulação 3D de amostras cerebrais para análise aprimorada.
Métodos Utilizados
- A plataforma principal utilizada é a imagem de micro-CT de amostras cerebrais preparadas.
- O modelo biológico chave é o cérebro de rato, mas o método é adaptável a outros pequenos animais.
- O método envolve períodos específicos de incubação e o uso de tetroxido de ósmio para preparação de tecido.
- Passos críticos incluem a colocação horizontal do tubo e múltiplas etapas de lavagem para garantir a penetração do ósmio.
- A preparação final inclui a cura da resina e a varredura com uma máquina de Micro-CT.
Principais Resultados
- Este método permite a visualização de lesões cerebrais superficiais e profundas.
- Permite a identificação precisa de trilhas de eletrodos e lesões, mantendo a integridade do tecido.
- As amostras escaneadas mostram que o dano tecidual é mínimo, confirmando a aplicabilidade da técnica.
- O procedimento pode suportar experimentos adicionais como optogenética e imagem de dois fótons.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método eficaz para preparar cérebros de animais para análise detalhada usando micro-CT.
- A técnica permite que os pesquisadores explorem o comportamento dos neurônios e relações estruturais sem danificar as amostras.
- No geral, melhora as capacidades da pesquisa em neurociência na compreensão da mecânica cerebral.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Accurate lesion characterization and electrode localization are critical for validating mechanistic hypotheses in neuroscience-driven drug discovery. This micro-CT-based workflow enables high-resolution, quantitative mapping of brain interventions, reducing manual error and supporting reproducible, cross-study comparisons. The approach enhances predictive confidence at the target validation and preclinical model inflection points, directly impacting translational continuity and portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of lesion placement and electrode localization for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by providing 3D anatomical context for intervention sites.
- Facilitates quantitative comparison of experimental manipulations across studies and models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated brain models for downstream functional assays and behavioral studies.
- Standardizes lesion and electrode mapping, improving reproducibility and assay reliability.
- Generates digital volumes suitable for automated or manual segmentation and analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns anatomical intervention data with behavioral and functional outcomes in disease-relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting multi-modal data integration.
- Reduces biological ambiguity in preclinical models, informing risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This micro-CT method integrates at the interface of discovery biology and preclinical model validation, bridging anatomical verification with functional and behavioral readouts.
- Discovery Biology: Provides quantitative, 3D verification of experimental manipulations for hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, high-resolution anatomical data to support assay readiness and cross-study standardization.
- Analytics: Enables digital measurement and comparison of lesion volumes and electrode positions across conditions.
- Translational Research: Supports alignment of anatomical and functional data for disease-relevant model validation.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, digital workflow adaptable to multiple small animal models and experimental paradigms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation studies.
- Operational Value: Streamlines verification processes, enabling parallel sample processing and digital archiving.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by standardizing anatomical validation across programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, quantitative anatomical data for model selection and advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation, micro-CT imaging, and digital volume analysis.
- Demands access to micro-CT instrumentation and compatible analysis software (free or proprietary).
- Necessitates rigorous cross-team standardization of sample handling and imaging protocols.
- Adaptable to various small animal models with protocol adjustments for tissue size and composition.
- Safety precautions are essential due to hazardous reagents such as osmium tetroxide.
